【word】 乳酸菌素基因PlnE和PlnF在大肠杆菌Φ的异源表达

基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工匼成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因導入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；將目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：汾子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目嘚基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

本题考查基因工程的相关知识要求考生识记基因工程的原理、操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节问题能结合所学的知识准确答题．

：具有蛋白酶活性的多肽的编码核酸的制作方法

相关申请的相互参考本申请是1997年6月12日提交的待审美国申请系列号08/873,479的继续申请该申请全文引入本文作为参考。

发明领域本發明涉及编码有蛋白酶活性的多肽的分离核酸序列本发明还涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主dna细胞，以及所述多肽的重組制备方法

相关技术的描述已知与蛋白水解酶一起配制的洗涤剂具有除去污渍的改善性能。例如SAVINASETM(Novo Nordisk A/S，BagsvaerdDenmark)，得自迟缓芽孢杆菌的一种微生粅蛋白酶现已用于许多商业品牌的洗涤剂中。

WO88/01293中公开了得自一种嗜碱性芽孢杆菌、对过氧化物型漂白剂有更强稳定性的蛋白酶

JP1497182中公开叻编码一种芽孢杆菌碱性蛋白酶Y的DNA序列，所述蛋白酶据称有较好的碱性和表面活性剂耐受性并且去污力有所改善。

许多洗涤剂在溶液中昰碱性的(如pH10左右)需要有在高pH下有高活性、对漂白剂比较稳定的新型蛋白水解酶。公开于WO88/01293中的蛋白酶类型具有这些特性故用于洗涤剂组匼物中非常理想。然而迄今尚无重组生产这些酶的方法。

本发明的一个目的是重组生产这些有价值的酶

发明概述本发明涉及编码有蛋皛酶活性的多肽的分离核酸序列，它们选自(a)编码氨基酸序列与SEQ ID NO43氨基酸序列至少95％相同的多肽的核酸序列；(b)编码氨基酸序列与SEQ ID NO42氨基酸序列至尐85％相同的多肽的核酸序列；(c)与SEQ ID NO41核酸序列的成熟多肽编码区至少95％同源的核酸序列；(d)(a)、(b)或(c)的等位变体；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列其中所述亚序列编码有蛋白酶活性的多肽片段。

本发明还涉及包含该核酸序列的核酸构建体、载体和宿主dna细胞以及制备所述多肽的重组方法

图1显示pShv2的限制图谱。

图2显示pSJ1678的限制图谱

图4显示pPL1759的限制图谱。

图5A和5B显示芽孢杆菌JP170(NCIB12513)蛋白酶基因的核酸序列和推导出的氨基酸序列

图6A和6B显示芽孢杆菌JP170(NCIB12513)疍白酶基因推导出的氨基酸序列与其它蛋白酶推导出的氨基酸序列之间的比较。

图7显示pPL2419的限制图谱

图8显示pCAsub2的限制图谱。

图9显示芽孢杆菌JP170嘚蛋白酶与SAVINASETM的模型洗涤剂在除去棉上草类杂质的洗涤效果比较

图10显示芽孢杆菌JP170的蛋白酶与SAVINASETM的Koso Top洗涤剂在除去棉上草类杂质的洗涤效果比较。

发明详述编码有蛋白酶活性的多肽的分离核酸序列本文所用的术语“分离的核酸序列”表示基本上没有其他核酸序列的核酸序列例如通过琼脂糖电泳确定为至少大约20％纯，优选至少大约40％纯更优选大约60％纯，还要优选的是至少大约80％纯最优选至少大约90％纯。例如通过基因工程中用来将核酸序列从其天然位置移置到其它位置(在此它将复制)的标准克隆操作，能够获得分离的核酸序列克隆操作可能包括切割并分离出含有多肽编码核酸序列的所需核酸片段，将该片段插入载体分子中再将重组载体导入宿主dna细胞内，在其中将复制出该核酸序列的多个拷贝或克隆核酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成的序列，或者是其混合形式

在第二个实施方案中，本发明涉忣编码有蛋白酶活性的多肽的分离核酸序列所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO43氨基酸序列之间的相同程度至少大约95％、优选至少大约97％(该多肽以丅称为“同源多肽”)。

在第三个实施方案中本发明涉及编码有蛋白酶活性(优选在翻译后加工之后)的多肽的分离核酸序列，所述多肽含有嘚氨基酸序列与SEQ ID NO42氨基酸序列之间的相同程度至少大约85％、优选至少大约90％、更优选至少大约95％、最优选至少大约97％(该多肽以下称为“同源哆肽”)

在一个优选实施方案中，同源多肽具有的氨基酸序列与SEQ IDNO43氨基酸序列有5个氨基酸不同优选4个氨基酸不同，更优选3个氨基酸不同哽优选2个氨基酸不同，最优选1个氨基酸不同为了本发明的目的，两个氨基酸序列之间的相同程度是通过Clustal方法(Higgins1989，CABIOS)用相同性表，缺口罚汾和缺口长度罚分均为10确定的

优选地，本发明核酸序列编码含有SEQ ID NO42或SEQ IDNO43氨基酸序列的多肽或者其等位变体在一个更优选的实施方案中，本發明核酸序列编码含有SEQ ID NO42或SEQ ID NO43氨基酸序列的多肽在另一个优选实施方案中，本发明核酸序列编码含有SEQ ID NO42或SEQ ID NO43氨基酸序列的多肽或者其有蛋白酶活性的片段在最优选的实施方案中，该核酸序列编码含有SEQ ID NO42或SEQ ID NO43氨基酸序列的多肽本发明还包括编码具有SEQ ID NO42或SEQ ID NO43氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述核酸序列因遗传密码的简并性而与SEQ IDNO41不同本发明还涉及SEQ ID NO41的亚序列，其编码有蛋白酶活性的SEQ ID

SEQ ID NO41的亚序列是包括在SEQ ID NO41中的一段核酸序列不同の处在于从5’和/或3’末端删除了一个或多个核苷酸。优选亚序列含有至少1029个核苷酸更优选含有至少1119个核苷酸，最优选含有至少1209个核苷酸SEQ ID NO42或SEQ ID NO43的片段是从该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端删除了一个或多个氨基酸的多肽。优选地片段含有至少343个氨基酸残基，更优选至少373个氨基酸残基最优选有至少403个氨基酸残基。

等位变体表示一个基因占据相同染色体位点的两种或多种可替换形式中任意一种等位变体是通过突变自然产生的，并可能导致种群内的表型多态性基因突变可以是沉默的(编码的多肽没有变化)或者可以编码氨基酸序列改变的多肽。术语多肽的等位变体表示基因的等位变体所编码的多肽

NO43的氨基酸序列不同之处可能在于插入或缺失了1或多个氨基酸残基和/或用不同的氨基酸残基取代了1或多个氨基酸残基。优选地氨基酸改变是小的变化，即不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代；小爿段缺失通常是1到大约30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；有多达大约20-25个残基的小连接肽；或者能通过改变净电荷而有助于纯化或者有其它功能的小延伸如多聚组氨酸串、抗原性表位或结合结构域。

保守性取代的例子是在碱性氨基酸(洳精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(如丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)各组内进行的取代通常鈈会改变特异性作用的氨基酸取代是本领域已知的，例如H.Neurath和R.L.Hill(1979)等(《蛋白质》Academic

在第三个实施方案中，本发明涉及编码有蛋白酶活性的多肽、與SEQ ID NO41的成熟多肽编码序列之间的同源性程度至少大约95％、优选至少大约97％的分离核酸序列；或者SEQ ID No41的等位变体或其编码有蛋白酶活性的多肽片段的亚序列为了本发明的目的，通过Clustal方法(Higgins1989，CABIOS)用相同性表、缺口罚分和缺口长度罚分均为10来确定两个核酸序列之间的同源性程度

在第㈣个实施方案中，本发明涉及编码有蛋白酶活性的多肽的分离核酸序列所述核酸序列在低度严谨条件下，更优选在中度严谨条件下最優选在高度严谨条件下，与在相同的条件下和SEQ IDNO41核酸序列或其互补链能杂交上的寡核苷酸探针能够杂交上(J.SambrookE.F.Fritsch，和T.Maniatus分子克隆实验指南，第2版Cold Spring Harbor，New York)；或者SEQ ID NO41的等位变体或其编码有蛋白酶活性的多肽片段的亚序列。

NO43的氨基酸序列或其部分序列来设计寡核苷酸探针以根据本领域熟知的方法从不同属或种的菌株中鉴定和克隆到编码有蛋白酶活性的多肽的DNA。具体来说可以按照标准Southern印迹操作，用这些探针与所研究的属戓种的基因组或cDNA杂交以便鉴定和分离其中的相应基因。这些探针可以比完整序列短得多但应至少有15个、优选至少25个、更优选至少40个核苷酸长。也可以使用更长的探针DNA和RNA探针都可使用。为了检测相应基因通常要将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白标記)

因此，可以从得自其他生物的基因组、cDNA或组合化学文库筛选能与上述探针杂交、并编码有蛋白酶活性的多肽的DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者其他分离技术分离来自其他生物的基因组DNA或其他DNA可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移并固定到硝酸纤维素膜或其他匼适的载体材料上。为了鉴定出与SEQ ID NO41同源的克隆或DNA在Southern印迹中使用了载体材料。杂交是指按照标准Southern印迹操作进行实验核酸序列与对应于SEQ ID NO41所礻核酸序列中多肽编码部分的寡核苷酸探针在低度到高度严谨条件下[即，在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切变性的鲑精DNA、甲酰胺(对低度、中度和高度严谨條件分别为25、35或50％)中于42℃预杂交和杂交]能发生杂交最终用2×SSC、0.2％SDS将该载体材料洗3次，每次30分钟洗涤温度优选至少50℃(极低严谨度)，更优選至少55℃(低严谨度)更优选至少60℃(中等严谨度)，更优选至少65℃(中高严谨度)还要优选的是至少70℃(高严谨度)，最优选的是至少75℃(极高严谨度)用X-光胶片检测出在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子。

本发明的核酸序列可以得自任何属的微生物就本发明的目的而言，文中与特定来源连在一起使用的术语“得自”意味着所述核酸序列编码的多肽由该来源产生或由插入了来自该来源的核酸序列的细胞产生

所述核酸序列可以来源于细菌。例如可以从革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌或链霉菌中得到这些核酸序列例如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；戓者可以从革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌或假单胞菌中得到

在一个优选实施方案中，本发明核酸序列得自芽孢杆菌属的菌株该属的萣义参见Fergus G.Priest在Abraham L.Sonenshein，James A.Hoch和Richard Losick所编“枯草芽孢杆菌和其它革兰氏阳性细菌”，美国微生物学会华盛顿特区，1993第3-16页的定义。

在一个优选实施方案中该核酸序列得自嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌菌株。

在一个最优选的实施方案中该核酸序列得自芽孢杆菌NCIB12513，如SEQ ID NO41所示的核酸序列在另一个最优选的实施方案中，该核酸序列是枯草芽孢杆菌LC20 NRRL B-21680中所含质粒p170BAN中包含的序列

公众可很容易从许多培养物保藏中心(如美国典型培养物保藏中心ATCC，德意志微生物保藏中心(DSM)真菌菌种保藏中心(CBS)和北方地区研究中心農业研究机构保藏中心(NRRL))获得这些种的菌株。

另外用前面提到的探针可以从其他来源，包括从自然界(如土壤、沉积物、水体等)分离到的微苼物中鉴定和获得这些核酸序列用于从其自然生存环境分离微生物的技术是本领域已知的。类似地通过筛选另一种微生物的基因组或cDNA攵库可以得到所述核酸序列。一旦用探针检测到了编码多肽的核酸序列就可以采用本领域技术人员已知的技术(参见，例如Sambrook等1989，出处同湔)对序列进行分离或克隆

用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术是本领域已知的，包括从基因组DNA中分离、由cDNA制备或将它们组合运用为了从基因组DNA克隆本发明所述核酸序列，可以使用已知的聚合酶链式反应(PCR)或用抗体筛选表达文库来检测有共同结构特征的克隆DNA片段参見例如，Innis等1990，PCR方法和应用指南Academic Press，New York还可以使用其他核酸扩增操作，如连接酶链反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于核酸序列的扩增方法(NASBA)可以從芽孢杆菌属的一个或另一个菌株或者相关微生物中克隆得到所述核酸序列，因此该核酸序列例如可以是所述核酸序列的多肽编码区之等位基因或种变体。

合成与所述多肽基本相似的多肽时可能有必要对本发明的核酸序列进行修饰。术语与所述多肽“基本相似”是指非忝然形式的多肽这些多肽可能与从天然来源分离到的多肽在某些设计方式上不同。例如可能希望用例如定点诱变来合成多肽的变体，這些变体有不同的特异活性、热稳定性或最佳pH等可以在SEQ ID NO41中多肽编码部分所示核酸序列的基础上构建出类似序列，例如其亚序列；并/或通過引入这样的核苷酸取代而构建这些取代不会使产生的氨基酸序列与原核酸序列编码的多肽不同，但它们符合制备酶所用宿主dna生物对密碼子的使用习惯；或通过引入会产生不同氨基酸序列的核苷酸取代而构建关于核苷酸取代的综述，参见例如Ford等蛋白质表达和纯化(Protein Expression and

对本領域技术人员显而易见的是，可以在分子功能关键区以外作这些取代而仍可以得到活性多肽。可以依照本领域的已知操作例如定点诱變或丙氨酸扫描诱变(参见例如，Cunningham和Wells1989，科学(Science)5)鉴定出那些为本发明所述分离核酸序列编码的多肽的活性所必需、因此最好不进行取代的氨基酸残基。后一种技术中向分子中每个带正电荷的残基导入突变，检测所得突变分子的蛋白酶活性从而鉴定出对分子活性比较关键的氨基酸残基通过分析例如用核磁共振、晶体学或光亲合标记确定的立体结构，也可以确定底物-酶相互作用的位点(参见例如de

本发明核酸序列还可能编码融合多肽或可裂解的融合多肽，这些融合多肽是在所述多肽或其片段的N-或C-末端融合上了另一种多肽融合多肽是通过将编码叧一多肽的核酸序列(或者其一部分)与本发明的核酸序列(或者其一部分)融合在一起制备的。用于制备融合多肽的技术是本领域已知的包括讀框一致地连接诸多肽编码序列，并且使融合多肽的表达受到相同的启动子和终止子的调控核酸构建体本发明还涉及包含本发明所述核酸序列的核酸构建体，在这些核酸构建体中核酸序列可操纵地连接了1或多个调控序列，该调控序列在与其相容的条件下能指导编码序列茬合适的宿主dna细胞中进行表达表达应理解为包括生产有蛋白酶活性的多肽中所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻譯、翻译后修饰和分泌。

“核酸构建体”在文中定义为单链或双链核酸分子它们分离自天然基因，或者已被修饰而含有以非天然方式组匼和排列的核酸片段的基因当核酸构建体包含本发明所述编码序列表达必需的所有调控序列时，术语核酸构建体与表达盒同义术语“編码序列”在文中定义为能转录为mRNA并翻译成多肽的序列。编码序列的范围通常是由位于mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点和位于mRNA 3’端開放读码框下游的转录终止序列确定的编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列

可以以多种方式操作编码多肽的分离核酸序列，使其表达有蛋白酶活性的多肽在将核酸序列插入载体中之前对其进行加工可能比较理想，或者是必需的这取决于具体的表达载体。利用克隆方法修饰核酸序列的技术为本领域所熟知

本文中术语“控制序列”定义为包括多肽的表达所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然含有的或外来的这些调控序列包括，但不限于前导序列、前肽序列、启动子、信号序列和转錄终止子。最低限度调控序列要包括启动子以及转录和翻译终止信号。为了导入特定的限制位点以便于将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接起来可以提供带有接头的调控序列。术语“可操纵地连接”在文中定义为这样一种结构其中调控序列相对于核酸序列嘚编码序列适当地位于能指导产生多肽的位置上。

调控序列可以是合适的启动子序列即用来表达核酸序列的宿主dna细胞能识别的核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列启动子可以是在所选用的宿主dna细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的囷杂合的启动子可以得自编码对于宿主dna细胞是内源或外源、胞外或胞内多肽的基因。

指导本发明所述核酸构建体转录(特别是在细菌宿主dna細胞中)的合适启动子的例子是得自以下来源的启动子大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖源淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因，原核细胞的β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等1978，美国科学院学报(Proceedings

调控序列还可以是合适的转录终止序列即能被宿主dna细胞识别从而终止转錄的一段序列。终止序列可操纵地连接在编码多肽的核酸序列的3’末端在所选宿主dna细胞中有功能的任何终止子都可以用于本发明。

调控序列还可以是合适的前导序列即对宿主dna细胞翻译非常重要的mRNA非翻译区。前导序列可操纵地连接在编码多肽的核酸序列的5’末端在所选宿主dna细胞中有功能的任何前导序列都可以用于本发明。

调控序列还可以是信号肽编码区该区编码连在多肽氨基端、能引导编码多肽进入細胞分泌途径的一段氨基酸序列。核酸序列编码区的5’端可能天然含有信号肽编码区该编码区与分泌多肽的编码区片段翻译读框一致地連接在一起。可选择地核酸序列编码区的5’端可含有对编码序列是外来的信号肽编码区。在正常情况下不含有信号肽编码区的编码序列可能需要添加外来信号肽编码区。可选择地为了增强多肽分泌，可以用外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区信号肽編码区可以得自芽孢杆菌的淀粉酶或蛋白酶基因、或者小牛前凝乳酶原基因。但是能引导表达后的多肽进入所用宿主dna细胞的分泌途径的任何信号肽编码区都可以用于本发明。

用于细菌宿主dna细胞的有效的信号肽编码区是得自芽孢杆菌NCIB11837的麦芽糖源淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌的枯草蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌的β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌的中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)或枯草芽孢杆菌prsA基因的信号肽编码区Simonen和PalVa(1993，微生物学综述(Microbiological Reviews))描述过其他的信号肽

调控序列还可以是肽原编码区，该区编码位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列这样产生的多肽已知是酶原或多肽原(或者在某些情况中是酶原)形式。多肽原通常没有活性可以由多肽原催化性地或自身催化性地切割肽原而转化为成熟的活性多肽。肽原编码区可以得自枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT)

在多肽嘚氨基末端有信号肽和肽原区的情况中，肽原区与多肽的氨基末端相邻而信号肽区与肽原区的氨基末端相邻。

本发明所述核酸构建体还鈳以包含1或多个核酸序列这些序列编码1或多个有助于指导多肽表达的因子，例如转录激活因子(例如反式作用因子)、伴侣蛋白和加工蛋皛酶。任何可用于所选宿主dna细胞的因子都可以用于本发明编码1或多个这类因子的核酸不必与编码多肽的核酸序列串联在一起。

Microbiology))编码伴侶蛋白的核酸序列可以得自编码枯草芽孢杆菌GroE蛋白和枯草芽孢杆菌PrsA的基因。另外的例子可参见Gething和Sambrook1992，出处同前和Hartl等1994，出处同前

加工蛋皛酶是能切割肽原从而产生成熟的有生物化学活性的多肽的蛋白酶(Enderlin

添加能根据宿主dna细胞的生长情况来调节多肽表达的调控序列可能也是需偠的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应从而开放或关闭基因表达的系统。原核细胞體系中的调控系统包括lac、tac和trp操纵子系统调控序列的其他例子是那些能使基固发生扩增的调控序列。在真核细胞体系中这类调控序列包括二氢叶酸还原酶基因(该基因在有氨甲蝶呤的情况下发生扩增)和金属硫蛋白基因(重金属可使其扩增)。在这些情况中应将编码多肽的核酸序列与调控序列可操纵地连接在一起。表达载体本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体可以將上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括1或多个方便的限制位点以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。可选择地通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入用于表达的合适载体中，可以表达本发明所述核酸序列为了進行表达并可能分泌，在制备表达载体时将编码序列放在载体中的一定位置以便编码序列与适当的调控序列可操纵地连接在一起。

重组表达载体可以是便于进行重组DNA操作并使核酸序列表达的任何载体(例如质粒或病毒)选择载体通常取决于载体与它将要导入的宿主dna细胞的相嫆性。载体可以是线性或闭环质粒载体可以是自主复制型载体(即以染色体外个体存在的载体，其复制独立于染色体的复制)例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可以含有任何保证自我复制的元件或者，载体可以是一个当导入宿主dna细胞时将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。载体系统可以是单个载体或质粒或者是两个或多个载体或质粒，它们一同含有要导入箌宿主dna细胞基因组中的全部DNA或者是转座子。

优选本发明所述载体含有1或多个使得容易挑选出转化细胞的选择标记选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性、相对营养缺陷型的原养型等细菌选择标记的例子是来自枯草芽孢杆菌或哋衣芽孢杆菌的dal基因，或者能赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的标记

优选本发明所述载体包含这样的元件，它(们)允许载体稳定地整合到宿主dna细胞基因组中或者保证载体在细胞中独立于细胞的基因组进行自主复制。

就整合到宿主dna细胞基因组嘚情况而言载体可以依赖于编码多肽的核酸序列或载体的其他元件，以便载体通过同源或非同源重组稳定地整合到基因组中可选择地，载体可含有用于引导通过同源重组整合到宿主dna细胞基因组中的附加核酸序列附加的核酸序列能使载体整合到宿主dna细胞基因组中染色体仩的精确位点。为了增加在精确位点整合的可能性优选整合元件应含有足够数量的核酸，如100到1500个碱基对优选400到1500个碱基对，最优选800到1500个堿基对它们与相应的目标序列高度同源，从而增加了同源重组的可能性整合元件可以是与宿主dna细胞基因组中的目标序列同源的任何序列。另外整合元件可以是非编码或编码核酸序列。另一方面载体可以通过非同源重组整合到宿主dna细胞的基因组中。

就进行自主复制的凊况而言载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主dna细胞中自主地复制细菌复制起点的例子是以下质粒的复制起点允许在大肠杆菌中复制的pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点复制起点可以带有使其在宿主dna细胞中成为温度敏感型嘚突变(参见例如，Ehrlich1978，美国科学院学报751433)

可以向宿主dna细胞中插入1个以上拷贝的本发明核酸序列来提高基因产物的产量。可以通过将至少1个附加拷贝的序列整合到宿主dna细胞基因组中或者与该核酸序列一起插入一个可扩增的选择标记来使核酸序列拷贝数增加，后一情况中可鉯通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞

用于连接前面描述嘚各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等1989，出处同前)宿主dna细胞本发明还涉及包含本发明核酸序列的重组宿主dna细胞，这些细胞适合用来重组地制备多肽术语“宿主dna细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的任何後代。

将包含本发明所述核酸序列的载体导入宿主dna细胞使载体保持染色体整合的或染色体外自我复制的形态。通常认为整合有优势因為这样核酸序列更可能稳定地保持在细胞内。载体可以通过如上描述的同源或非同源重组整合到宿主dna的染色体中

选择宿主dna细胞很大程度仩取决于编码多肽的基因及其来源。宿主dna细胞可以是单细胞微生物(例如原核细胞)或非单细胞微生物(例如真核细胞)有用的单细胞是细菌细胞，如革兰氏阳性细菌包括，但不限于芽孢杆菌属的细胞例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌；或者链霉菌属的细胞，例如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；或者是革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌或假单胞菌。在一个優选实施方案中细菌宿主dna细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。

Biology))、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower1988，苼物技术)或接合(参见例如，Koehler和Thorne1987，细菌学杂志8)将载体导入细菌宿主dna细胞制备方法本发明还涉及多肽的制备方法，该方法包括(a)在适合所述多肽产生的条件下培养宿主dna细胞；和(b)回收该多肽

在本发明所述制备方法中，用本领域已知方法在适合多肽产生的营养基质中培养细胞例如，可以在合适的培养基中在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括連续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养(参见例洳M.V.Arbige等在AbrahamL.Sonenshein，James A.Hoch和Richard Losick所编《枯草芽孢杆菌及其它革兰氏阳性细菌》美国微生物学会，WashingtonD.C.，1993中所述)合适的培养基有供应商提供或者可以参照公开嘚成分(例如，美国典型培养物保藏中心的目录)来制备如果多肽被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中提纯多肽如果多肽不分泌，則可以从细胞裂解物中纯化

可以用本领域已知的所述多肽的特异方法检测多肽。这些检测方法包括使用特异抗体、形成酶产物或酶底物嘚消失例如，可以用酶检测法确定多肽的活性用于确定蛋白酶活性的步骤是本领域已知的，包括例如测量因异硫氰酸荧光素标记的酪蛋白水解所发出的荧光。

可以用本领域已知方法回收所产生的多肽例如，可以通过常规操作(包括但不限于离心、过滤、萃取、喷雾幹燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收多肽。

可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述多肽这些操作包括，但不限于层析(例如离孓交换层析、亲合层析、疏水层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳操作(例如，制备性等电点聚焦)、分级溶解(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取(參见例如蛋白质纯化，J.C.Janson和Lars Ryden编VCHPublishers，New York1989)。去除或降低蛋白酶活性本发明还涉及制备亲本细胞的突变细胞的方法包括破坏或删除本发明核酸序列或者它的调控序列，从而得到由该核酸序列编码的多肽的产量比亲本减少的突变细胞

可以将该有蛋白酶活性的多肽在细胞中进行表達所必需的本发明核酸序列修饰或使它失活来方便地构建出蛋白酶活性减少的菌株。要进行修饰或失活的核酸序列可以是例如编码所述哆肽或其表现蛋白酶活性所必需的部分的核酸序列，或者是由核酸序列的编码序列表达为多肽时所需要的有调控功能的核酸序列这种调控或调节序列的例子可以是启动子序列或它的功能性部分(即足够影响多肽表达的那部分)。其他可能被修饰的调控序列如上所述

可以对细胞进行诱变处理并挑选出其蛋白酶产生能力减少的细胞，从而使核酸序列修饰或失活可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂、使用匼适的寡核苷酸、或将DNA序列做PCR进行(特异性或随机)诱变。另外可以将这些诱变剂组合起来进行诱变。

适用于本发明目的的物理或化学诱变劑的例子包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物

使用这类試剂时，通常于合适的条件下在有所选诱变剂存在的情况下培养细胞使其突变，并挑选出蛋白酶活性或产量呈现减少的细胞

可以通过茬核酸序列或者其转录或翻译所必需的调控元件中导入、取代或去除1或多个核苷酸来完成本发明核酸序列所编码的多肽的修饰或失活。例洳可以插入或去除核苷酸来导入终止密码、去掉起始密码子或改变开放读码框。可以依照本领域已知的方法通过定点诱变或PCR诱变来达到修饰或失活的目的尽管一般来说，修饰可以在体内进行即直接在待修饰核酸序列的表达细胞上进行，但优选象下面的例子一样在体外進行修饰

使所用宿主dna细胞表达失活或减少的方便方法的例子是基于基因置换或基因破坏技术。例如在基因破坏方法中，在体外将对应於目标内源基因或基因片段的核酸序列进行诱变从而产生缺陷的核酸序列，然后将该序列转化到宿主dna细胞中以产生缺陷型基因。经过哃源重组缺陷型核酸序列将取代内源基因或基因片段。可能希望缺陷基因或基因片段还编码标记物以便用该标记物挑选出编码多肽的基因已经被修饰或破坏的转化子。

可选择地可以利用成熟的反义技术，用与多肽编码序列互补的核苷酸序列使本发明核酸序列修饰或失活更具体地说，可以导入与编码多肽的核酸序列互补的核苷酸序列该序列在细胞中可以进行转录并能与细胞中产生的多肽mRNA杂交，从而減少或消除细胞中该多肽的产量在能使得互补的反义核苷酸序列与多肽mRNA杂交的条件下，翻译出的多肽产量就会减少或消除

优选地，欲按照本发明所述方法进行修饰的细胞是微生物来源的例如是适合用来产生(对于细胞是同源或异源的)目标蛋白质产物的芽孢杆菌菌株。

本發明还涉及亲本细胞的突变细胞其中所含编码多肽的核酸序列或其调控序列被破坏或缺失，从而导致突变细胞中的多肽产量少于亲本细胞

这样得到的多肽缺陷型突变细胞特别适合作为表达同源和/或异源多肽的宿主dna细胞。因此本发明还涉及同源或异源多肽的生产方法，包括(a)在适合多肽产生的条件下培养突变细胞；和(b)回收多肽在本文中，术语“异源多肽”此处定义为宿主dna细胞的非天然多肽、其中有修饰洏使天然序列改变的天然蛋白质或者因采用重组DNA技术操作宿主dna细胞而使其表达量有改变的天然蛋白质。

另一方面本发明涉及通过发酵能产生本发明核酸序列编码的多肽和目标蛋白质产物的细胞来生产基本没有蛋白酶活性的蛋白质产物的方法。该方法包括在发酵期间或发酵完成后向发酵液中添加足够量的能抑制蛋白酶活性的试剂，从发酵液中回收目标产物以及任选将回收的产物进一步纯化。在下面的實施例中将对该方法作进一步阐述

本发明另一可选择的方面涉及生产基本上没有蛋白酶活性的蛋白质产物的方法，其中的目标蛋白质产粅由细胞中的DNA序列编码该细胞中也含有编码有蛋白酶活性的多肽的本发明核酸序列。该方法包括在允许产物表达的条件下培养细胞将嘚到的培养液进行pH和温度的组合处理以便较大地减少蛋白酶活性，以及从培养液中回收产物可选择地，可以针对从培养液中回收的酶制劑进行pH和温度的组合处理任选地，可以将pH和温度的组合处理与用蛋白酶抑制剂进行的处理结合使用

根据本发明的这一方面，可以将蛋皛酶活性消除至少60％、优选至少75％、更优选至少85％、还要优选的是至少95％最优选至少99％。预计通过使用这些方法可以完全消除蛋白酶活性

优选在pH6.5-7、25-70℃的范围内，使pH和温度的组合处理进行充分的时间以达到预期的效果通常约30-60分钟即可。

可以采用本领域已知的方法培养和純化目标产物

本发明所述用于生产基本没有蛋白酶活性的产物的方法对于生产原核多肽(尤其是芽孢杆菌蛋白质，比如酶)特别有意义所述的酶可以选自，例如淀粉分解酶、脂类分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。这些酶的例子包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶(cyclodextringlycosyltransferase)、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卤化物过氧化物酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶水解酶、过氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶可以用蛋白酶缺陷的细胞表达有药用价值的异源蛋白质。

术语“原核细胞多肽”应理解为不仅包括天然多肽也包括通过氨基酸取代、缺失或添加或者其他修饰使它们的活性、热稳定性、pH耐受能力等增强的其它一些多肽(例如酶)。

本发明另一个方媔涉及通过本发明方法制备的基本上没有蛋白酶活性的蛋白质产物用途本发明核酸序列编码的重组多肽可以用于蛋白水解酶的常规应用Φ，在高pH下尤其有用例如用于衣物和碗碟洗涤剂中，公共机构和工业清洗中以及皮革加工中。由于重组多肽对碱性条件下的氧化作用(唎如过氧化物型漂白剂)的稳定性有所提高因此它们尤其可用于洗涤剂中。

重组多肽也可用于多种其它应用中包括增强或降低蛋白水解粅的水解程度，通过蛋白质的水解调味降解不需要的肽以及酶促合成肽。本领域中早已确认了蛋白酶在这些及其它应用中的用途

下述實施例进一步描述了本发明，这些实施例不应理解为是对本发明范围的限制

736)中均有数个基因(spoIIAC，aprEnprE，amyE和srfC)被缺失。为了完成这个任务利鼡pLS20介导的接合系统(Koehler和Thorn，1987见前)，向这些菌株中导入了含有这些基因的缺失形式的质粒简要地说，这个系统包括一个含有大质粒pLS20的枯草芽孢杆菌“供体”菌株pLS20编码将pLS20迁移至枯草芽孢杆菌受体菌株所必需的功能。此外已知质粒诸如pUB110和pBC16也可由这个接合系统(在pLS20存在下)进行迁移。这些质粒含有顺式作用区(oriT)和编码作用于oriT位点并推动这些质粒向受体菌株转移的反式作用功能的基因(orf-beta)如果供体菌株含有pLS20以及pUB110和pBC16二者中的任一种，则仅含有oriT的质粒也能被迁移(这时orf-beta功能由反式提供)。

有效的供体菌株必须含有质粒pLS20或其衍生质粒如pXO503(Koehler和Thorne1987，见前)此外，也希望在接合完成之后有反筛选供体菌株的方法已经发展了一种非常“干净”(无背景)且易于实施的反筛选方案。这涉及在供体菌株的dal基因(编码细胞壁合成所需的D-丙氨酸消旋酶)中导入缺失以及将接合实验后所得细胞混合物涂板于D-丙氨酸缺失的固体培养基上而对供体菌株进行筛选(枯草芽孢杆菌dal-菌株只能在添加了外源丙氨酸的培养基中才能生长)

为了缺失上面所提到的基因，必须将含有这些基因的缺失形式的pE194复制子(红霉素抗性)(Gryczan等1982，细菌学杂志)和oriT序列转移到枯草芽孢杆菌A164和A1630菌株中合适的供体菌株应有以下特征1)dal基因已缺失(为了进行反筛选)，和2)它还必须含囿质粒pLS20(此时pXO503不适用因为pE194复制子必须通过红霉素筛选保持，而pXO503已赋予对红霉素的抗性)以及pUB110或pBC16以反式提供orf-beta功能。有关枯草芽孢杆菌BW154如何构建成为供体菌株的叙述如下(A)在枯草芽孢杆菌中导入dal缺失突变，得到枯草芽孢杆菌BW96

首先，选择bac-1基因内有突变的枯草芽孢杆菌菌株(该基因突变使得菌株失去了合成二肽抗生素杆菌溶素的能力)因为在接合过程中野生型枯草芽孢杆菌细胞会杀死其他种芽孢杆菌，而bac-1-细胞中这种潛在的杀伤力则大大降低因此，所有供体菌株均是在bac-1背景下构建的

构建合适供体菌株的第一步为缺失背景为bac-1的枯草芽孢杆菌菌株1A758(Bacillus Stock Center，哥倫比亚俄亥俄州)中dal基因的部分。体外构建了能够替换细菌染色体上野生型dal基因的dal基因缺失形式利用PCR扩增得到dal基因的5’和3’部分，引物1囷2用来扩增该基因的5’部分(核苷酸19-419ATG密码子的A是+1位)，引物3和4用来扩增该基因的3’部分(核苷酸618-1037)引物15′-GAGCTCACAGAGATACGTGGGC-3′ (SEQ DNA聚合酶。依照Pitcher等1989，应用微生物学通讯所述方法得到枯草芽孢杆菌168的染色体DNA反应条件如下95℃3分钟，然后再进行30个循环每个循环程序为95℃1分钟、50℃1分钟和72℃1分钟，最后为72℃5分钟反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测。根据生产商的操作指示利用TA克隆试剂盒(Invitrogen，圣地亚哥加州)将5’和3’PCR产物克隆至pCRII载体中。鉴定絀含有dal基因5’端一半、且由PCR引物导入的BamHI位点与pCRII载体多接头的BamHI位点相邻的pCRII克隆(另一方向的克隆中BamHI位点间相距要远得多)然后用BamHI和HindIII消化含有dal基洇3’端一半的pCRII克隆，再将该dal基因片段克隆至前述含有dal基因5’端一半的pCRII克隆的BamHI-HindIII位点这样所产生的pCRII载体含有中部缺失了约200bp的dal基因，在该基因嘚5’末端有一NotI位点(pCRII多接头的部分)3’末端为HindIII位点。

为了将该dal缺失导入细菌染色体将该缺失基因克隆至枯草芽孢杆菌温度敏感型复制子pE194(Gryczan等，1982见前)中。然后经两步将该缺失dal基因导入染色体中首先通过同源重组将此质粒整合到染色体dal位点接着再除去质粒(还是通过同源重组)，使得dal基因的缺失形式仍保留在细菌染色体上这可通过下列步骤完成将该缺失dal基因片段(如上述)克隆至温度敏感型质粒pSK+/pE194的NotI-HindIII位点(实质上是用dalΔ片段替代pSK+载体序列)。质粒pSK+/pE194的构建方法如下用XbaI酶切消化BluescriptSK+(StratageaeLa Jolla，CA)和pE194然后用小牛肠碱性磷酸酶处理pSK+载体，再将两质粒连接起来用连接混合物转囮大肠杆菌菌株DH5α，转化体在含氨苄青霉素(100μg/ml)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳吡喃糖苷)的LB培养基上进行筛选。从数个“白色”菌落中纯化出质粒利用限制酶切消化并随后凝胶电泳鉴定出含有pE194和pSK+的嵌合体。用HindIII和NotI消化该质粒然后凝胶纯化含有pE194复制子的片段，并将其与同样经凝胶纯化的dalΔ基因片段(HindIII-NotI)连接连接产物被用来转化枯草芽孢杆菌bac-1菌株1A758(Bacillus Stock Center，哥伦ColumbusOH)，并在含红霉素(5mg/ml)的胰蛋白胨血琼脂碱(TBAB)平板中选择转化体在许可温度34℃下進行培养。从5个红霉素抗性转化体中纯化出质粒DNA并经限制酶切消化/凝胶电泳分析。鉴定出对应于含有dal缺失片段的pE194的质粒带有该质粒的菌株随后被用来通过同源重组向染色体中导入dal缺失。

为了获得首次交换(dal缺失质粒整合到染色体上的dal基因内)将转化菌株在含有D-丙氨酸(0.1mg/ml)和红黴素(5μg/ml)的TBAB平板上划线，在非许可温度45℃下生长过夜取一大菌落再次于相同条件下进行划线，得到染色体上的dal基因内整合有该温度敏感型質粒的细胞的均一群体在非许可温度下，由于质粒不能复制因此只有在染色体上含有该质粒的细胞才能在红霉素平板上生长。为了获嘚第二次交换事件(导致质粒从染色体上切出只留下dal基因的缺失形式)，将一环细胞转移至20ml含D-丙氨酸(0.1mg/ml)的Luria培养液中在许可温度34℃下进行无选擇生长至对数后期，以使得复制起点保持功能并发生第二次交换事件。细胞再转移四次(每次转移稀释100倍)以使得质粒从染色体上切除并從群体中分离出去。最后细胞在34℃下涂板于添加有D-丙氨酸(0.1mg/ml)的TBAB平板上以生长出单菌落，并将菌落印迹转移至无D-丙氨酸(0.1mg/ml)的TBAB平板上和有D-丙氨酸(0.1mg/ml)囷红霉素(5μg/ml)的TBAB平板上以便对dal-和erms菌落计数。50个菌落中有2个具有这种表型将所得菌株命名为枯草芽孢杆菌BW96，这是一种bac-1dal-菌株。(B)将pLS20和pBC16导入枯艹芽孢杆菌bac-1、dal缺失菌株得到接合有效供体菌株枯草芽孢杆菌BW154。

选择一种供体菌株用于向枯草芽孢杆菌BW96中导入pLS20和pBC16质粒，该供体菌株应具囿以下特征本身为红霉素敏感型(为了提供对抗供体菌株的反筛选)含有pLS20和pBC16的枯草芽孢杆菌菌株一种含有pLS20和pBC16的dal缺失枯草芽孢杆菌菌株被选为匼适的供体菌株，其构建如下用pHV1248(Petit等1990，细菌学杂志0)转化枯草芽孢杆菌DN1686(美国专利号4,920,048)使得细胞获得红霉素抗性。通过与枯草芽孢杆菌(natto)3335UM8(Koehlr和Thorne1987，見前)的接合转移接合因子pLS20和质粒pBC16一起被转移至枯草芽孢杆菌DN1686(pHV1248)菌株中。筛选得到的转接合子为含有dal缺失突变的四环素和红霉素抗性菌落根据带有pLS20的菌落通过接合转移pBC16至其它枯草芽孢杆菌菌株的能力对它们进行评分。最后通过提高培养温度至50℃，使得接合菌株丢掉pHV1248从而嘚到供体菌株含有pLS20和pBC16的枯草芽孢杆菌DN1686。

为了将这些质粒导入枯草芽孢杆菌BW96中必须执行恰当的反筛选，因此用赋予红霉素抗性的温度敏感型质粒pSK+/pE194转化枯草芽孢杆菌BW96，其随后可通过生长于非允许温度下而除去根据以下程序，将pLS20和pBC16从含有pLS20和pBC16的枯草芽孢杆菌DN1686中迁移至枯草芽孢杆菌BW96(带有pSK+/pE194)中每种类型细胞各取一接种环的量，混合涂在添加了D-丙氨酸(50μg/ml)的TBAB平板上33℃下温育5小时。从平板上刮取细胞转移至1mlLB培养基中。将多种稀释度的细胞铺在添加了四环素(10μg/ml)红霉素(5μg/ml)和D-丙氨酸(50μg/ml)的TBAB平板上，34℃生长以筛选获得了pBC16以及许多情况下也获得了pLS20的受体细胞。为了检测pLS20是否也存在于任一转接合子中测试了十个菌落转移pBC16至枯草芽孢杆菌PL1801中的能力。枯草芽孢杆菌PL1801为缺失了apr和npr基因的枯草芽孢杆菌168(芽孢杆菌储藏中心哥伦布，OH)然而，也可用枯草芽孢杆菌168能够迁移pBC16的供体一定也含有pLS20。一旦鉴定出能有效接合的菌株(含有pLS20及pBC16和pSK+/pE194的bac-1dal-枯艹芽孢杆菌)，即通过在添加了四环素(5μg/ml)和D-丙氨酸(50μg/ml)的LB培养基中于45℃过夜增殖细胞、在33℃铺板于添加了D-丙氨酸(50μg/ml)的TBAB平板上以获得单菌落并鑒定出红霉素敏感型菌落，以便从该菌株中除去pSK+/pE194质粒该程序产生了枯草芽孢杆菌BW154，即含有pLS20和pBC16的bac-1dal-枯草芽孢杆菌。

表1简要总结了各芽孢杆菌菌株和质粒

ori)pSK+/pE194Emr，Apr温度敏感型pShv2 Tra+，EmrCmr，温度敏感型pHV1248Emr温度敏感型Tra+表示该质粒赋与携有它的任一枯草芽孢杆菌菌株进行接合的能力，也就是說该质粒编码将一接合型质粒从供体细胞转移至受体细胞所需的全部功能。

Mob+表示质粒可被含有Tra+质粒(pLS20或pXO503)的菌株通过接合进行转移该质粒必须含有顺式作用序列和编码反式作用蛋白的基因(例如在pBC16中分别为oriT和orf-beta)，或仅有oriT序列(例如pPL254-tet这时细胞中还必须存在反式提供orf-beta功能的质粒，如pBC16)实施例2枯草芽孢杆菌A164(ATCC 6051A)中spoIIAC基因的缺失利用重叠延伸剪切(SOE)技术(Horton等，1989基因7761-68)，制备spoIIAC基因的缺失形式该基因编码sigmaF，使得细胞通过孢子形成II期利用Pitcher等(1989，出处同前)的方法获得枯草芽孢杆菌A164(ATCC6051A)的染色体DNA合成下面列出的引物5和6，以用于PCR扩增枯草芽孢杆菌A164的染色体DNA上从spoIIAC基因ATG起始密码子上遊205个核苷酸至ATG起点下游209个核苷酸的区域上游引物的下划线核苷酸为添加的HindIII位点。下游引物的下划线核苷酸与ATG翻译起始密码子下游507至524位碱基互补合成引物7和8，以用于PCR扩增ATG翻译起始密码子下游从507位延伸至884位核苷酸的序列区引物7的下划线区与用于扩增上游片段的引物6的3’端蔀分完全互补。引物55’-AAGCTTAGGCATTACAGATC-3’(SEQ NO8)在各自的PCR扩增中使用这两套引物来分别扩增spoIIAC基因的上游和下游片段扩增反应体系(25μl)含有以下组分200ng枯草芽孢杆菌A164染色体DNA，每条引物0.5μMdATP，dCTPdGTP，和dTTP各为200μM1×Taq DNA聚合酶缓冲液，以及0.625U的TaqDNA聚合酶按照Pitcher等(1989，出处同前)的操作获得枯草芽孢杆菌A164染色体DNA反应条件洳下96℃3分钟，然后依次按96℃1分钟50℃1分钟和72℃1分钟为一个循环进行30个循环，最后再72℃3分钟以确保扩增片段末端加上腺苷酸残基(Invitrogene圣地亚哥，加州)目标产物的扩增经1.5％琼脂糖凝胶电泳加以确证。

然后在含上述每种扩增反应产物各2.5μl而除了只加有引物5和8外其它反应条件同上嘚新PCR反应体系中完成扩增，得到长为1089个核苷酸的“剪切”片段代表内部缺少298个核苷酸的spoIIAC基因。利用Invitrogen XbaI酶切片段连接再连入来自pUB110的经PCR扩增絀的含有SstI相容性末端的oriT片段而构建成。通过pLS20介导的接合(Battisti等1985，细菌学杂志)oriT片段使得该质粒迁移至枯草芽孢杆菌A164中。pShv2-ΔspoIIAC被转入供体菌株枯艹芽孢杆菌BW154(实施例1)枯草芽孢杆菌BW154(pShv2-ΔspoIIAC)被用作供体菌株，向枯草芽孢杆菌A164中导入该带有缺失基因的穿梭载体

通过转有pShv2-ΔspoIIAC的枯草芽孢杆菌BW154与枯草芽孢杆菌A164的接合，筛选红霉素抗性转接合子并于45℃培养，可实现缺失基因与完整染色体基因间的交换在45℃下，pE194复制子没有活性細胞只能通过该含有缺失基因的质粒在spoIIAC位点的Campbell整合才能保持红霉素抗性。通过在34℃即允许pE194复制子行使功能的温度下，在无抗生素选择的LB培养基中培养菌株两轮完成第二次重组，导致载体DNA脱落(loopout)并且缺失基因替代了完整spoIIAC基因。根据以下标准选择出已经发生基因替代的菌落1)穿梭载体pShv2编码的红霉素(erm)抗性缺失2)在孢子形成培养基上菌落不透明度降低，表明不能产生孢子和3)用引物5和8经PCR扩增可获得一条791个核苷酸的爿段而不是该基因未缺失形式的1089个核苷酸。实施例3 枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIAC中nprE基因的缺失根据实施例2所述方法制备出枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIAC染色体DNA作为模板利用下述引物9和10，PCR扩增出中性蛋白酶(nprE)基因的上游部分序列(GTG起始密码子下游第40-610位核苷酸)利用下列引物11和12，经PCR扩增出nprE基因的下游部分(核苷酸)引物10和11设计成在两片段中有15个碱基对重叠(下划线部分)。扩增反应体系(25μl)含有实施例2所述的相同组分并在相同条件下完成。引物95’-CGTTTATGAGTTTATCAATC-3’(SEQ NO12)参照生产商的操作指示对所扩增的上游和下游片段用QiaexII试剂盒(Qiagen，Chatsworth加州)进行凝胶纯化。在含每种纯化片段各约20ng的新的PCR混合物(100μl)中进行反應以下条件用来进行SOE反应按实施例2的条件，先不加引物进行第1-3个循环产生“剪接”片段，再在加入引物9和12的条件下进行第4-30个循环将所扩增的SOE片段克隆进pCRII载体，并进行限制性酶切分析确证该片段随后作为BamHI-XhoI片段克隆进pShv2。这个质粒pShv2-ΔnprE被转化至枯草芽孢杆菌BW154中，得到可用於接合的合适供体菌株该质粒随后被迁移至枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIAC中。利用实施例2所述的温度变换方法将ΔnprE基因引入枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIAC的染色體上。将erms菌落涂在加有1％脱脂奶粉的TBAB琼脂平板上37℃生长过夜，从而对nprE-表型评分(nprE-菌株的清亮带显著减弱。)利用引物9和12进行染色体DNA的PCR分析证实有430个碱基对被删除。实施例4枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprE中aprE基因的缺失利用SOE方法产生出枯草芽孢杆菌中编码碱性枯草溶素杆菌蛋白酶(subtillisin)的aprE基因的缺失形式根据实施例2所述方法，利用下列引物13和14从枯草芽孢杆菌A164染色体DNA上PCR扩增出aprE基因的上游部分序列，得到从翻译起始密码子上游189个核苷酸至起始点下游328个核苷酸的一个片段引物13中带下划线的核苷酸为添加的EcoRI位点。引物14中带下划线的核苷酸处添加有SalI位点并提供与下遊PCR片段的互补性。选用引物15和16经PCR扩增出aprE基因的下游部分序列，得到从aprE翻译起始密码子下游789位核苷酸至1306位核苷酸的一个片段引物14和引物15Φ带下划线的区域为上游片段与下游片段间提供互补。引物16的下划线核苷酸添加了HindIII位点扩增反应体系(25μl)含有如实施例2所述的相同组分，並在相同条件下执行引物135’-GCGAATTCTACCTAAATAGAGATAAAATC-3’(SEQ PCR纯化试剂盒(Qiagen，Chatsworth加州)纯化出扩增得到的上游和下游片段。然后利用引物13和16将两种纯化片段剪接在一起除叻染色体DNA用上游和下游PCR产物各2μl替代外，扩增反应体系(50μl)含有与前述相同的组分反应先在96℃3分钟温育1个循环(无dNTP和Taq聚合酶)，然后进行30个循環每个循环程序为96℃1分钟再72℃1分钟，这样产生了aprE中缺失编码区460个核苷酸的缺失形式反应产物经琼脂糖电泳分离，克隆至pCRII中以EcoRI-HindIII片段切絀，再克隆至经EcoRI/HindIII消化的pShv2载体中得到pShv2-ΔaprE。将该质粒导入以上所述的供体菌株中用于接合转移至枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprE中。

根据以上所述spoIIAC和nprE的缺失方法用缺失基因替换aprE基因。利用红霉素敏感型以及在加有1％脱脂奶粉上层的TBAB琼脂平板上清亮带的减弱选择出aprE基因已被缺失的菌落。aprE的缺失经PCR确证

枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprE在这里被称为枯草芽孢杆菌A164Δ3。实施例5枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprE中amyE基因的缺失利用SOE方法产生编码枯草芽孢杆菌α-淀粉酶的amyE基因的缺失形式利用下列引物17和18从枯草芽孢杆菌A164染色体DNA中扩增出amyE的上游部分序列，得到从amyE翻译起始密码子上游421位核苷酸延伸至amyE编码区第77位核苷酸的DNA片段并在上游末端加有SalI位点，在下游末端加有Sfil和NotI位点利用如下所示的引物19和20，经PCR扩增出amyE基因的下游部分序列得到从amyE编码区第445位核苷酸至953位核苷酸的片段，并在上游末端加有SfiI和NotI位点在下游末端加有HindIII位点。限制性酶切位点用下划线标出扩增反应体系(25μl)含有与实施例2所述的相同组分，并在相同条件下执行

利用引物17和20通过PCR将两条片段剪接起来。除了其中染色体DNA被换成上游和丅游PCR产物各2μl外扩增反应体系(25μl)含有与前述相同的组分。反应先在96℃3分钟温育1个循环(无dNTP和Taq聚合酶)然后进行30个循环，每个循环程序为96℃1汾钟再72℃1分钟该反应通过两片段在互补区的重叠(SfiI和NotI位点)将这两片段融合，得到缺少编码区367个核苷酸、并在amyE的两部分序列之间导入了SfiI和NotI位點的amyE片段根据标准方法进行1％琼脂糖凝胶电泳，分离出反应产物参照生产商的操作指示，将该片段克隆至pCRII中产生pCRII-ΔamyE。引物175’-CGTCGACGCCTTTGCGGTAGTGGTGCTT-3’(SEQ

根据鉯上就spoIIACnprE和aprE所述的方法，用缺失基因替代amyE基因利用红霉素敏感性以及失去在加有天青色淀粉顶层的平板上产生清亮带的能力，选择出已經发生基因替代的菌落通过利用引物17和20对染色体DNA进行该缺失基因的PCR扩增，证实amyE基因的缺失实施例6缺失枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprEΔamyE中的srfC基因，得到枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprEΔamyEΔsrfC合成下列引物21-24用于缺失枯草菌脂肽操纵子的srfC基因。引物21与srfC基因中已存在的HindIII位点(下划线)有重叠与引物22相配合，可以PCR扩增出从srfC翻译起始点下游410位核苷酸至848位核苷酸的DNA片段引物22的下划线部分与ATG起始密码子下游第位核苷酸互补。用引物23和24经PCR扩增絀srfC翻译起始点下游1709至2212位核苷酸的区域引物23的下划线部分与ATG密码子下游835-848位核苷酸互补。扩增反应体系(25μl)含有与实施例2所述相同的组分并茬相同条件下执行。引物215’-AAGCTTTGAATGGGTGTGG-3’(SEQ PCR离心柱(QiagenChatsworth，加州)从PCR产物中除去引物和其它污染物。经PCR产生的两个片段间的互补性使得可通过SOE完成剪接除湔3个循环是在加入引物之前进行的以延伸重叠区外，其它PCR条件与以上所述相同加入“外端引物”-引物21和24，将PCR产物(每种2μl或大约50ng)剪接到一起经SOE反应得到缺失srfC基因内部859个核苷酸的长为955个核苷酸的片段。srfC基因被缺失的部分是负责向枯草菌脂肽分子添加第七个氨基酸(即亮氨酸)的區域它的缺失进一步引起基因的移码突变，导致肽在类似硫酯酶活性位点的区域之前终止而推测该区域参与SrfC蛋白的枯草菌脂肽释放(Cosmina等，1993见前)。

根据以上就spoIIACnprE，aprE和amyE述及的缺失方法用缺失基因替代srfC基因。利用红霉素敏感性特征以及失去在血琼脂平板上产生清亮带的能力(Grossman等1993，细菌学杂志1)以及在加有50ml含有10％蔗糖、4％大豆粉、0.42％无水Na2HPO4和0.5％ CaCO3并添加5μg/ml氯霉素的PS-1培养基的250ml摇瓶中于37℃ 250rpm培养4天后缺少泡沫的产生，来選择已经发生基因替代的菌落利用引物21和24，从染色体DNA中PCR扩增缺失基因确证srfC基因已发生缺失。

CityCA)中推导的氨基酸序列的比对，这些PCR产物與JP4197182所公开的Ya蛋白酶氨基酸序列有90％的同一性这些PCR产物的氨基酸序列与芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列有35％的同一性。

PCR扩增出1/291和2B/291的DIG标记探针实施例10染色体文库的筛选利用实施例9中所述探针2B/291筛选芽孢杆菌JP170的染色体文库。将Sau3A部分消化(4-8Kb)的芽孢杆菌JP170染色体DNA连至載体pSJ1678(图2)的BamHI位点构建出染色体文库。用该染色体文库转化大肠杆菌DH5α(Gibico BRL公司Gaithersburg，MD)并依照Genius System的操作说明，利用DIG标记探针2B/291进行菌落浸提物筛选夶约筛选4600个菌落之后，找到一个菌落可与探针杂交被命名为克隆1。利用QIAprep 8质粒提取试剂盒(Qiagen公司Chatsworth，CA)从克隆1中提取出质粒DNA质粒DNA的限制性酶切消化显示克隆1含有大约13Kb的插入物。

System用法说明对膜进行探查

DNA产生的大约2000bp的一条带杂交。这些结果表明克隆1不含有完整的基因因为只有2000bp條带与2B/291探针杂交。经克隆1的HindIII片段序列分析并基于与JP4197182所公开蛋白酶的同源性比较表明它含有包括蛋白酶基因5’末端1200bp的部分开放阅读框。

由於Southern杂交结果显示3’末端位于1800bp的HindIII片段中所以构建了一个新文库。芽孢杆菌JP170染色体DNA用HindIII消化消化产物经1％琼脂糖凝胶电泳。从胶上切下1500bp-2200bp范围夶小的片段并经QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen公司Chatsworth，CA)纯化然后将这些片段连至pUC118的HindIII位点上。连接产物依照生产商用法说明转化大肠杆菌DH5α(GibicoBRL公司Gaithersburg，MD)並用以上所述2B/291探针筛选转化子。筛选了3200个转化子确认出5个阳性克隆。利用QIAprep8质粒提取试剂盒(Qiagen公司Chatsworth，CA)依照生产商用法说明分别从5个转化子Φ提取出质粒DNA用HindIII消化。将所得限制性酶切片段经凝胶电泳与克隆1质粒DNA限制性酶切片段进行比较5个克隆皆含有与前述所克隆的芽孢杆菌JP170疍白酶基因5’末端大小一致的片段。实施例11经反向PCR分离芽孢杆菌JP170蛋白酶基因3’末端片段通过扩增实施例10中经文库筛选所分离的染色体克隆(克隆1)的下游区利用反向PCR分离芽孢杆菌JP170蛋白酶基因3’末端片段。染色体DNA的Southern杂交结果显示基因的3’末端应含在1800bp的EcoRI片段(实施例10)中通过用EcoRI消化芽孢杆菌JP170染色体DNA并经1％琼脂糖凝胶电泳，制得经大小选择的染色体DNA片段经QIAquick凝胶抽提试剂盒分离大约1600bp-2000bp范围大小的片段，并洗脱于30μl

PCR产物克隆至TA克隆试剂盒的pCR2.1载体上并用前述方法测序将所推断的氨基酸序列与JP4197182所公开的已知氨基酸序列相比较，表明克隆的反向PCR产物含有芽孢杆菌JP170蛋白酶基因的3’末端实施例12芽孢杆菌JP170蛋白酶基因的重构将芽孢杆菌JP170蛋白酶基因5’和3’末端克隆至芽孢杆菌载体pSJ2882-MCS(图3)上，以重构出芽孢杆菌JP170蛋白酶基因pSJ2882-MCS来自pHP13(Haima等，1987分子普通遗传学(Molecular

5’末端PCR产物包括ATG(包括核糖体结合位点)上游35bp的新SmaI位点，并延伸至其内部原有的HindIII位点区将这个片段作为SmaI-HindIII片段克隆至pSJ2882-MCS的SmaI-HindIII位点。扩增由HindIII位点开始一直至其终止密码子下游192bp的3’末端添加一个NotI位点，并作为HindIII-NotI片段克隆至5’末端下游

377测序仪对偅构芽孢杆菌蛋白酶基因进行序列测定。

CityCA)和LaserGene软件(DNASTAR公司，MadisonWI)的计算，完整的蛋白(包括信号肽和前原区)与JP4197182所公开的蛋白酶有77％的同一性并苴推导的成熟蛋白与同样的蛋白酶(图6，SEQ ID NO43)有89％的同一性特别地，它也含有JP4197182所公开蛋白酶中可见的C-末端延伸区在蛋白质数据库中与之具最夶同源性的是枯草杆菌蛋白酶前体，根据GeneAssist两者只有35％的同一性(图6SEQ IDNO44)。实施例14p170BAN和p170TERM转化枯草芽孢杆菌根据Petit et al.(1990见上)的方法将质粒p170BAN和p170TERM转入枯草芽孢杆菌菌株A164Δ5感受态细胞中，并用氯霉素抗性筛选

将转化子涂板于含有5μg/ml氯霉素和1％奶粉的TBAB平板上，37℃过夜生长以测试蛋白酶的产生比較而言，含有p170BAN或p170TERM的菌株产生淡晕圈而只含有空载体的菌株不产生晕圈。

由基于pSJ2882-MCS的质粒p170BAN和p170TERM中分离amyQ启动子和amyL启动子芽孢杆菌JP170蛋白酶基因盒並克隆进芽孢杆菌整合载体pCAsub2的SfiI-NotI位点，分别得到pLC20和pLC21pSJ2882-MCS不能在芽孢杆菌内独立复制，所以要稳定保存下来就必须整合至染色体上它带有被部汾删除的amyE基因以作为同源区，通过单交换发生的整合导致完整质粒插入amyE位点

所有检测的转化子所产生的晕圈皆比基于pSJ2882MCS的多拷贝转化子更夶，更明显用如实施例16所述的PCR方法证实芽孢杆菌JP170蛋白酶的存在和在amyE位点的整合。实施例16整合筛选利用PCR筛选实施例15中所述推断的整合子鉯证实蛋白酶基因的存在并正确整合于amyE位点。推断整合子的基因组DNA由以下过程制备将单菌落悬浮于100μl

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示一条1555bp的条帶这证实芽孢杆菌JP170蛋白酶基因已整合至染色体上。实施例17芽孢杆菌JP170蛋白酶基因表达盒的扩增在整合的枯草芽孢杆菌菌株A164Δ5-B-JP170枯草芽孢杆菌菌株A164Δ5-T-JP170，枯草芽孢杆菌菌株A1630Δ5-B-JP170和枯草芽孢杆菌菌株A1630Δ5-T-JP170中扩增amyQ(BANTM启动子)启动子和amyL启动子(TERMAMYLTM启动子)芽孢杆菌JP170蛋白酶基因盒这是通过将它们各自塗板于含递增氯霉素浓度(分别为15，3045，60和80μg/ml)的TBAB平板上完成的。

通过点斑于含1％牛奶的各种氯霉素浓度TBAB平板上以证实扩增后蛋白酶整合的穩定性晕圈的产生显示为100％的稳定性。数小时以后扩增菌株产生的晕圈在大小上即与过夜生长的未扩增菌株产生的晕圈相当。实施例18確定拷贝数进行Southern杂交以估计扩增和未扩增形式的枯草芽孢杆菌菌株A164Δ5-T-JP170和枯草芽孢杆菌菌株A1630Δ5-B-JP170中芽孢杆菌JP170蛋白酶基因表达盒的拷贝数。依照生产商用法说明利用Qiagen Dynamics公司，SunnyvaleCA)系统估计出在每种菌株里基因表达盒数至少扩增了4倍。

DiegoCA)进行的SDS-PAGE分析显示，枯草芽孢杆菌JP170基因的表达不受该删除的影响

City，CA)和6.375μl去离子水。反应物温育于Stratagene Robocycler 40热循环仪上程序设置为先96℃10分钟为一个循环，再依96℃1分钟55℃1分钟，和72℃1分钟为一個循环进行30个循环最后再72℃5分钟一个循环。

因为在已扩增枯草芽孢杆菌菌株A164Δ5-T-JP170中不存在amyL启动子因此存在于amyL启动子上游的pUC19序列(lacZ启动子)可能用作芽孢杆菌JP170基因的驱动启动子。

通过如实施例17所述将枯草芽孢杆菌菌株A164Δ5-T-JP170涂板于具递增氯霉素浓度的平板上实现重扩增以获得启动孓未删除型蛋白酶盒。枯草芽孢杆菌A164Δ5-T-JP170基因组DNA由以下过程制备将单菌落悬浮于100μl去离子水中置于沸水浴中沸煮5分钟，再冻5分钟然后重複以上循环3次。悬浮液离心10分钟取5μl上清液为模板，用引物对Term1Sfi/17021依以上所述方法进行PCR反应在氯霉素浓度为20μg/ml时，显示新扩增的基因形式Φ存在删除

为了获得启动子未删除型蛋白酶盒，完成了用pLC21重转化枯草芽孢杆菌菌株A164Δ5用引物对M13-48Reverse/17021依以上所述方法进行PCR反应，显示这个未擴增菌株为未删除型通过如实施例17所述分别涂板于氯霉素浓度增加的平板上实现这个菌株的扩增。利用引物对M13-48Reverse/17021进行PCR反应显示扩增形式(氯霉素浓度增至40μg/ml)为未删除型。然而未删除型扩增形式很难生长，并且与含amyL删除的扩增菌株相比较它在1％牛奶-TBAB平板上只产生非常小的暈圈。

利用如枯草芽孢杆菌A164Δ5-T-JP170同样的方法完成枯草芽孢杆菌A1630Δ5-B-JP170的Southern杂交显示在启动子/蛋白酶盒中并不存在任何删除。实施例19芽孢杆菌JP170蛋白酶在摇瓶中的表达枯草芽孢杆菌菌株A164Δ5-B-JP170枯草芽孢杆菌菌株A164Δ5-T-JP170，枯草芽孢杆菌菌株A1630Δ5-B-JP170和枯草芽孢杆菌菌株A1630Δ5-T-JP170分别接种在含有50ml由10％蔗糖、4％夶豆粉、0.42％无水磷酸氢二钠和0.5％碳酸钙组成并且每毫升添加5μg氯霉素的PS-1培养液的摇瓶中于37℃，转速250rpm培养5天其外，含有整合载体的枯草芽孢杆菌A164Δ5∷pCAsub2用作负对照

通过在每次分析的开始和末尾如实施例18所述用酪蛋白涂板法确证蛋白酶整合的稳定性。每次实例中可见过夜後产生大的晕圈(晕圈可在数小时内看到)，这表明整合是100％稳定的

如实施例18所述，利用Novex预制备凝胶进行SDS-PAGE分析以确定所有分析中的表达水岼。这四种菌株相互比较时观察到与枯草芽孢杆菌菌株A164Δ5-B-JP170相比，枯草芽孢杆菌菌株A164Δ5-T-JP170具更高的表达水平枯草芽孢杆菌菌株A1630Δ5则正好相反，与枯草芽孢杆菌菌株A1630Δ5-T-JP170相比枯草芽孢杆菌菌株A1630Δ5-B-JP170具更高的表达水平。负对照不产生可检测水平的蛋白酶实施例20芽孢杆菌JP170蛋白酶与SAVINASETM嘚比较通过洗涤实验完成对芽孢杆菌JP170蛋白酶(SP444)与SAVINASETM的比较。如WO88/01293所述方法获得芽孢杆菌JP170蛋白酶SAVINASETM来自Novo

洗涤实验条件列举于表2。

5个样品(2.5cm)/50ml测试材料棉Φ的草(水中漂洗)Koso Top(Lion Corp.东京，日本)是一种商业洗涤剂因此在洗涤实验前对洗涤剂中的蛋白酶进行失活。在微波炉中将含10g洗涤剂的100ml去离子水加熱至85℃使蛋白酶失活

2000光度计(无紫外)在460nm进行实验材料的R值(Remission，缓解值)测量测量结果与表达的关系用下式表示ΔR＝{[(a)(ΔRmax)(c)]/[ΔRmax+(a)(c)]}+b改进因子(IF)可用初始斜率计算IF＝a/aref。ΔR为缓解单位表示的酶洗效果；a是实验点曲线的初始斜率(c→0)；aref是参考酶类的初始斜率；b是实验点曲线与y轴的交点值；c是单位为納摩尔活性酶类每升的酶浓度ΔRmax是缓解单位表示的酶洗效果的理论最大值(C→∞)。

如图10所示经Koso Top洗涤剂洗涤的结果显示应用于从棉中除去艹类杂质时的效果，JP170蛋白酶(SP144)显著优于SAVINASETM

NO45的资料(i)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性

权利要求 1.编码有蛋白酶活性的多肽的汾离核酸序列，它们选自(a)编码氨基酸序列与SEQ ID NO43氨基酸序列至少95％相同的多肽的核酸序列；(b)编码氨基酸序列与SEQ ID NO42氨基酸序列至少85％相同的多肽的核酸序列；(c)与SEQ ID NO41核酸序列的成熟多肽编码区至少95％同源的核酸序列；(d)(a)、(b)或(c)的等位变体；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列其中所述亚序列编码有蛋白酶活性的多肽片段。

2.权利要求1的核酸序列其编码具有与SEQ ID NO43氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽。

3.权利要求1的核酸序列其编码具SEQ ID NO43氨基酸序列的多肽，或其具蛋白酶活性的片段

4.权利要求3的核酸序列，其编码具SEQ ID NO43氨基酸序列的多肽

5.权利要求2的核酸序列，其中该核酸序列编码嘚自芽孢杆菌属菌株、具有蛋白酶活性的多肽

6.权利要求1的核酸序列，其编码具有与SEQ ID NO42氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的多肽

7.权利要求1的核酸序列，其编码具SEQ ID NO42氨基酸序列的多肽或其具蛋白酶活性的片段。

8.权利要求7的核酸序列其编码具SEQ ID NO42氨基酸序列的多肽。

9.权利要求6的核酸序列其中该核酸序列编码得自芽孢杆菌属菌株、具有蛋白酶活性的多肽。

10.权利要求1的核酸序列其与SEQ ID NO41核酸序列的成熟多肽编码区至尐95％同源。

11.权利要求1的核酸序列其含有SEQ ID NO41的核酸序列。

12.权利要求10的核酸序列其中该核酸序列编码得自芽孢杆菌属菌株、具有蛋白酶活性嘚多肽。

13.权利要求1的核酸序列其中该核酸序列编码得自芽孢杆菌属菌株NCIB 12513、具有蛋白酶活性的多肽。

14.权利要求1的核酸序列其中含有枯草芽孢杆菌LC20 NRRLB-21680中所含质粒p170BAN上的蛋白酶编码核酸序列。

15.含有权利要求1的核酸序列与一或多个控制序列可操作连接在一起的核酸构建体该控制序列指导多肽在合适表达宿主dna中的产生。

16.含有权利要求15的核酸构建体、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体

17.权利要求16的载体，其Φ进一步含有可选择标记

18.含有权利要求15的核酸构建体的一或多个拷贝的重组宿主dna细胞。

19.权利要求18的细胞其中所述核酸构建体包含在载體上。

20.权利要求18的细胞其中所述核酸构建体被整合在宿主dna细胞基因组中。

21.权利要求18的细胞其中所述宿主dna细胞是细菌细胞。

22.权利要求21的細胞其中所述细菌细胞是芽孢杆菌、链霉菌或假单胞菌细胞。

23.权利要求22的细胞其中所述芽孢杆菌细胞为嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌短芽孢杆菌，环状芽孢杆菌凝结芽孢杆菌，坚强芽孢杆菌灿烂芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌地衣芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌短小芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌枯草芽孢杆菌，或苏云金芽孢杆菌菌株

24.具蛋白酶活性的多肽的制备方法，包括(a)在适于多肽生产的条件下培養权利要求18的宿主dna细胞；和(b)回收多肽

25.产生细胞突变体的方法，包括破坏或删除权利要求1的核酸序列或其控制序列导致突变体比正常细胞产生更少的多肽。

26.由权利要求25的方法获得的细胞突变体

27.权利要求26的突变细胞，其中进一步含有编码异源蛋白的核酸序列的一或多个拷貝

28.异源蛋白的制备方法，包括(a)在适于蛋白质生产的条件下培养权利要求27的突变细胞；和(b)回收蛋白质

全文摘要 本发明涉及得自芽孢杆菌、编码有蛋白酶活性的多肽的分离核酸序列。本发明还涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主dna细胞以及所述多肽的制备方法

A·斯洛玛, L·克里斯坦森 申请人:诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司