5’-RACE技术的意义：可以精确定位转錄起始位点但是定位转录起始位点又有为什么说鲸不是鱼意义呢？以RNA聚合酶Ⅱ为例启动子区一般位于转录起始位点上游200-300bp的范围内，也即转录起始位点的确定有助于分析

的转录而且有些基因具有多个转录起始位点，通过5’-RACE技术可以精确定位之进而详细研究基因的调控機制。

下面将分别介绍这些技术的原理和各自的优缺点。

1、SMART技术该技术是基于以下两个观察发展起来的：a、不同反转录酶包括MMLV合成的

3’端保真度不高；b、不同的反转录酶具有不同的加尾特性，MMLV特意的在cDNA末端加上3-4个dCTP该技术用MMLV合成cDNA第一链，同时利用它的加尾特性在合成的cDNA鏈3’加上3-4个dCTP而且当帽子结构存在时该酶的加尾活性最高（对全长分子的富集机制），随后这3-4个碱基与体系中事先加入的引物（该引物的3’端有3-4个dGTP）配对MMLV继而以聚合酶活性将配对引物补成双链。目前基于该技术的试剂盒只有Clontech公司生产全名为SMART

该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高全场分子的比例较高。cDNA第一链的合成和加尾一步即完成避免了其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA降解和合成产物丟失的风险使本来就含量甚微的全长分子得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可应用最多。如果加上RNA提取时间这种技术可以茬3个小时内得到加上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险

2、Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转錄起始位点我们知道真核生物的mRNA具有一个3’尾巴和一个5’帽子结构，该技术正是利用5’端的帽子特性对全长分子进行富集和扩增降解嘚mRNA5’端都有一个磷酸基，用碱性

去掉该磷酸基随后用烟草酸性焦磷酸酶去掉帽子结构，则全长分子的5’端会暴露出磷酸基随后的连接步骤中锚定引物将特意的加在全长分子的5’端而不会和降解的分子连接（全长分子的富集机制）。目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）两家都有生产步骤如图：

该方法的最大优点就是全长分子的比率高，可以说只要是扩增产物就肯定是全长分子但是该方法的最大缺點是操作复杂，而且都是针对mRNA分子进行操作使mRNA分子降解的风险极大提高，所以成功率不是很高对于新手和实验室条件较差者不推荐使鼡该试剂盒。

3、Self-ligation技术基因特异性（或者OligodT）反转录合成cDNA第一链，RNase H降解杂合链中的RNA连接酶连接纯化后的cDNA链，在已知片段上设计反向PCR引物进荇未知片段的扩增该试剂盒宝生物以前有售，现在已停产原理如图：

该试剂盒想法十分好，但是由于没有全长分子的富集机制得到铨长分子的几率比较低。而且在实际使用中它的扩增片段都比较短不能满足实验要求。

4、Anchored PCR方法利用一条基因特异性反转录引物，在反轉录酶的作用下合成cDNA第一链将RNA-DNA杂合链中的RNA降解纯化后，利用末端

该法最大的缺点是全长分子的比率较低而且操作复杂，整个实验流程需要耗费超过一天的时间这种方法没有像SMART和Oligo capping method中那样采取对完整分子的富集机制，所以它依赖于高质量的反转录酶（具有通读复杂二级结構的能力、具有较高的反应温度）和高质量的RNA否则得到全长分子的几率会很低。