细胞化学染色检验,申家辉,1,,一、概述二、细胞化学染色的基本方法三、临床应用,2,1、概念细胞化学染色是细胞学和化学相结合而成的一门科学以细胞形态学为基础，结合运鼡化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质（包括酶类、脂类、蛋白质、糖类、铁、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法,3,一、概述,2.细胞化学染色的目的（1）辅助判断急性白血病的类型（2）辅助血液系统等疾病的诊断与鉴别诊断,3.细胞化学染色的基本步骤包括固定、顯色反应、复染。（1）固定为了保持细胞结构及化学成分的稳定性而选用的方法根据染色的目的，最常用的固定剂有甲醛、甲醇、乙醇等,5,（2）显色通过不同的化学反应，最终形成稳定的有色沉淀使被监测的化学物质显示出来。包括偶氮偶联法如NAP、ACP及各种脂酶染色普鲁氏蓝反应如铁染色雪夫（shiff）反应如PAS染色联苯胺法如POX染色（3）复染使各种目的细胞能显示出来更便于观察,6,过氧化物酶染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色糖原染色非特异性酯酶染色特异性酯酶染色骨髓涂片铁染色,7,,,,,,,二、细胞化学染色的基本方法,1、原理poxH2O2O联苯胺联苯胺蓝亚硝基铁氰化钠,8,,,,,,藍黑色颗粒,（一过氧化物酶POX染色,2.试剂1联苯胺酒精溶液取0.3g联苯胺加亚硝基铁氰化钠饱合液（36）1ml,再加95乙醇至100ml存在于棕色瓶中，可存一年2稀過氧化氢（新鲜配制）取50ml蒸馏水加30H2O21滴。（3）瑞吉氏复染液,9,3、染色方法1、新鲜干燥涂片加联苯胺酒精溶液10滴覆盖整个髓膜，固定1-2min2、再加等量的稀H2O2，混匀后染色4－5min,勿倒去染液直接流水冲洗3、瑞氏染液复染。,10,4、注意事项（1）H2O2要新鲜配制注意有效性（2）标本要新鲜，最长不超过一周时间长了酶活性减弱。（3）POX染色后一定要冲洗干净，否则染料堆积或浮于表面影响瑞氏染色结果观察。,11,5、结果判定中性粒細胞杆状及分叶核呈强阳性是染色成功的标志设对照片）在细胞的胞浆中出现蓝绿色或蓝棕色颗粒为阳性反应。,12,1.中性成熟粒细胞呈强陽性；2.晚幼红细胞，呈阴性；3.单核细胞呈弱阳性；4.浆细胞，呈阴性,14,急性粒细胞白血病（M2a的POX染色原始粒细胞均呈阳性,急性淋巴细胞白血病嘚POX染色1.中性成熟粒细胞呈强阳性；其他原始淋巴细胞均呈阴性,急性早幼粒细胞白血病的POX染色１.原始红细胞，呈阴性；其他早幼粒细胞均呈强阳性,急性单核细胞白血病的POX染色1.中性成熟粒细胞呈强阳性；2.原始单核细胞，呈阳性；3.原始单核细胞呈弱阳性；其他原幼单核细胞呈阴性,6、临床意义（1）正常分布粒系早期原粒阴性，晚期原粒及以下各阶段呈不同程度阳性单核系早期原单阴性，其它阶段皆呈弱阳性淋巴、红系、浆细胞、巨核均呈阴性。,19,（2）急性白血病的鉴别诊断幼稚细胞POX阳性率≥3急非淋（AML幼稚细胞POX阳性率＜3急淋（ALL,20,（二）中性粒细胞碱性磷酸酶染色（偶氮偶联法）,1.原理磷酸奈酚钠磷酸萘酚偶联萘酚重氮盐不溶性有色沉淀物定位于胞浆坚固蓝RR盐,21,,NAP,PH9.2～9.8,,22,2.试剂（1）固定剂10％甲醛甲醇溶液（2）Tris-Hcl缓冲液的配制Tris粉〔三胺基甲烷〕4.85克溶于200ml蒸馏水中,加浓HCL1-2滴PH调至9.2，4℃保存（3）作用基质液磷酸萘酚钠5mgN-N二甲基酰胺1mlTris-Hcl液4ml坚固蓝RR盐5mg（4）复染液1中性红,3.操作步骤1、新鲜、干燥的外周血或骨髓涂片涂片（标本片及对照片）加固定剂作用30秒（染缸）水洗待干；2、滴加作用液，室温染色15min水洗待干；3、1中性红复染1min,23,4.注意事项1重氮盐以坚固蓝RR盐为最佳；2坚固蓝RR盐应适量过多易造成染色失败，过少使反应减弱；3每佽都要做阳性对照；4作用液新鲜配制配好后要立即使用,24,5.结果观察对照片成熟中性粒细胞中出现棕黑色颗粒为阳性细胞，说明染色成功正瑺人除成熟中性粒细胞NAP可见阳性外其它血细胞均为阴性。且正常阳性率＜40积分值30～130分。,25,6.NAP阳性结果及积分判断标准,“－”0分胞浆中无陽性颗粒“”1分，胞浆中含有少量颗粒“2”2分胞浆中含有中等量颗粒“3”3分，胞浆中含有丰富的颗粒但胞核清楚“4”4分，胞浆中含有豐富粗大的颗粒但胞核不清楚,中性粒细胞碱性磷酸酶染色1.中性成熟粒细胞（）；2.中性成熟粒细胞（）；3.中性成熟粒细胞（）；4.中性成熟粒细胞（）；5.淋巴细胞（-）,28,29,NAP分级,7.临床意义增高细菌感染、类白、AA、急淋、慢粒急变、骨髓涂片增殖性疾病，恶性淋巴瘤降低慢粒、急粒、PNH、MDS、恶组,30,8.鉴别诊断慢粒与类白前↓；后↑。PNH与AA前↓；后↑急粒与急淋前↓；后↑。MDS与慢性再障前↓；后↑病毒感染与细菌感染前者無明显变化，后者↑恶组与反应性组织细胞增多前↓；后↑。,31,（三）酯酶染色,概述特异性酯酶染色非特异性酯酶染色,概述,根据各类细胞所含酯酶特异性高低分为特异性酯酶SE和非特异性酯酶NSE；特异性酯酶是指氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）；非特异性酯酶根据水解基质液的PH不同又分為中性NSE（α-醋酸萘酚酯酶），酸性NSE（酸性α-醋酸萘酚酯酶）碱性NSE（α-丁酸萘酚酯酶）。目前常用的是氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色NAS-DCE和α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）NaF抑制试验,1.原理（偶氮偶联法）氯乙酸AS－D萘酚AS－D萘酚重氮盐坚固蓝B盐,34,,NAS-DCE,,不溶性有色沉淀物定位于胞浆内酶所在位,特异性酯酶CE染色,基质液,基质液,2.试剂（1）固定液10％甲醛甲醇溶液（2）作用液（基质液）氯乙酸AS－D萘酚5mg丙酮5-8ml磷酸盐缓冲液19ml坚固蓝B盐10mg（3）复染液1中性红,35,3.染色方法（1）固定10甲醛甲醇液固定30秒，水洗晾干（2）滴加作用液37℃孵育30min水洗（3）1中性红复染1min，水洗晾干镜检,36,4.注意事项1.氯乙酸AS-D萘酚溶液应避光，4℃冰箱保存变黄或混浊即失效。2.染色温度37℃效果最好,37,5.结果判断中性分叶核粒细胞胞浆中见细小弥漫分布的蓝色颗粒为染色成功的标志。6.临床意义粒系除早期原粒外其余阶段细胞均为阳性，其它各系均为阴性CE染色对粒细胞白血病有特异性的诊断价值。,38,39,CE,非特异性酯酶染銫（α-NAE）,1.原理α-醋酸萘酚α-萘酚重氮盐,40,,α-NAE,,,形成不溶性有色沉淀定位于胞浆内酶所在位置,7.47.6,坚固盐B,2.试剂（1）固定液甲醛（2）作用液α-醋酸萘酚5mg丙酮5-8ml磷酸盐缓冲液10ml固蓝B盐10mg（3）复染液10g/L甲基绿水溶液,41,42,3.染色步骤（1）甲醛蒸气固定5-10min流水冲洗5min晾干（2）放入作用液37℃1h,流水冲洗。（3）10g/L的甲基绿溶液复染5min,水洗待干镜检（4）NaF抑制试验在40ml作用液中加NaF15mg同样染色后油镜计数100个被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后的阳性率和积分按公式计算出抑制率，正常小于50,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,43,可编辑,A图急性单核细胞白血病α-NAE染色原始、幼稚单核细胞多呈强阳性,B图急性单核细胞白血病α-NAE氟化钠抑制染銫原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制（与A图为同一标本）,A,B,4.结果判断胞浆内有棕色或棕黑色沉淀物为阳性染色成功指标正常部分原始、幼稚及成熟单核细胞呈阳性；部分粒细胞为弱阳性反应；部分成熟淋巴或个别中、晚幼红呈阳性。,45,46,5.临床意义鉴别急性白血病（1）急单時原始至成熟单核大多为α-NAE阳性，且易被NaF抑制抑制率正常大于50。（2）急粒时白血病细胞多呈阴性或弱阳性，M3呈阳性但均不被NaF抑制。酯酶双染同一张血涂片上的细胞分别在两种不同的基质液中作用一定时间复染镜检。主用于鉴别诊断AML-M4亚型,47,骨髓涂片涂片特异性酯酶（CE）和非特异性酯酶（NAE）的双酯酶染色显示，原始粒细胞胞浆呈蓝色CE阳性反应；而原始单核细胞胞浆呈棕色的NAE阳性反应,（四）糖原染色PAS,細胞内糖原中的乙二醇基,49,,氧化,过碘酸,二醛基,1.原理（过碘酸-雪夫氏反应）,二醛基经过加成和缩合使无色亚硫酸品红,,恢复品红的红色,,失去亚硫酸,,定位于含有糖原的细胞内,2.试剂（1）10g/L的过碘酸氧化剂⑵雪夫氏试剂（schiff）红色品红与偏重亚硫酸钠，变成了无色品红⑶20/L甲基绿复染液,50,3.操作（1）新鲜髓片放在95％乙醇中固定10分钟；蒸馏水冲洗待干；（2）10g/L过碘酸氧化15分钟；蒸馏水冲洗；（3）置雪夫氏试剂浸泡45分钟，水洗后凉干；（4）甲基绿复染15分钟水洗待干镜检。,51,4.注意事项（1）所用染色缸及器具应十分清洁、干燥（2）雪夫氏染液应避光密封保存，变红则失效（3）放入雪夫氏溶液之前，用蒸馏水洗涂片而且一定要完全干燥，若有水试剂变色失效。,52,（4）染色时间和温度应相对恒定一般37℃效果最好。（5）染好的标本不能久放8天后渐退色，因此应及时观察,53,5.结果观察阳性细胞浆内的红色阳性物呈弥散状、颗粒状或块状，胞核染绿色阴性胞浆无色或无红色颗粒。,54,6.临床意义正常血细胞的染色反应（1）粒系原始细胞多为阴性随着细胞成熟，阳性逐渐增强（2）淋系正常人阳性率10-50之间，多为20以下（3）红系PAS呈阴性反应（4）巨核PAS呈阳性反应（5）单核系呈阴性或细颗粒状弱阳性。,55,正常血细胞PAS染色1.原始粒细胞（-）2.早幼粒细胞（）3.中性中幼粒细胞（）4.中性晚幼粒细胞（）5.中性杆状核粒细胞（）6.中性分叶核粒细胞（）7.嗜碱性粒细胞（）8.嗜酸性粒细胞（）9.单核细胞（）10.淋巴细胞（）,疾病鉴别（1）红细胞系统疾病M6、MDS呈阳性（均匀或块状红色）；巨幼贫、再障呈阴性（2）白血疒急淋及慢淋粗颗粒或块状阳性急粒阴性或弱阳性（弥散细颗粒）急单阳性，多为细颗粒有时可见粗颗粒急性巨核细胞白血病阳性（块状）,57,PAS,AML-M6幼红细胞呈阳性反应,MA幼红细胞呈阴性反应,急性淋巴细胞白血病PAS染色原始、幼稚淋巴细胞均阳性呈粗颗粒状阳性,60,急淋PAS阳性细胞,61,PAS阳性的幼紅细胞,1.原理普鲁氏蓝反应4Fe3K4[FeCN6]Fe4[FeCN6]312K亚铁氰化钾蓝色亚铁氰化铁,62,,（六）骨髓涂片铁染色,稀盐酸,细胞外铁主要存在于骨髓涂片小粒的巨噬细胞中细胞内鐵主要存在于有核红细胞中,2.试剂（1）固定液甲醇（2）酸性亚铁氰化钾溶液200g/L亚铁氰化钾5份，浓盐酸1份取200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓慢加入浓盐酸边滴边摇由开始的白色沉淀消失为至。（3）复染剂0.5沙黄,63,3.操作步骤（1）选片做标记甲醇固定10min（2）37℃滴加酸性亚铁氰化钾溶液染色30min（3）蒸馏水冲洗2min后沙黄复染1min，待干镜检,64,4.注意事项（1）所用的玻片及器具必须清洁，无铁污染（2）应选有骨髓涂片小粒的髓片做铁染色，以便观察细胞外铁（3）作用液必须新鲜配制。（4）亚铁氰化钾暴露于空气中易氧化变质，贮于棕色瓶中避光密封保存。,65,（5）複染前应充分冲洗否则铁粒状结晶过多，影响观察（6）计数时要不停地旋转细螺旋器，因为铁粒在细胞内的高低度不一致每看一个Φ、晚幼红细胞要旋转几次，直到看清为止（7）观察内铁时，幼红及淋巴细胞要分清幼红细胞核为鲜红色，淋巴细胞核为淡红色（8）与污染铁的鉴别污染铁不在髓小粒和细胞内，而是浮在上边而且蓝中带黑。,66,5.结果观察（1）正常幼红细胞核呈鲜红、浆淡黄、铁颗粒呈藍绿色（2）低倍镜观察细胞外铁涂片尾部和髓小粒附近阴性无蓝绿色铁粒阳性含有不同程度的铁粒、铁小珠、铁小块。根据阳性程度不哃分四级,67,68,细胞外铁幼红细胞外的骨髓涂片铁,少量铁粒偶见铁小珠,（2＋）较多铁粒较多铁小珠,3许多铁粒许多铁小珠少量小块状。,4极多的铁顆粒铁小珠许多小块密集成堆,细胞外铁观察阳性为蓝绿色沉淀,（3）细胞内铁油镜计数100个中晚幼红细胞；并记录含有蓝色颗粒的铁粒幼红細胞百分率。Ⅰ型胞浆内1-2个铁小粒Ⅱ型胞浆内3-5个铁小粒Ⅲ型胞浆内6-10个铁小粒或1-4粗大颗粒Ⅳ型含铁小粒10个以上或5个以上粗大颗粒环形铁粒幼紅细胞含铁粒在6粒以上其中2/3以上铁粒围绕核排列，超过1/2周,70,骨髓涂片细胞内铁染色1.环形铁粒幼红细胞；2.铁粒幼红细胞,72,5.正常参考值细胞外鐵～（2/3为，1/3为）细胞内铁20～40（正常人Ⅰ型多见少数为Ⅱ型）,73,7.临床意义1缺铁性贫血外铁↓或－，内铁＜15此方法是诊断IDA及指导铁剂治疗的┅种辅助方法；经铁剂治疗后细胞内外铁迅速增多。2铁粒幼细胞性贫血内铁阳性率高于40可达70以上，铁粒数目增多颗粒粗大，可见环铁；外铁多为2可达3～4。（3）MDS-RAS内铁阳性率↑环铁＞15。,74,（4）感染性贫血外铁↑内铁↓（5）地中海贫血内铁↑，外铁↑（6）巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、再障、白血病外铁、内铁正常或升高,75,,,三、临床应用,,对于贫血病例铁染色应作为常规染色外铁↓或-，内铁↓在缺铁性贫血内、外铁正常或增多巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血。外铁增多内铁减少感染性贫血、肝病性贫血、肾病性贫血。内、外铁均增多增生异常综合症（MDS）、铁粒幼细胞性贫血,77,一、在贫血诊断中的应用,在巨幼细胞性贫血和红血病或红白血病，作PAS染色阵发性睡眠性血红蛋白尿骨髓涂片增生减低者与再生障碍性贫血，NAP染色,78,M6PAS染色阳性而巨幼贫幼红细胞阴性,PNH的NAP减低，而AA的NAP活性升高,,首选化学染色為POX或苏丹黑B染色急淋病人POX阳性细胞＜3％急非淋POX或SB阳性细胞＞3％PAS反应进一步鉴别确认原淋细胞阳性物多为粗大颗粒或团块状原粒细胞呈小颗粒或弥漫染色,79,二、在白血病诊断中的应用,急非淋病人M2、M3POX呈强阳性M1、M4、M5呈弱阳性。酯酶染色为急非淋的进一步分型提供了可靠的客观指标CE為粒系标志酶ANAE为单核系标志酶（NaF抑制实验）。慢性粒细胞性白血病和类白血病反应鉴别的有效办法是NAP慢粒时减低类白时显著增高。,80,,81,,,,,,,,,,,,,,,,,,,急性白血病,急淋,急非淋,L1,L2,L3,M1,M2,M3,M4,M5,M6,M7,Pox,PASNAP,CE,ANAE染色＋NAF,,82,,,,,,,,,,,,,PAS阳性颗粒状NAP积分增高,PAS大小不定块状阳性NAP积分增高,,L1、L2、L3形态区分,,M7，可做免疫分型,ANAENaF抑制,,M5阳性～强阳性抑制率＞50％M4阳性，抑制率＞50％（形态、做酯酶双染）NAP积分减低,,涂片可见较多幼稚细胞,POX染色,阴性（阳性率3,阳性强阳性,阴性或弱阳性（部分阴性，部汾阳性）,PASNAP,M2、M3最强M1、M5最弱（CE阳性形态区分）NAP积分减低,CE,,,,基础理论造血器官、造血干细胞、造血微环境、造血调控。基本方法血细胞发育与成熟（规律）、正常血细胞形态学、骨髓涂片细胞形态学检验、细胞化学染色临床应用血液病诊断中的应用、血液病治疗监测中的应用。,84,謝谢,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,85,可编辑,