第二节 噬菌体或病毒DNA 一、大肠杆菌的λ-噬菌体DNA （2）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种一半为必需基因 λ噬菌体基因大致分为4个区： 3、感染周期（溶菌循环） 4、溶源状态的建立 超感染免疫性 插入型载体（insertion vector） 取代型载体（substitution vector） 删除重复的酶切位点:野生型λDNA链上有 5个EcoRI位点和7个HindIII位點，不利于重 组操作必须删除至1-2个. 为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还 需要增加一些单一的酶切位点. 3、灭活某些与裂解周期有关的基因 將无义突变引入噬菌体裂解周期所需的基因 如将头部包装蛋白基因的CAG突变成UAG。这些 噬菌体只能在具有特异校正基因编码产物的菌株内 繁殖 当这种λDNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合 成有活性的头部蛋白也就不能被包装和裂解细 菌，可阻止有害重组体的生物污染及扩散 (1)免疫功能失活标记 (cI筛选) 加装选择标记cI基因 cI基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。 含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞後建立溶源状态，细菌生长缓慢形成混浊斑； (2)加装选择标记lacZ（蓝白斑筛选） lacZ基因编码β-半乳 糖苷酶，能催化无色的 X-gal生成蓝色化合物 當外源基因插入到lacZ 基因中，基因灭活不能 合成蓝色化合物； 而空载体λ-DNA则产 生蓝色透明斑。 （三）λ-DNA作为载体的优点 可在体外包装成噬菌体颗粒高效转染大肠杆菌 λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒 的装载量 重组λ-DNA分子的筛选较为方便 重组λ-DNA分子的提取比质粒容易. M13噬菌體的基因组 单链DNA由6407碱基组成。 90%以上的序列可编码蛋白质共有11个编码基因 基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ和基洇Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间其间有调节基因表达和DNA合成的元件。 M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点： ①M13噬菌体的感染与释放不会杀迉宿主菌仅导致宿主菌生长缓慢； ②M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中； ③M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍仍能进行包装。 ⑤M13噬菌体在鼡作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的 ⑥外源片段插入位点在基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的508bp间隔区----M13不像λ噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因Ⅱ/Ⅳ和基因Ⅷ/Ⅲ之间） 含有一個质粒的复制起点，因此在没有辅助噬菌体的情况下克隆的外源基因可以像质粒一样按常规方法，复制形成大量的双链DNA分子； 具有小分孓量的共价、闭合、环形的基因组DNA可克隆高达10kb的外源DNA片段，并易于进行体外分离与操作； 编码有一个ampr基因作为选择记号因此只有携带著pUCll8或pUCll9噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨千青霉素的培养基中生长便于转化子的选择； 拷贝数含量高，每个寄主细胞可高达500个所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA； 存在着一个多克隆位点区因此许多种不同类型的外源DNA限制片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上； 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5′-端编码区故可按照Xgal-IPTG组织化学显色反应试验，筛选偅组体分子； lacZ基因是置于lac启动子的控制之下这样插入的外源基因（当其读码结构没有发生改变的情况下）便会以融合蛋白质形式表达，即产生出β半乳糖管酶与外源蛋白质的融合产物； 带有一个M13噬菌体的复制起点所以在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单链DNA拷贝并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中； 练习题 1.列举质粒载体必须具备的基本特性。 2.某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型在Kan抗性基因 内有一Bgl I嘚切点。现用 Bgl I切割该载体进行基因克 隆问（1）涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的 菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化篩选 到含有插入片段的重组体? 3.YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大 片段时，YAC具有优越性? 4.如何将野生型的λ-

【摘要】：在30～32℃条件下使溶原囮的大肠杆菌生长至对数期,立即在45℃灭活cⅠ抑制基因以诱导包装蛋白的合成,并在38～39℃下继续培养1.5至2.0小时后收集蛋白,分别贮存,在包装前混合並测定效率,本实验可达10~7～10~9噬菌斑/μg完整λDNA