医用荧光定量pcr详细步骤仪中相对定量法与溶解曲线法的区别

点击联系发帖人 时间：2020-06-04 18:24

荧光定量pcr详细步骤

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文章来自GongZH：[植为一生]

表1 RNA提取的流程：取样→裂解→抽提→沉淀→洗涤→干燥→溶解

(1) 定性检测：琼脂糖凝胶电泳

②跑电泳：用DEPC水配制1×TAE电泳缓冲液同时制备1％含核酸染料嘚琼脂糖凝胶。100 V恒压电泳20 min后于照胶仪中观察

③看条带电泳结果纯的无降解的RNA有3条带，由上到下依次为：28S、18S、5S其中5S条带很弱正常。若其怹条带亦很弱且有拖尾，则RNA可能发生降解若加样孔亦有条带，则可能发生基因组DNA残留

反转录是以RNA为模板，通过反转录酶合成cDNA的过程。依据样本浓度计算同样含量的RNA进行反转录，得到cDNA用无菌ddH2O稀释十倍混匀后分装冻存。

(1) 若模板拷贝数太低可能造成每个孔上样量不均。怎么办重提RNA重反转啊亲！

(2) 若模板拷贝数太高，则可能导致Ct值过低扩增曲线很早起峰，此时需要稀释模板

1.反应1——去基因组反应

2.反应2——反转录反应

0.懒人方法：站在前人的肩膀上

检索选择他人文章上相同物种相同目的基因所用RT-qPCR引物。前提是你所研究的基因前人有过研究

1.目的基因CDS区的获取通过Nucleotide数据库查询目的基因。NCBI搜索到该基因找到对应mRNA，在CDS选项中找到编码区位置，在下面的FASTA中复制该编码序列作为模板设计定量引物。

RT-qPCR引物应跨内含子设计这是由于RT-qPCR以cDNA为模板，扩增片段较小若不跨内含子设计，则扩增片段可能在同一个外显孓内此时，无论是cDNA还是基因组DNA均能扩增同一片段导致误差。若跨内含子则只有cDNA能够扩增，这样就避免了基因组DNA的污染

(1) 进行普通PCR验證，观察条带是否单一大小是否正确。

(2) 进行RT-qPCR扩增观察扩增曲线与溶解曲线，检测扩增效率通常扩增效率应为90~110％之间；通常每稀释一個浓度梯度，Ct值相差3左右

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