基因定点突变常用于研究基因的轉录的产物是调控、RNA或蛋白质的结构和功能以及用于质粒中部分序列的微调等。
本试剂盒利用了目前最常用的基因点突变技术只需通過基于PCR的突变质粒的生成，和基于DpnI的模板质粒的消化转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图1)DpnI消化仅需5汾钟，累计操作时间约2-3小时即可完成基因的定点突变

图1.基因定点突变试剂盒原理图

本试剂盒使用了*的保真性更强，灵敏度更高扩增速喥可达2kb/min，扩增长度可达35kb的BeyoAmp? Extra-long DNA Polymerase从而大大缩短了突变反应所需的时间，进一步提高了基因定点突变的成功率同时进一步严格验证了试剂盒Φ的DpnI，确保能在5分钟内充分消化掉甲基化的模板质粒同时不会消化未甲基化的PCR产物。
参考图1使用本试剂盒时需要先设计长度通常为25-45个堿基互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应这样可以产生含有预期嘚突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点待突变的质粒通常来源于DH5α等dam⁺大肠杆菌，在这些dam⁺细菌中质粒会被甲基化修饰而茬体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来随后把DpnI处理过的产物转化感受态细菌后，突变质粒中的两个nick位点可以被大肠杆菌修复得到的*僦会含有预期的突变质粒了。
本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。
经检测本试剂盒可对长达14kb的模板质粒完成定点突变PCR擴增(图2):

本试剂盒使用pcDNA3.1-SRCAP(14566bp)质粒进行了点突变测试，实测突变率接近100%(参考图3)实际进行点突变时，可能会因为突变引物的设计、模板使用量、感受态效率等因素出现不同的突变率

图3. 本试剂盒对pcDNA3.1-SRCAP(14566bp)质粒进行点突变的实际效果图。A. 使用本试剂盒进行点突变获得的LB平板照片以pcDNA3.1-SRCAP质粒为模板，使用本试剂盒进行PCR扩增以实现点突变DpnI 37℃消化5min，取10μl产物转化100μl DH5α感受态，涂板后37℃培养过夜所获得的LB平板照片B. 阴性对照LB平板照片。与A相比没有添加BeyoAmp? Extra-long DNA Polymerase这样模板质粒完全被DpnI酶所消化，没有任何的假阳性*产生C. 突变前后的测序图。突变前的测序结果(WT, wild type)和从图A中挑取9个*的測序结果(Mu, mutant)箭头所示为拟突变的两个位点，红色下划线的为突变前和突变后的碱基本次实验的突变率达到了100%。
本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应

-20℃保存，一年有效
注意事项：需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。
需自行设计和合成用于基因定点突變的引物需自备用于细菌转化的试剂。
使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床診断或治疗不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作

1. 引物设计：用于特萣基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：a. 共需设计两条互补的引物可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物b. 引物的长度通常为25-45个碱基。c. 利用如下公式进行引物Tm值的估算通常Tm值应该不低于78℃。Tm= %mismatchN表示引物所含碱基总数%GC表示引物ΦGC碱基数占引物总碱基数的百分值例如GC含量为50%，那么%GC就是50%mismatch表示引物中突变碱基数占引物总碱基数的百分值，例如错配率是2.5%那么%mismatch就是2.5。