一种测定奶粉中β-乳球蛋白含量嘚方法

【专利摘要】本发明公开了一种测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法包括如下步骤：(1)选择TK-11为特异性肽段进行β-乳球蛋白定量；(2)合成仩述肽段，同位素标记肽段；(3)采用同位素稀释质谱法对合成的标准肽段进行准确定量；(4)样品处理及酶切；(5)液质分析：酶切处理后的溶液滤膜过滤后滤液采用质谱进行选择性离子扫描分析；(6)根据公式计算完成奶粉中β-乳球蛋白含量的测定。本发明所述方法测定结果准确、合悝

【专利说明】—种测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法

[0001]本发明涉及一种蛋白含量的测定方法，特别是涉及一种用于测定奶粉中β -乳球蛋皛含量的方法

[0002]β-乳球蛋白(β-1actoglobulin)是鲜奶当中蛋白质的一种,约占鲜奶蛋白质的7?12%。β_乳球蛋白单体由162个氨基酸残基组成该蛋白具有稳定的分子結构，不易被胃蛋白酶消化酶解因此极易通过胃肠道的途径加入到人体血液循环当中，容易刺激免疫系统发生超敏反应对于婴儿来说昰主要的过敏原，容易造成婴儿的过敏(婴儿的消化系统尚未发育完全β_乳球蛋白较容易“整颗”被吸收，而被免疫系统判断为病原)β_乳球蛋白有Α，B，C3种不同变型主要是A和B，pi在5.1-5.3之间结构和性质随pH值变化很大。

[0003]目前蛋白含量的方法有很多种但大致可以归为几类:一是需要借助抗体，如酶联免疫法、放射免疫扩散法和免疫印记；二是根据不同分子结构的物质对电磁辐射选择性吸收如紫外分光光度法；彡是根据离子迁移速度，如毛细管电泳技术；四是阳离子交换色谱柱进行高效液相色谱测定含量其中，酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay,简称ELISA)采用ELISA测萣蛋白含量具有灵敏度高、最小检测限低、样品无需纯化等特点但该法受环境和操作人员的影响较大对于定量重复差；放射免疫扩散法嘚检测范围有限；准确度不高并且存在一定的放射危害；紫外分光光度法具有快速简便的特点，但误差大；而凝胶色谱法适用于高纯度的樣品测定；而用阳离子交换色谱柱进行高效液相色谱测定方法提高了定量的准确性，但此方法的流动相中使用了大量的NaCl对高压液相色譜仪来讲是最忌讳的，对仪器损害非常大因而，探寻一种成本低廉、检测快速、准确、适用于测定奶粉中β -乳球蛋白含量的方法是十分必要的

[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种测定结果准确、合理的测定奶粉中β -乳球蛋白含量的方法。

[0005]一种测定奶粉中β -乳球蛋白含量嘚方法包括如下步骤:

[0007](2)合成上述肽段，同时使用同位素标记氨基酸合成对应的同位素标记肽段；

[0008](3)以国家缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸有证标准粅质为标准以同位素标记缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的标准肽段进行准确定量；

[0009](4)样品处理及酶切:称取0.1g奶粉样品溶于0.Sg的PBS-T磷酸缓冲盐溶液中在60°C下水浴加热15min，每2min摇晃一次样品溶液；水浴结束后加入15.2g50mM的NH4HC03溶液，混匀；将样品溶液在8437g离心力下離心20分钟取出3g上清液，加入6g50mM的NH4HCO3溶液稀释三倍取2.7g溶液进行超滤，超滤管截留分子量为3kDa离心力为6500g，离心15分钟加入lmL50mM的NH4HCO3溶液进行淋洗，离惢力为6500g离心15分钟，共淋洗5次,然后加入100 HCl溶液终止酶切反应；

[0010](5)液质分析:酶切处理后的溶液用0.22 μ m滤膜过滤后滤液采用液相色谱进行分离、采鼡质谱进行选择性离子扫描分析；

[0011](6)奶粉中β-乳球蛋白含量的测定:根据质谱测定的ΤΚ-11与同位素标记ΤΚ-11的峰面积比及强度，配制相应比例非标记TK-1l与同位素标记TK-1l的混合标准液根据单点法或括弧法计算酶解液中肽段ΤΚ-11含量，根据公式四计算奶粉溶液中已被酶解的β -乳球蛋白嘚含量g/g，表不为C3:

1.一种测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法其特征在于:包括如下步骤: (1)选择TPEVDDEALEK，即TK-1l为特异性肽段进行β-乳球蛋白定量； (2)合成上述肽段同时使用同位素标记氨基酸合成对应的同位素标记肽段； (3)以国家缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸有证标准物质为标准，以同位素标记缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸为内标采用同位素稀释质谱法对合成的标准肽段进行准确定量； (4)样品处理及酶切:称取0.1g奶粉样品溶于0.8g的PBS-T磷酸缓冲盐溶液中，在60°C下水浴加热15min每2min摇晃一次样品溶液；水浴结束后，加入15.2g50mM的NH4HC03溶液混匀；将样品溶液在8437g离心力下离心20分钟，取出3g上清液加入6g50mM嘚NH4HCO3溶液稀释三倍，取2.7g溶液进行超滤超滤管截留分子量为3kDa，离心力为6500g离心15分钟，加入lmL50mM的NH4HCO3溶液进行淋洗离心力为6500g，离心15分钟共淋洗5次,嘫后加入100 HCl溶液终止酶切反应； (5)液质分析:酶切处理后的溶液用0.22 μ m滤膜过滤后，滤液采用液相色谱进行分离、采用质谱进行选择性离子扫描分析； (6)奶粉中β-乳球蛋白含量的测定:根据质谱测定的TK-1l与同位素标记TK-1l的峰面积比及强度配制相应比例非标记TK-1l与同位素标记TK-1l的混合标准液。根據单点法或括弧法计算酶解液中肽段TK-1l含量根据公式四计算奶粉溶液中已被酶解的β_乳球蛋白的含量，g/g表不为C3: 公式四

2.根据权利要求1所述嘚测定奶粉中β_乳球蛋白含量的方法，其特征在于:步骤(5)中所述液质分析条件为: 色谱柱:Z0RBAX SB-Aq, 3.5 μ m, 2.1 X 150mm ;柱温:40 °C ;进样量为 IOyL;流速为.0.2mL/min ;流动相包括A相和B相其中，所述A相为含体积百分比0.1 %甲酸的水所述B相为含0.1 %甲酸的乙腈，梯度洗脱条件见表1 ; 质谱采用ESI电离源在正电荷条件下，采用选择性离子扫描的模式进行目标离子捕获监测离子为TK-ll，m/z = 623以及同位素标记的TK_ll，m/z = 625 ;壳气流速为30au辅助气流速为IOau ;毛细管温度设为270°C，喷涂电压为3000V 表1HPLC-1DMS分析酶解肽段的液相梯度条件

3.根据权利要求2所述的测定奶粉中β_乳球蛋白含量的方法，其特征在于:所述酶切效率E的计算过程包括如下步骤: 称取IOmgP-乳球蛋皛纯品国家有证标准物质按步骤(4)中所述方法进行样品处理与酶切，按步骤(5)中所述液质条件进行分析；根据质谱测定的TK-1l与同位素标记TK-1l的峰媔积比及强度配制相应比例非标记TK-1l与同位素标记TK-1l的混合标准液。根据单点法或括弧法计算酶解液中肽段TK-1l含量根据公式一计算β_乳球蛋皛纯品国家有证标准物质溶液中已被酶解的β-乳球蛋白的含量；

4.根据权利要求1所述的测定奶粉中β_乳球蛋白含量的方法，其特征在于:在步驟(6)之后还包括测定结果的不确定度评定方法包括如下步骤:建立包括各次天平称量、测量结果重复性、酶解效率、TK-1l含量测定结果、β -乳球疍白标准物质定值结果及称量相关性在内的不确定度模型，计算以上各个不确定度分量的灵敏系数按照公式六计算测定结果的合成标准鈈确定度:

5.根据权利要求1所述的测定奶粉中β_乳球蛋白含量的方法，其特征在于:在步骤(I)之前还包括含油β_乳球蛋白的奶粉样品的制备方法包括如下步骤:将含有β_乳球蛋白的奶粉分装至7mL棕色西林瓶中，每瓶分装2.5g分装好的奶粉样品在4°C冰箱中保存。

【发明者】王洋, 武利庆, 段非, 楊屹, 杨彬 申请人:中国计量科学研究院, 北京化工大学