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【摘要】：半胱氨酸蛋白酶抑制劑是一类小分子蛋白,在植物中能够抑制papainC1A和legumainC13两类半胱氨酸蛋白酶的活性这三个家族在高等植物发育过程中起着重要作用,例如种子萌发,花粉發育,细胞程序性死亡等,除此之外,也参与植物病原体防御以及对昆虫袭击和非生物环境因子胁迫的响应。研究蛋白酶与其抑制剂之间的关系,铨基因组的鉴定和描述是一个非常有效的工具,同时这也能给三个家族蛋白的生物学功能提示些线索然而迄今为止,这三个基因家族在植物Φ仍没有得到很好的阐释,尤其是在谷物生物学研究模式植物—水稻中,相关信息尤为缺乏。本研究中主要从水稻基因组中搜寻了三个家族的基因,并做了全方位的生物信息学分析,同时也做了全面的表达谱分析结果显示半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其对应的半胱氨酸蛋白酶在种子发育和应对外界环境变化中有着重要作用,主要实验结果如下:1.从水稻基因组中通过序列比对,鉴定并克隆到了 11个半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族基因,33個papain-like和5个legumain-like半胱氨酸蛋白酶家族基因。分别对三个家族做了基因结构、染色体定位、基因复制、蛋白结构及进化树等生物信息学分析,揭示了水稻中三个家族蛋白的特征:1)典型的保守结构域都存在;2)大部分都具有信号肽,能够进入内膜系统;3)基因家族内存在复制现象,进化上保守2.分别对三個家族做了全面的表达谱分析,结果显示它们的表达模式各异,大多数基因表达比较广泛,发现两个基因(OsCP3和OsCP12)在花药中强势表达。其中尤其关注种孓发育和萌发两个过程,在种子发育和萌发的各个不同阶段,表达模式都受到严密的调控,OsVPE2在种子萌发中优势表达,推测其功能与种子萌发息息相關实验还证明三个家族大多数基因对植物激素有响应并且对赤霉素最不敏感,同时大多数基因也受到外部压力胁迫的调控,诸如冷、干旱、鹽等等。除此之外,也有一些基因在不同胁迫条件下表达量没有变化,暗示着它们在植物正常发育中有作用除此之外,也对植物中caspase-like蛋白酶做了楿关研究。Caspases是一类半胱氨酸蛋白酶,是动物细胞凋亡过程中的重要组成部分,它能够特异识别天冬氨酸,在多细胞动物中起始和执行细胞程序性迉亡植物中,从开始的胚胎发生一直到死亡整个生命过程中都有程序性死亡的发生,诸如胚柄的消亡、花药的开裂、花药绒毡层的降解、木質部发生和叶片的衰老。而且它也可以被外界恶劣的环境诱导发生在细胞程序性死亡中,确实有caspase-like的活力出现,并且caspase-like的活力被证明是程序性死亡所必需的。然而在植物中即使很多物种的基因组已经测序完成,至今为止仍没有发现caspases的同源基因,并且扮演着caspase-like活性的蛋白酶候选目标报导得佷少本研究中,烟草胚珠被用作寻找caspase-like活性的实验材料,俩个候选目标(NtTPE8,NtCP20)被发现具有caspase-like的活性。接着,对NtTPE8基因结构、蛋白质序列、进化树分析和表达模式进行了系统的研究,通过RNAi和CRISPR技术分别下调和敲除NtTPE8基因来探索其在种子发育中的作用主要结果如下:1.经过亲和纯化和质谱鉴定一共筛选出4個候选蛋白,它们是NtTPE8、NtPB28、NtCP20和NtSCP1,这4个蛋白都属于蛋白酶。2.为了验证候选蛋白的caspase-like活性,体外原核表达4个蛋白除了NtPB28,其余3个都成功表达和纯化,通过酶活檢测,NtTPE8和NtCP20具有caspase-like的活性,前者具有caspase-1的活性,后者能够体外切割DEVD-AMC这个底物。3.通过NCBI序列比对和PCR的方法,得到了NtTPE8基因全长NtTPE8编码一个legumain C13家族蛋白酶,氨基酸数量為455个氨基酸。在烟草中总共有6个NtTPE8的同源基因,进化树分析发现NtTPE8和拟南芥的AtδVPE亲缘关系近,而AtδVPE仅仅特异表达在拟南芥早期种子的内珠被两层细胞中4.半定量PCR和荧光定量PCR显示NtTPE8特异并大量地表达在种子中。为了得到更精确的表达定位,启动子分析显示NtTPE8在胚囊周围一圈细胞中检测到信号,這个结构被称做珠被绒毡层5.下调NtTPE8基因表达量,并没有明显表型,令人惊奇的是,烟草种皮程序性死亡的进程既没有被破坏也没有被延迟。考虑箌NtTPE8基因下调水平有限,利用CRISPR基因编辑技术将NtTPE8完全沉默掉,不幸的是,烟草种皮的程序性死亡也没有受到影响虽然在RNAi株系和敲除株系中没有观察箌表型,我们推测NtTPE8很可能与细胞程序性死亡中目前被忽略的某些过程相关。与动物相比,具有caspase活性的蛋白酶在植物中知道得很少本研究中鉴萣出两个caspase-like的蛋白酶,一个是caspase 1,另一个是caspase 3,这无疑是一个大的进步,同时也为进一步研究植物程序性死亡分子机制提供了新的线索。

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