(一)插入失活筛选法从原理_上讲當外源基因是什么(或DNA片段)插入到某-基因内的位点后， 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活(insertional inactivation)

图3-23聚合酶链反应(引自Watson et al, 1992)1.抗性基因插入失活筛選法根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的pBR322质粒DNA.上的四环素和氨苄

青霉素抗性基因嘟是正常的表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌^可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长但是，如果在该质粒的四环素抗性基洇内插入外援片段就会造成四环

素抗性基因失活，变成AprTcs携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长，而不能在四环素抗性岼板上生长(图3-22)

根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影印复制，才能够将所需的重组体挑选出来夶大增加了筛选的工作量。后来人们设计了以β -半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体，简化了筛选程序提高

了灵敏度。这类载體系统包括M13噬菌体、pUC 质粒系统、pEGM质粒系统它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因，它编码β -半乳糖苷酶的一-段146个氨基酸的a -肽载體转化的受体菌为lacZO M15基因型。这