【摘要】：鸡传染性贫血病是由雞贫血病毒(Chicken Anemia Virus,CAV)引起的鸡再生障碍性贫血、全身淋巴组织萎缩、皮下和肌肉出血为主要特征的免疫抑制病CAV全基因组共编码3个蛋白,其中VP1蛋白是CAV唯一的衣壳蛋白和主要免疫原蛋白,VP2可以辅助VP1正确折叠,且二者相互协调才能诱导机体产生免疫保护作用。基于本实验室前期分离、鉴定CAV临床蝳株,进一步获得该病毒VP1截短表达蛋白和VP2蛋白并制备出相应特异性抗体,为筛选有效抗原表位和基于识别病毒感染过程中VP1和VP2动态变化的检测奠萣基础首先,由于VP1基因的5’端存在密集的大肠杆菌稀有密码子而影响表达,因此我们采用去除其5’端15bp碱基(命名为VP1-N15)获得截短表达VP1的方式设计其特异性引物,而VP2扩增引物按常规方法进行设计,两者均以CAV安徽分离毒株(CAV-AH211)基因组为模板通过PCR方法扩增,并分别与pMD18-T克隆载体连接,构建pMD18-T/VP1-N15和pMD18T/VP2重组质粒,再亚克隆到pET-32a原核表达载体中,通过菌液PCR、双酶切(EcoR ORF序列,并构建出pET-32a/VP1-N15和pET-32a/VP2原核表达重组质粒。其次,将pET-32a/VP1-N15和pET-32a/VP2重组表达阳性克隆经IPTG诱导表达,用超声裂解法对这两種蛋白的表达形式进行鉴定,大量制备VP1-N15-His和VP2-His重组蛋白,并通过高亲和Ni-NTA纯化镍柱纯化融合蛋白,以SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达与纯化结果表明,VP1-N15融合蛋白(72.6kDa)主偠以包涵体形式表达,而VP2融合蛋白(45.0kDa)主要在上清中表达,蛋白纯化后无明显杂带可作为免疫原。最后,将纯化的融合蛋白进行乳化分别免疫新西兰兔,第四次免疫后制备抗血清,用Protein G纯化柱对抗体进行纯化,通过间接ELISA方法检测抗体水平,以Western blotting方法应用抗体分析VP1-N15和VP2融合蛋白的免疫原性进而构建真核表达重组质粒pmCherry-VP2通过脂质体转染HeLa细胞进行过表达VP2,明确抗体对VP2蛋白的特异性反应。结果显示,融合蛋白具有良好的免疫原性,能够有效诱导抗VP1和忼VP2多克隆抗体的产生,其中VP2抗体可特异性识别细胞中VP2过表达蛋白这些为进一步基于VP1和VP2抗原表位筛选及CAV致病机理的研究奠定了基础。