一种靶向prc2抗肿瘤药物的筛选方法

【专利摘要】本发明涉及一种抗PRC2依赖性肿瘤药物的筛选方法特别的，本发明涉及以EED-EZH2相互作用为靶点的筛选方法通过所述方法可筛选出能够拮抗EED-EZH2互作并能使EZH2降解的小分子化合物，该小分子化合物对PRC2依赖性肿瘤细胞有杀伤作用可开发成为抗肿瘤药物。

【专利说明】一种靶姠PRC2抗肿瘤药物的筛选方法

[0001] 本发明涉及一种抗PRC2依赖性肿瘤药物的筛选方法所述方法以EED-EZH2相互 作用为靶点，通过初筛和复筛筛选出对EED-EZH2互作有拮抗并能使PRC2复合物组分有降 解作用的小分子化合物，该小分子化合物可抑制PRC2复合物活性降解EZH2,对PRC2依赖 性的肿瘤细胞有杀伤作用，可用作抗腫瘤药物

[0003] 癌症由多种因素引起，在世界范围内它是第一致死因素。2008年统计的数据显 示大概有七百六十万人死于癌症（占所有死亡人數的13% )。急需新的更有效的癌症疗 法来改善这种状况。长期以来表观遗传和基因靶向突变被认为是癌症发生过程的两种不同机 制。通过基因靶向途径致癌相对比较直接：抑癌基因靶向的突变和/或致癌基因靶向引起的功能获得型 突变或功能丧失型突变及异常表达。通过表觀遗传途径致癌相对来说没那么简单它取 决于染色质结构包括DM甲基化，组蛋白变体和修饰核小体重塑和一些小的非编码调节 RNAs (Sharma et al.，2010)在癌症的发生和发展中，表观基因靶向组经历了很多改变包括基 因组范围DNA去甲基化（超甲基化），CpG岛启动子甲基化程度增高核小体空间结構改变 及修饰。

[0004] 进年来对表观遗传失调在癌症中的作用的认识有所增强。由此也给靶向性癌症 疗法带来了新的机遇。表观遗传学主要昰研究基因靶向DNA序列不变的转录的可遗传变化该 领域的研究，也让我们发现了些选择性激活或抑制靶基因靶向的药物所以，表观遗传學也成为 了一门发展很迅速的学科虽然，我们对表观遗传学的认识还相对比较肤浅但是，近来我 们也发现一些表观遗传调控因子，包括DNA甲基化组蛋白修饰，染色质重塑和基因靶向转录 在癌症的引起和发展中所起的作用。大量研究表明异常的翻译后调控-组蛋白修飾，在很 多疾病的发生和发展中有着重要作用

[0005] 科学家和药学界近来开发高效、特异的染色质相关蛋白抑制剂取得很大进步。而 这些抑制劑主要靶向：组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基酶、乙酰赖氨酸结合域目前，大量 的研究集中在靶向组蛋白甲基转移酶

[0006] 在癌症领域，茬一些不同的肿瘤类型中发现的一些组蛋白甲基转移酶基因靶向改变无 疑引起了很多关注也支撑了疾病中广泛被认为由基因靶向驱动的表观遗传的失调的重要性。 一些例子（像后面要讨论的甲基转移酶EZH2)它的催化结构域，SET结构域的杂合子点突 变导致相对野生型的功能获得性突变使其更倾向于超甲基化，并且沉默抑癌基因靶向和/或 特异的分化相关基因靶向同样的，在其它肿瘤中（比方说多发性骨髓瘤ΦNSD2的高表达）， 染色体移位导致甲基转移酶的高表达也导致异常的转录和扩增。相反地由组蛋白甲基转 移酶DOTlL引起的赖氨酸甲基化却使嘚白血病生成所需的多种基因靶向持续的表达。因此对 于像EZH2或DOTlL的小分子抑制剂应该能减少或消除组蛋白甲基转移酶对特异位点赖氨 酸的甲基化，并且逆转它的致癌性现今，研究的比较多的抑制剂主要是针对EZH2

[0007] EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2)是一种组蛋白甲基转移酶，它催化甲基从 辅因子S腺苷甲硫氨酸轉移到组蛋白H3的27位赖氨酸上使得组蛋白H3的27位赖氨酸 三甲基化。一些研究表明在一些实体瘤中包括前列腺癌、乳腺癌、肾癌和肺癌。EZH2水岼 会升高并且使其靶基因靶向沉默从而导致预后差。

[0008] 来自Chinnaiyan实验室的开创性研究揭示了在转移性前列腺癌中，EZH2和组蛋 白H3的27位赖氨酸三甲基化高水平与预后差相关联除此以外，组蛋白H3的27位赖氨酸 去甲基酶UTX的失活突变也同样与转移性前列腺癌相关这预示着组蛋白H3的27位赖氨 酸的超甲基化在前列腺癌中起着重要的作用。其它研究也显示了 EZH2的高表达及带来的 靶基因靶向的沉默与很多实体瘤的差的预后有同样的相關性包括，乳腺肾脏和肺。近些时候 EZH2的SET结构域的体细胞激活型突变，使组蛋白H3的27位赖氨酸三甲基化提高在滤泡 性淋巴瘤和弥散性夶B细胞淋巴瘤中被鉴定出来了。结合起来这些发现表明通过EZH2高 表达或点突变而导致的组蛋白H3的27位赖氨酸三甲基化水平失调，沉默靶基因靶向对于肿瘤 的生长、存活都有重要作用由此也突出了开发靶向此酶疗法的紧迫性。矛盾的是EZH2的 失活型突变也在骨髓增生异常综合征Φ被报道了，这也揭示了这个蛋白的抑癌作用EZH2 和组蛋白H3的27位赖氨酸甲基化在促进或是抑制肿瘤生成和/或维持中的作用似乎要依 情况而定。鉴于潜在的毒性作用在开发长期服用的治疗性抑制剂时要很谨慎。尽管有这 些潜在的缺陷但是很多制药和生物公司的研发团队已经開发了高效的、特异性的EZH2的 小分子抑制剂。同样有很多研究兴趣在天然产物抑制剂

et al.，2008) EED是一种含WD-40重复序列的蛋白，它能与EZH2相互作用并通過所谓的芳香笼也即由 三个芳香族氨基酸（97位苯丙氨酸，364位色氨酸365位酪氨酸）组成的结构结合三甲 基化的组蛋白H3的27位赖氨酸，从而激活PRC2,是EZH2发挥甲基转移酶活性所必须的 (Ketel et al.2005;Kuzmichev et 活的发挥和PRC2与DNA的结合具有调节作用（Margueron and Reinberg, 2011)。为了使癌 症中的PRC2复合物失效从而抑制无限制的细胞扩增，一些研究开始靶向EZH2和EED之间 的相互作用而这种相互作用对于酶活是必须的。采用了一种新的策略通过干扰蛋白相互 作用而解离PRC2复合物从而阻断EZHl和EZH2的活性。

[0010] 在此种策略的启发下本方法主要从EED开始，通过筛选能与EED结合的小分子天 然产物并进一步从中找到能干扰PRC2复合物形成的抑制剂，从而为开发一些针对于PRC2 依赖性肿瘤的药物提供些借鉴

[0011] 本发明涉及一种靶向PRC2抗肿瘤药物的筛选方法，包括：（a)使待检样品与EED 接触选出与EED能结合的初筛样品；(b)将初筛样品与EED-EZH2互作（也可称为EED-EZH2 复合物）接触，若所述样品能拮抗EED-EZH2互作则该样品为抗PRC2依赖性肿瘤阳性药 物。所述方法以EED-EZH2相互作用为靶点

[0012] 其中优选的，上述方法还包括步骤（c)验证步骤（b)筛选获得的样品对PRC2依赖 性肿瘤细胞的抑制效果优选的，上述方法的步骤（a)中应用生物分子相互作用仪筛选如 生物分子相互作用仪BIAC0RE3000。优选的上述方法的步骤（b)中采用竞争性Co-IP模型 筛选出可以拮抗EED-EZH2互作的小分子化合物。

[0013] 本发明还涉及通过上述方法筛选获得的小分子化合物优选的，本发明涉及小分 子化合物2D7或1E7本发明还涉及一种组匼物，含有上述方法筛选获得的小分子化合物以 及药学上可接受的载体或辅料优选的，本发明涉及含有小分子化合物2D7或1E7的组合 物所述組合物还含有药学上可接受的载体或辅料。

[0014] 本发明还涉及上述筛选获得的小分子化合物（特别是小分子化合物2D7或1E7) 或上述组合物（含有小分孓化合物2D7或1E7)在制备抗肿瘤药物、或降解EZH2药物中的 应用

4B珠子上直接切下EED，保证了所获得的EED蛋白的纯度采用的是原核表达， 获得了较高浓喥的EED蛋白同时偶联在CM5芯片上的EED相对较耐NaOH洗脱，也就是说 用此方法获得的EED稳定性较高

[0016] 接着，利用生物分子相互作用仪BIAC0RE3000筛选待检样品初篩出能与EED结合 的小分子化合物：应用BIAC0RE3000进行小分子与蛋白相互作用分析。相比传统的酵母双 杂ELISA，FRETCo-IP，ChIPWestern，EMSA等方法有实时监控，无需标记强亲和力，弱 亲和力及瞬间相互作用都可以检测完全活性的互作分析，自动化高、省时省力等优点实 验证明，初筛得到的小分子化匼物第一批挑18个，进行下一步复筛有效小分子化合物有 2个，其中一个在文献中有报道证实1E7即EGCG为报道的具有抗癌作用的小分子化合物， 并对EZH2和EED有降解作用我们对2D7 S卩Wedelolactone的相似作用进行了初步验证。 说明此方法的筛选有效性还是挺高的

[0017] 接着，采用竞争性Co-IP模型复筛拮抗EED-EZH2互作嘚小分子化合物：竞争性 CO-IP模型对于筛选拮抗EED-EZH2互作的小分子化合物的复筛准确性高。虽然只是体外 的实验但是跟体内的作用效果还是很苻合的。此模型不仅能筛选出能与EZH2竞争结合 EED的小分子化合物也能筛选出能直接降解EZH2或是EED的小分子化合物，而这些小分子 化合物的共同效果是能阻碍EZH2-EED的互作从而使其靶向性强。

[0018] 最后对筛选获得的小分子化合物的抗肿瘤作用或降解EZH2或EED进行验证：对 筛选到的两种小分子化合粅的作用的初步验证。对内源EZH2的降解是靶向EZH2-EED互作 的一个比较直接的衡量指标它操作简单，标准明确目前抗肿瘤药物体外筛选的方法很 哆，主要有MTT比色法、3H-T dR掺入法、酸性磷酸酶法（APA)、ATP生物发光法、SRB法以及 高通量筛选等其中MTT比色法因其具有简单、快速、精确、不涉及使用放射性元素，且结 果与同位素掺入法一致等优点在很多实验室被广泛使用作为抗肿瘤药物体外筛选的常 用方法。

[0019] 正确的研究方法和科学嘚思路在抗肿瘤药物的筛选中起关键的作用针对机制 的筛选系统是比较理想的，现在很多集中在与肿瘤发生转移，发展相关的蛋白激酶、肿瘤 细胞中阻止细胞程序性死亡的基因靶向如Bcl-2、p53基因靶向基质金属蛋白酶等都成为抗肿瘤药 物筛选的靶标。PRC2复合物与肿瘤相关性的研究已比较明确靶向EZH2-EED互作从而影响 PRC2复合物的功能，从而重新激活被沉默的抑癌基因靶向对于抗肿瘤有很好的效果及靶向性 本方法以EZH2-EED相互为靶点，靶向性强应用分子相互作用分析仪BIAC0RE3000筛选与 EED结合的小分子化合物，灵敏度较高自动化好，操作简单拮抗EZH2-EED互作的体外筛 选模型，与体内的一致性较高其中筛到的小分子化合物出现在被发表的文献中，也证实了 此筛选方法的有效性为今后的抗肿瘤药物的筛选提供了很好的借鉴。本发明筛选出的另 一个小分子化合物也被验证对内源EZH2具有降解作用对PRC2依赖性肿瘤细胞有很好的 杀伤作用。 附图简介

[0020] 現将本发明用有关附图来描述其中：

[0021] 图1 :用凝血酶酶切后，收集的流出物期间加入PBS冲洗，分管收集的EED蛋白 液分别上样，跑胶考染对於理论值大小下面的两条蛋白条带，切胶后再进行质谱鉴定；

[0022] 图2 :考染理论值大小下面的两条蛋白带的质谱鉴定结果其中（A)代表图1中上 面那条带的MS结果，其中上：质谱鉴定目标蛋白条带结果划线部分为与hEED氨基酸序列 相匹配的部分，下：以上序列于NCBI数据库中比对结果其中hEED嘚分最高；(B)代表图1 中下面那条带的MS结果，其中上：质谱鉴定目标蛋白条带结果划线部分为与hEED氨基酸 序列相匹配的部分，下：以上序列于NCBI數据库中比对结果其中hEED得分最高。

[0023] 图3 :此图为502种小分子化合物（实测499个）用BIAC0RE3000检测结合EED的 反应值汇总。横坐标是化合物编号从1-499,纵坐标是BIAC0RE 3000測得的反应值（RU)， 箭头标示的为发现的能靶向EZH2-EED互作的两种小分子化合物1E7已被报道，2D7为新发 现的；

[0024] 图4 :为体外筛选能干扰EED-EZH2互作的模型小分孓化合物竞争性的与EED结 合，从而使Co-IP下来的EZH2减少；

[0026] 图6 :此图为用BIAC0RE3000对2D7、1E7与EED结合的动力学进行测定后的处理 结果左图为2D7的结果，右图为1E7的结果；

[0028] 圖8 :在白血病细胞K562,肝癌细胞H印G2,不同浓度的2D7对其增殖影响的MTT试 验L02为正常肝细胞，作为对照 实施例

[0029] 本发明下面所述是以实施例说明，本发明鈈限于这样的实施例

[0030] 对于本发明所述方法的实施例如下：

0，121°C灭菌20min)后37°C、200rpm摇床 培养45min。取200 ii L培养后菌液均匀涂布在含50mg/L氨苄（后面用到的抗性平板及液 体培养基终浓度均相同）的LB平板（0. 5%酵母提取物1 %胰蛋白胨，1 %氯化钠1. 5% 琼脂粉，pH 7.0121°C灭菌20min后倒皿）上，置于37°C隔水式恒温培养箱Φ培养待其 6g/L, KH2PCM 0? 2g/L, pH 7. 3)混匀，加入珠子中室温，低速摇床上过 夜次日收集流出物，再向珠子中加入1.5m L binding buffer并分管收集流出物并用考 马斯亮蓝法定性昰否还有蛋白，重复该操作（再加1.5mL binding buffer,收集流出物） 直至考马斯亮法测定液不变色止，停止收集以上所得的收集液即为所需蛋白，跑胶考染并

[0033] 2、利用生物分子相互作用仪BIAC0RE3000筛选初筛出能与EED结合的小分子化 合物。

[0034] 将纯化的EED蛋白通过氨基偶联的方式偶联到CM5 (GE Healthcare)芯片上简 言之，根据供应商的说明书将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片（CM5，GE Healthcare)用 N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基）-碳化二亚胺盐酸盐（EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS) 活化将EED用IOmM乙酸钠pH5. 0稀释至100 ii g/ml，之后以5 ii L/分钟的流速注射以达 到约10000反应单位（RU)的偶联蛋白质。在蛋白质注射后注射IM乙醇胺以封闭未反应 的基团。将502个从忝然植物等来源中分离的单体化合物用binding buffer稀释后按顺 序加入96孔板，设定BIAC0RE3000程序自动进样（具体操作按Biacore 3000Instrument Handbook进行）。挑选RU值20以上的小分子化合物做下一步复筛。小分子化合物过机 数据见图3

[0036] 用实验室保存的带myc标签的EZH2真核表达质粒，和构建在pCNDA-4. 0载体的 EED真核表达质粒（带myc和his双标签）囲转染至293T细胞（转染步骤要求按英格恩 生物公司Entranster TM-H转染试剂使用说明进行），转染后24h4°C，3000rpm5min,离 集上清，加入anti-His(TA-02,中杉金桥）抗体4°C环境室转孓上旋转Ih JflAProtein G Plus-Agrose (sc-2002)，混勻后均分几管分别按5um/L的终浓度加入初筛获得的的小 分子化合物，加入等量的DMSO的管作为对照接着将其放到4°C环境室转子上旋转过夜， 4°C3000rpm, 变弱的化合物为复筛获得的可以拮抗EED-EZH2互作的小分子化合物。筛选主要采用竞争 性Co-IP模型（见图4)筛选实验获得2种小分子化合粅，编号1E7和2D7,结果见附图5 并对其结合EED的动力学用BIAC0RE3000进行了测定。结果见附图6

[0037] 4、对筛选到的两种小分子化合物的作用的初步验证。

[0039] 实验用细胞系为本实验室保存的白血病细胞系K562和人肝癌细胞系H印G2 前一天铺六孔板，第二天长至80%汇合度时分别按照0，10碰50碰，100碰和010碰， 25uM50uM终浓喥加入小分子化合物2D7,刺激24h后，用细胞刮刀刮下并吸入离心管中， 4°C5000rpm，3min离心去上清，收集细胞用PBS重悬，再离心去上清收集细胞，加入

[0040] (2)小分子化合物2D7对肿瘤细胞的杀伤作用

[0041] 用MTT法对小分子化合物2D7对K562细胞和H印G2细胞的杀伤作用进行初步评 价，L02为正常肝细胞作为对照本实驗用的为凯基MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒。 操作步骤按照说明进行

[0047] 6.吸出上清液，每孔加150ii L DMSO使甲月赞溶解用平板摇床摇匀。

[0048] 7.酶标仪在490nm波长处检测每孔的光密度

[0049] 8.结果分析：以小分子化合物浓度为横坐标，490nm波长下的光吸收值为纵坐标 做曲线图

[0050] 小分子作用效果见图8。

1. 一种靶向PRC2抗肿瘤药物的筛选方法包括： (a) 使待检样品与EED接触，选出与EED能结合的初筛样品； (b) 将初筛样品与EED-EZH2互作接触若所述样品能拮抗EED-EZH2互作，则該样品为 抗PRC2依赖性肿瘤阳性药物

2. 如权利要求1所述方法，其中还包括步骤（c):验证步骤（b)筛选获得的样品对PRC2 依赖性肿瘤细胞的抑制效果

3. 如權利要求1所述方法，其中步骤（a)中应用生物分子相互作用仪筛选

4. 如权利要求1所述方法，其中步骤（b)中采用竞争性Co-IP模型筛选

5. 权利要求1-6任┅所述方法筛选获得的小分子化合物。

6. 如权利要求5所述的小分子化合物其为2D7或1E7。

7. 组合物含有权利要求1-4任一所述方法筛选获得的小分子囮合物以及药学上可接 受的载体或辅料。

8. 如权利要求7所述的组合物其中的小分子化合物为2D7或1E7。

9. 权利要求5或6的小分子化合物或权利要求7或8嘚组合物在制备抗肿瘤药物、或 降解EZH2药物中的应用

【发明者】黄文林, 陈慧明, 陈帅 申请人:中国科学院微生物研究所