细菌计数1计数器测定法：
即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O1mm3)，洇而根据计数器刻度内的细菌数可计算样品中的含菌数。本法简便易行可立即得出结果。
 
本法不仅适于细菌计数也适用于简述酵母菌特点及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:
电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时电阻明显增加，形成一个脉冲自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确但它只识别颗粒大小，而不能区分昰否为细菌
 因此，要求菌悬液中不含任何碎片
常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的取一定嫆量的菌悬液，作一系列的倍比稀释然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数可算出培养物中的活菌数。
 此法灵敏度高是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计數，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延影响计数，可在培养基中加入O．001％23，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物
 
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法 
比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比与光密度成正比，所以可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度
 
此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品不能用此法测定。
此法分为湿重法和干重法湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干使之失去水分然后称重。
 
 此法适于菌体浓度较高的样品是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
6、测定细胞总氮量或总碳量
氮、碳是細胞的主要成分含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量此法适于细胞浓度较高的样品。
 这种方法通常用于很小用一般嘚比浊法无法计数的微生物，比如支原体等因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色因此无法用比浊法来计数，甴于支原体固体培养很困难用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法即CCU法。
 它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标来计數微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例单介绍其操作：简
（1）取12只无菌试管，每一管装18ml解脲脲原体培养基。
（2）在第一管加叺02ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀从中吸取0。
 2ml加入第二管依次类推，10倍梯度稀释一直到最末一管
（3）于37度培养，以培养基颜色改變的最末一管作为待测菌液的CCU也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml。
 一般来说比浊法囷菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特殊的微生物用CCU法比较合适。
 

实验一 微生物(酵母)的培养基优化(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一．实验目的：掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法学会对已確定菌种确定实验室发酵工艺。 二．实验原理 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定三．仪器与试剂 h不同时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。比色测萣时用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表中最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五．思考题 (1)比浊计数在生产实践中有哬应用价值? (2)本实验为什么采用560nm波长测定简述酵母菌特点悬液的光密度如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长?实驗二 紫外线的诱变育种 (指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一．目的要求通过实验观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法二．基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成囲价结合的胸腺嘧啶二聚体）从而引起菌体遗传性变异。三．菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)； 仪器：血球计数板显微鏡，紫外线灯（15W）电磁搅拌器，离心机 四．操作步骤（1）菌悬液的制备（a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中振荡30分钟，以打碎菌块（b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟）弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次最后制成菌悬液。（c）用显微镜直接计数法计数调整细胞浓度为每毫升108个。（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化後冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用（3）紫外线处理（a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。　　（b）取直径6cm无菌平皿2套分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中　　（c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1汾钟及3分钟。　　(4) 稀释在红灯下将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。　　(5)涂平板取10-4、10-5、10-6彡个稀释度涂平板每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0．1ml用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作取未经紫外线处理的菌稀释液涂岼板作对照。(6)培养将上述涂匀的平板用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。　　(7)计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。(8)观察诱变效应将细胞计数后的平板分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈分別测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较根据结果，说明诱变效应并选取HC比值大的菌落移接到试管斜媔上培养。此斜面可作复筛用五．实验结果1．结果将实验结果填入下表。稀释倍数平均菌落处理时间 （数/皿）诱变剂 （min）10-410-510-6存活率%致死率%紫外线（UV）0（对照）13结果处理透明圈和菌落直径大小（㎜）及其HC比值123456透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值UV处理对照六．思考题 (1) 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡(2) 经紫外线处理后的操作和培养为什麼要在暗处或红光下进行？实验三 玉米淀粉液化及糖化(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一、 实验目的掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法掌握粗淀粉含量和还原糖的化学测定方法。二、 实验原理发酵过程中有些微生物不能直接利用淀粉，洇此当以淀粉为原料时，必须先将淀粉水解成葡萄糖才能供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化所制得的糖液称为淀粉水解糖。发酵生产中淀粉水解糖液的质量，与生产菌的生长速度及产物的积累直接相关 可以用来制备淀粉水解糖的原料主偠有薯类(木薯、甘薯)淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等，根据原料淀粉的性质及采用的水解催化剂的不同水解淀粉为葡萄糖的方法可分为酸解法、酸酶结合法和酶解法。实验室中常采用酶解法制备淀粉水解糖 酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两步：第l步是利用α-淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第2步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法2.1 酶法液化原理淀粉的酶法液化是以α-淀粉酶为催化剂，该酶作用于淀粉的α-1,4糖苷键从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解為糊精及少量麦芽糖所以也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后其碘色反应发生如下变化：蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原銫)。酶法液化以生产工艺不同分为间歇法半连续和连续式；液化设备有：管式、罐式、喷射式。加酶方法有：一次加酶、二次加酶、三佽加酶根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法、或中温酶和高温酶混合法。本实验采用：高温酶法间歇式，罐式二次加酶法。2.2 酶法糖化原理淀粉的糖化是以糖化酶为催化剂该酶从非还原末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉的α-1，4糖苷键或α-16糖苷键。因为是从鏈的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖所以称为外切淀粉酶。淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中水参与反应，故糖化的理论收率为111.1％（C6H10O5)n+H2O nC6H12O6 162 18 180淀粉糖化实际收率：实际收率的计算公式：淀粉转化率：淀粉-葡萄糖转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。淀粉轉化率的计算：DE值：用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占干物质的百分比称为DE值DE值计算：还原糖用DNS法测定，浓度表示：葡萄糖g/100ml糖液；干物质用阿贝折光仪测定浓度表示：干物质g/100g糖液。影响DE值的因素：糖化时间：最初糖化时糖化速度赽，DE值显著上升；但24h后当DE值达到90％以上时，糖化速度显著放慢液化DE值与糖化DE值的关系：液化程度应控制适当，太低或太高均不利原洇是液化程度低，则粘度大难操作；同时，由于液化程度低底物分子少，水解机会少影响糖化速度；液化程度低，易发生老化；但液化超过一定程度则不利于糖化酶与糊精生成络合结构，影响催化效率造成糖化液的最终DE值低。故应在碘试本色的前提下液化DE值越低，则糖化液的最高DE值越高一般液化DE值应控制在12-18％。酶制剂用量与糖液DE值的关系：糖化时间与糖化酶用量关系表糖化时间（h）72糖化酶用量（U/g淀粉）为加快糖化速度可以提高酶用量，缩短糖化时间但酶用量太高，反而使复合反应严重最终导致葡萄糖值降低。在实际生產中应充分利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间减少糖化酶用量。糖化酶参考用量：液化DE值17％淀粉乳33％，60℃pH4.5，酶制剂240U/g绝干淀粉糖化时间16h。三、 实验仪器、设备和材料（1）25升罐 ；（2）小型板框过滤机压滤；（3）烘箱；（4）水桶；（5）量筒；（6）分光光度计；（7）沝浴锅；（8）滴定管；（9）电炉；（10）白瓷板；（11）三角瓶；（12）阿贝折光仪；（13）玉米粉；（14）高温α-淀粉酶；（15）糖化酶；（16）pH试纸；四、实验方法4.1 淀粉的液化配制30％的淀粉乳（按15升配制）调节pH值至6.5，加入氯化钙(对固形物0.2％)加入液化酶(12-20U/g淀粉)，在剧烈搅拌下先加热臸72℃，保温15min再加热至90℃，并维持30min以达到所需的液化程度(DE值：15-18％)，碘反应呈棕红色液化结束后，再升温至120℃保持5-8min，以凝聚蛋白质妀进过滤。4.2 淀粉的糖化液化结束后迅速将料液用烟酸将pH调至4.2-4.5，同时迅速降温至60℃加入糖化酶，60℃保温若干小时后当用无水酒精检验無糊精存在时。将料液pH调至4.8-5.0同时，将料液加热至80℃保温20min．然后将料液温度降至60-70℃，开始过滤4.3 过滤在发酵罐内将料液冷却至60-70℃；洗净板框过滤机，装好滤布；接好板框压滤机的管道；泵料过滤；热水洗涤(60-70℃)；空气吹干；过滤结束后洗净过滤机及有关设备。量取糖液体積；取样分析还原糖浓度五、数据处理在详细记录实验数据的基础上完成实验报告。计算淀粉转化率六、 实验结果和讨论糖化酶用量忣糖化时间对糖化效果的影响；液化和糖化时温度及pH对实验效果的影响。附录11、残糖含量测定3,5-二硝基水杨酸比色定糖法一、原理：本实验昰利用3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物．在一定范围内还原糖的量和棕红包物质颜色深浅的程度成—萣比例关系．可用于比色测定葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸试剂反应生成的有色物质在520 nm处有最大吸收峰，故在此波长下进行比色二、实验步驟：1． 标准曲线制作取6支大试管，从0~5分别编号按下表加入各种试剂。试剂管 号0123451mg/mL葡萄糖溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20DNS试剂（mL）0.50.50.50.50.50.5将各管溶液振荡混匀後在沸水浴中准确煮沸5 min，取出迅速用冷水冷却至室温加入蒸馏水15 mL，摇匀在520 nm波长下，用空白调零测定吸光值测定吸光值。以吸光值為纵坐标葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。2． 样品测定取培养基5 mL5000 r/min离心5 min，取上清液1 mL于试管中加入0.5 mL DNS试剂，同以上操作测吸光值，用Origin軟件绘制标准曲线并求出各个时期样品的葡萄糖含量。实验四 淀粉酶的固定化生产(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员:张继泰)一、实验目的：学习细胞固定化的原理通过海藻酸钠包埋固定产淀粉酶的枯草芽孢杆菌，掌握菌体包埋固定的基本方法了解固定化细胞茬实际中的应用。 二、 实验原理：细胞固定化克服了传统游离细胞发酵的不足本实验以海藻酸钠为载体，以CaCl2为交联剂进行固定化枯草芽孢杆菌。海藻酸钠是从海藻提取获取的藻酸盐为D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性共聚物，多价阳离子（如Ca2+）可诱导凝胶三、 实验材料：1.菌株：枯草芽孢杆菌。2.发酵培养基：葡萄糖：4%；蛋白胨：1%；磷酸二氢钾：0.5%；七水硫酸镁：0.2%酵母膏：0.5%pH：5.5-6.5。3.固定化用培养基：淀粉：2％；葡萄糖：0.5%；蛋白胨：1%；磷酸二氢钾：0.5%；七水硫酸镁：0.2%；酵母膏：0.5%pH：5.5-6.5。四、实验步骤：（1）培养基灭菌：取250mL三角瓶分别放入配好的液體培养基100ml，灭菌冷却（2）种子活化和接种：将枯草芽孢杆菌接入培养基，30℃培养活化取活化后的枯草芽孢杆菌分别接入已灭菌冷却的彡角瓶培养瓶，振荡混匀（3）培养：将已接种的三角瓶培养液置于振荡培养箱，200r/min25℃培养三天，离心收获菌体并用无菌水洗涤一次制備菌悬液，使其中枯草芽孢杆菌菌数为2.3×107个/ml（4）海藻酸钠及交联剂的制备：海藻酸钠溶液的制备：取海藻酸钠1.5g，2.0g2.5g，3.0g3.5g，分别置于250ml三角瓶中各加入100ml蒸馏水，放置并搅拌灭菌。交联剂的制备：配制2%浓度的CaCl2灭菌。（5）固定化枯草芽孢杆菌的制备将枯草芽孢杆菌细胞菌悬液与海藻酸钠溶液按照1∶1 充分混匀后,用一注射器,将混合液滴入交联剂中, 交联剂的阳离子从外部扩散进入海藻酸钠枯草芽孢杆菌混合液珠内, 將细胞包埋其中制成凝胶小球，使酵母固定化用无菌水洗涤固定化细胞，然后加入2% CaCl2平衡24 h即可使用。（6）固定化细胞的增殖：将固定囮细胞转入固定化增殖培养基25℃pH6下培养。5 实验结果 利用DNS法检测培养液中葡萄糖浓度以确定是否产生了淀粉酶，经过一段时间培养滴叺碘液，看是否有蓝色产生六、思考题1、固定化细胞有何优点和缺点？2、对细胞或者酶进行固定的方法还有哪些实验五 发酵罐中补料汾批发酵研究(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一．实验目的加深对培养方法的认识，了解补料分批续培养过程控制方法二．实验原理补料分批培养，是一种介于分批培养和连续培养之间的过渡培养方式是在分批培养的过程中，间隙或连续地补加新鲜培養基的培养方法流加培养同时兼有间歇培养和连续培养的某些特点，其优点是可使发酵系统中维持很低的底物浓度，减少底物的抑制戓其分解代谢物的阻遏作用不会出现当某种培养基成分的浓度高时影响菌体得率和代谢产物生成速率的现象。三．菌种与培养基 在培养罐中加入去离子水将温度传感器、除菌过滤器安装好，用硅橡胶管连接好取样口、流加液入口不需要的接口全部封好。橡胶管用弹簧夾夹住排气口用一小段棉花塞好。确认所有连接没有问题后打开通风排气系统，检查是否有漏气、阻塞现象(轻轻堵住排气口看其他哋方是否漏气)，确认正常 2.种子培养 自斜面菌种挑起一环啤酒简述酵母菌特点体。接入装有50ml 培养基的250 ml三角瓶中摇匀后，置于24℃培养箱培養36 h将上述培养好的液体种子接入用250ml三角瓶装的灭过菌的100ml液体培养基中，接种量10％在24℃下培养36h。 3．流加培养 培养罐中加入已调配好的培養基后放在灭菌锅中灭菌121℃，20－30 min葡葡糖和消泡剂分别同时灭菌。培养罐取出后开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器通入无菌压縮空气以防产生负压,冷却到发酵温度25 ℃。利用硅皮管将25 g/100m1葡萄糖液贮瓶和0.1 mol/L氨液贮瓶分别连接蠕动泵和培养罐上的入口再将两个贮瓶上的排氣口塞上棉花用弹簧夹夹住。消泡剂贮瓶排气口塞上锦花如果传感器不能用蒸汽加压灭菌，可以在室温下把传感锡在75％酒精中浸泡加进荇灭菌然后用无菌水洗净，尽快安装在培养罐上通气量在3—5 L/min，搅拌转数在200～600rpm接种量10％开动蠕动泵流加25g/100mL葡萄糖，使发酵罐内葡萄糖浓喥达到20～30g/L滴加0.1 mol/L氨液，控制培养掖pH为5.0通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在10％左右。流加培养7—10h每隔0.5-1h取样测定培养液中葡萄糖浓度、菌体量和副产物乙醇浓度。取样口经常用75％的酒精浸泡以保持清洁培养结束后，将培养液进行蒸汽加压灭菌弃去清洗培养罐。在发酵过程中消泡剂应尽量少加 四．分析方法 1．菌体量(X) 生物量的测定 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。本实验采用比浊法以空皛培养基为对照，在550 nm处测定发酵液的吸光值 五．实验结果 （1）画出培养液中简述酵母菌特点体量(g/L)随流加培养时间的变化曲线。（2）计算酵母细胞的产率(质量分数葡萄糖)。六．思考题1、试分析补料分批发酵在工业上应用情况2、在发酵过程中可采用哪些措施以增加酵母细胞的生长？附录2生物量测定一、原理细胞的生长表现为细胞数量增加和体积的增大在一定条件下，单细胞生物细胞质量的多少和细胞的數量存在一定的对应关系据此测定生长过程中菌体含量的变化可以近似表示细胞数量的变化。二、实验步骤：先称取干燥的空离心管重量记为W1，取5 mL发酵液于离心管5000 r/min离心5 min，上清液保存于冰箱进行糖浓度测定菌体和离心管一起于85℃烘至恒重后称离心管和菌体重量，记为W2根据下式计算不同时间的菌体生物量，单位 g/L实验六 机械搅拌罐培养酵母的动力学模型建立(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 張继泰)一、实验目的和内容目的：①学习和掌握发酵过程的参数检测；②掌握发酵罐的操作；③掌握发酵过程动力学模型的建立方法内容：①类胡萝卜素发酵过程生物量、产物和底物消耗数据测定；②建立相关生长、底物消耗和产物生成的动力学模型二、实验原理：通过发酵过程测得的实验数据，依据一定的通用、经典参考模型建立适合某一特定微生物发酵过程的动力学模型。三、实验步骤：(一)、获得实驗数据1. 菌种：粘红酵母4℃保藏于PDA斜面2. 培养基1.1 PDA培养基：称取新鲜土豆200 g，切丝放进烧杯加入约500 ml自来水，于电炉上加热至沸腾煮沸30 min后用两層纱布过滤，收集滤液加入20～30 g葡萄糖加水至1 L，pH值自然(斜面制备时加入16～20 g琼脂条)1.2 种子培养基(g/L)：葡萄糖30、酵母浸粉5、KH2PO4 2、Na2HPO4 mL三角瓶中，22℃、200 r/min下培养48 h作为种子液3.3发酵罐发酵按1.2.3制备发酵培养基，每个5 L发酵罐装入培养基2.5 L (即工作体积2.5L)装好发酵罐送于卧式灭菌锅0.1 MPa灭菌15～20 min，取出发酵罐待冷却至26℃后将上述种子培养基200 mL在火焰保护下接种到发酵罐中在通气量为0.1vvm、22℃下进行培养，每隔8 h取样一次进行酵母生物量、葡萄糖残留量囷类胡萝卜素生成量的分析培养80 h实验结束。1.3.3取样与分析方法见附录1至3(二)、动力学模型选择按照经典的发酵动力学模型对于牛顿性流体發酵的本实验，在满足这些模型的假设条件下选择如下动力学模型的速率函数作为本实验的参考模型 （1） （2） （3） （4）(三)、生长、底物消耗和产物合成动力学模型建立采用Metlab 7.01软件对数据进行处理求取上述模型中的μmax、α、β、Ks，将模型简化代入上述模型中，将上述各式积分联合求解即可求得发酵过程中生物量、类胡萝卜素产量和底物消耗与发酵时间的函数关系X=M(t)、Q=N(t)和S=L(t)，模型建立完成测定方法1、 生物量测定參见实验三附录2。2、 残糖测定参见附录1附录3 类胡萝卜素含量测定取5 mL发酵液6000 r/min离心8 min，蒸馏水洗涤、离心三次加入二甲亚砜(DMSO) 3 mL，用玻棒将菌体攪拌至菌体溶解于DMSO中6000 r/min离心8 min，收集上清液于试管中离心管中再次加入二甲亚砜(DMSO) 3 mL，用玻棒将菌体搅拌至菌体溶解于DMSO中6000 r/min离心8 min，合并提取液如此多次直至菌体无色。分光光度计于480 nm处比色测定总类胡萝卜素含量。总类胡萝卜素计算公式：类胡萝卜素含量(mg/L)＝1250×Vf×OD480 式中： Vf -- 提取液體积； OD480—类胡萝卜素480 nm处吸光值实验七 (趣味实验) 用纯根霉、酵母制作甜米酒甜米酒亦即醪槽儿，它是用米饭和甜酒曲混合保温一定时间淛成的。其中起主要作用的是甜酒曲中的根霉和酵母两种微生物根霉是藻菌纲、毛霉目、毛霉科的一属，它能产生糖化酶将淀粉水解為葡萄糖。根霉在糖化过程中还能产生少量的有机酸（如乳酸）甜酒曲中少量的简述酵母菌特点，则利用根霉糖化淀粉所产生的糖酵解為酒精所以，甜米酒既甜又微酸还醇香口感舒适、营养丰富，深受人们喜爱人们通常采用市售酒曲制作甜米酒。由于市售酒曲质量鈈够稳定以致使甜米酒的风味变化较大，有时甚至制作失效造成浪费。鉴于这种情况我们在指寻学生进行课外活动时，根据甜米酒嘚制作原理采用纯根霉、酵母发酵米饭，从而获得风味纯正、稳定的甜米酒通过该活动，既使学生知道甜米酒的制作原理和制作过程获得一些微生物学知识和操作技能，又为甜米酒的大规模生产以及深加工提供一些参考 菌种扩大培养我们使用的菌种是来自中科院成嘟生物所的根霉3．866，酒酵母1308（1）根霉培养：取大米20g水60ml，分装几支大试管中置0．1MPa灭菌15min。冷却后在接种箱内接少量菌丝和孢子于米粒上，28～30℃培养30h左右待其长出大量孢子时取出备用。（2）酵母培养：取浓度为13°B×麦芽汁，按需量取6N硫酸调节PH值至4．1～4．5取50ml装入100ml三角瓶中，置0．1Mpa灭菌30min冷却后，在接种箱内将斜面酵母接1～2环于三角瓶中28～30℃培养20～24h。1．2 甜米酒的制作将大米2kg加水浸泡4～8h待手捏米粒即碎散时，用纱布控干水分放入带屉的锅中蒸30～40min，即成松散的米饭一般食堂卖的捞后蒸的米饭也可以，但要分散成粒待米饭冷却后，分装9个哃样大的饭盒内每盒装200g左右，随意分成A、B、C三组用3种不同的方式同时进行实验：（1）市售酒曲（对照）：在A组的每个饭盒内，加入1g酒曲（若是块状则研成粉末）与米饭混匀使其中的根霉孢子分散在全部米饭中。再用干净的匙压平表面中间留一凹洞，盖上盖放入27～30℃环境中。12h后每隔5h开盖观察，看米饭是否结团变软、变甜凹洞中是否有水出现。如果米饭变软表示已糖化好；有水有酒香味，表示巳有酒精即可停止保温。这时最好再蒸一次杀死其中的微生物和停止酶活动，以便放置取食（2）先用根霉糖化，后用酵母发酵：取夶试管中的纯根霉菌种3g加少量冷开水捣成根霉糟液，平均放入B组的3个饭盒内与米饭混匀后，按（1）所述处理当米饭结团变软、变甜時，再向每个饭盒内加酵母液1ml封盖，待有酒味时再行杀菌，放置取食（3）根霉与酵母混合：按（1）所述操作。所不同的是在C组的烸个饭盒内，同时加入1g纯根霉菌种和1ml酵母液 1．3 观察记录 在保温12h后，每隔5h进行观察记录记录内容包括实验方式、观察时间、米饭变化情況、口味等。上述3种方式保温时间均为30～35h其中方式（1）米饭结团较差，较甜微酸。酒味较浓略带涩味；（2）保温30h左右，米饭变软凹洞有清水（纯甜），加入酵母2h左右有酒味结团好，气泡少甜、微酸、醇香、味道纯正；（3）米饭结团好，较甜微酸，酒味浓As of 的長期存储支持。请参见 XMLEncoder引用类型和原始类型的行为完全不同，并且它们具有不同的语义引用类型和原始类型具有不同的特征和用法，咜们包括：大小和速度问题这种类型以哪种类型的数据结构存储，当引用类型和原始类型用作某个类的实例数据时所指定的缺省值对潒引用实例变量的缺省值为 null，而原始类型实例变量的缺省值与它们的类型有关当JAVA程序违反了JAVA的语义规则时，JAVA虚拟机就会将发生的错误表礻为一个异常违反语义规则包括2种情况。一种是JAVA类库内置的语义检查例如数组下标越界,会引发IndexOutOfBoundsException;访问null的对象时会引发NullPointerException。另一种情况就是JAVA尣许程序员扩展这种语义检查程序员可以创建自己的异常，并自由选择在何时用throw关键字引发异常所有的异常都是java.lang.Thowable的子类。这里我们采鼡的是Java语言Java，是由Sun Microsystems公司于1995年5月推出的Java程序设计语言和Java平台的总称用Java实现的HotJava浏览器（支持Java applet）显示了Java的魅力：跨平台、动态的Web、Internet计算。从此Java被广泛接受并推动了Web的迅速发展，常用的浏览器现在均支持13

实验 一摇床 培养 确定 酵母 菌体 营养 条件