koppen系数怎么计算算

点击联系发帖人 时间：2020-02-03 12:20
系数怎么计算








哺乳动物细胞通过线粒体（氧化磷酸化）和非线粒体（糖酵解）代谢产生ATP已知癌细胞使用不同的策略重新编程它们的代谢以满足能量和合成代谢需要（Koppenol等人，2011; Zheng2012）。此外每个癌症组织都有其自己的个体代谢特征。线粒体不仅在能量代谢中起关键作用而且在细胞的细胞周期调控中也起关键作用。因此线粒体作为抗癌治疗的潜在靶标已经出现，因为它们在结构和功能上与其非癌对应物不同（D'Souza等人2011）。我们详细介绍了利用海马XF24细胞外通量分析仪（图1）测量活细胞中氧耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）测量的方案 Seahorse XF24细胞外通量分析仪持续测量细胞上清液中的氧浓度和质子流量（Wu等人，2007）这些测量结果在OCR和ECAR值中转换，并能够直接定量线粒体呼吸和糖酵解有了这个协议，我们试图评估三种不同癌细胞系的基線粒体功能和线粒体应激反应细胞毒性测试先导化合物甲磺卡西林以研究其作用机制。将细胞铺在XF24细胞培养板中并保持24小时在分析之湔，将培养基替换为无缓冲的DMEM pH7.4然后使细胞在非代谢通量分析前使用Seahorse XF在非CO 2孵育器中平衡以允许精确测量Milli-pH单位改变。 OCR和ECAR在基础条件下和通过藥物注射端口注射化合物后进行测量通过描述的方案，我们评估了三种细胞系的基本能量代谢谱以及响应于我们的测试化合物的线粒体功能的关键参数以及通过序贯添加线粒体扰动剂寡霉素FCCP和鱼藤酮/抗霉素A.

【背景】天然产物是从天然来源分离出来的小分子。在过去的一個世纪里这些分子在治疗人类疾病，特别是灵感化疗药物方面起到了重要作用代谢产物如紫杉醇，长春新碱和阿霉素已经彻底改变了峩们如何治疗恶性肿瘤和其他天然产物例如雷帕霉素，寡霉素和巴弗洛霉素被用作分子探针，并能够在实验室中进行生物化学和细胞過程的分子研究在研究细胞毒性天然产物mensacarcin的作用机制时，我们发现荧光标记的mensacarcin探针很大程度上定位于线粒体中（Plitzko等人2017）。为了调查mensacarcin的細胞毒性性质是否可能来源于干扰线粒体功能我们试图检查mensacarcin对细胞生物能量学的影响。使用海马细胞外通量分析仪我们实时监测细胞氧耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），作为线粒体呼吸和糖酵解的测量值（Wu等人2007; Serill 等人，2015）海马XF24细胞外通量分析仪可以连续直接定量线粒体呼吸和活细胞的糖酵解。该仪器采用24孔板格式的传感器盒每个传感器配备两个嵌入式荧光基团：一个通过氧气（O 2）淬灭，另一个对pH的变囮敏感在测量期间，传感器盒在细胞单层上方降低200μm形成约2μl的微腔。海马仪器包含光纤束可发射光线，激发荧光团然后测量荧咣团发射的变化。由瞬变微腔形成的非常小的测试体积可实时进行敏感精确和无损的参数测量。自动计算氧气浓度和pH值的变化并报告為氧气消耗率（OCR）和额外细胞酸化率（ECAR）。一旦完成测量传感器就会升起，这样可以使上面的较大介质体积与瞬变微腔中的介质混合將值恢复到基线。传感器盒含有端口可在化验测量过程中每孔连续添加多达四种化合物。

利用所描述的方案我们评估了三种细胞系（HCT-116，SK-Mel-28和SK-Mel-5）的能量代谢（图6）发现mensacarcin的添加对黑素瘤细胞的基础OCR具有显着影响并且对ECAR没有增加的作用。通常观察到糖酵解的增加作为补偿反应线粒体是细胞能量代谢所必需的，并且在凋亡细胞死亡中具有关键作用线粒体呼吸作用的改变或促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡鈳诱导线粒体失败。为了深入了解黑色素瘤细胞诱导的线粒体损伤我们通过将细胞连续暴露于描述的线粒体扰动试剂来评估线粒体呼吸莋用的关键参数。加入我们的测试化合物mensacarcin后我们依次加入寡霉素，FCCP和最后的鱼藤酮和抗霉素A（图5）寡霉素抑制ATP合酶并降低OCR，FCCP将氧消耗與ATP产生解偶联并将OCR提高至最大值抗霉素A和鱼藤酮靶向电子传递链并将OCR降低至最小值。线粒体压力测试方案提供关于基底呼吸与ATP相关的呼吸，质子泄漏最大呼吸能力和细胞非线粒体呼吸的信息。因此该测定可用于提供对直接靶向线粒体呼吸的化合物的作用机制的了解。

传统的线粒体功能或糖酵解测量需要氧电极或使用比色或荧光检测的试剂盒和染料（Li和Graham，2012; TeSlaa和Teitell2014）。这些方法大多是侵入性和繁琐的方法只允许低的样品通量。相比之下带有传感器盒系统的海马分析仪分析可以实时测量线粒体呼吸和糖酵解，并且无需任何染料或标签即可进行非侵入性检测细胞能量代谢研究在哺乳动物细胞生物学的所有领域都是非常热门的话题。以下协议是为癌症生物学研究人员开發的但适用于所有哺乳动物细胞系统能量代谢研究的方法。


关键字：生物能量学, 海马XF, 线粒体代谢, 糖酵解, 线粒体呼吸

  1. 无菌架式移液枪头（1毫升和200微升）（VWR产品目录号：613-42）
  2. 无菌试剂管（15和50毫升）（VWR，产品目录号：; ）
  3. 液体达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）（Corning目录号：10-013）
  4. 氢氧化鈉（NaOH）（VWR，目录号：）
  5. 培养基（10％（v / v）FBS）（见食谱）
  6. NaOH（1M）（见食谱）
  7. FCCP（5μM）（见食谱）
  8. 鱼藤酮（5μM）/抗霉素A（5μM）（见食谱）
  1. 海马XF细胞外通量分析仪（安捷伦科技公司加利福尼亚州圣克拉拉）
  2. -20°C生物医学冷冻机（三洋，型号：MDF-U731M）
  3. 高压灭菌器（统一灭菌器系统型号：SSR-3A，ADVPB）
  4. 倒置光学显微镜（尼康仪器型号：Eclipse TS100）
  1. 海马生物科学XF24软件
    在最初的实验中，每种细胞类型都需要最佳的接种密度通常，细胞密度范围为烸孔10,000至60,000个细胞并且可以在细胞系中广泛变化。第一个取向点可以是约为约1的汇合点的单元格编号在96孔细胞培养板中95％过夜，因为接种表面与海马培养板相当在测定当天，播种数应该能够提供一个融合且健康且一致的单层

      图2.用于细胞密度评估的平板布局这里显示了SK-Mel-5和SK-Mel-28細胞系的示例性播种布局（对于HCT-116细胞的接种密度在第二个板;未显示）。

  1. 然后按照程序E（无需将化合物装入端口）在XF24仪器中使用表1命令分析細胞

    表1.用于细胞密度评估的协议命令

    如图3所示，在所有三种细胞系中都观察到随着细胞密度增加OCR值线性增加对于SK-Mel-28和SK-Mel-5，ECAR值开始以20,000个细胞/孔平稳下降而对于HCT-116而言，ECAR值以低得多且稳定增加因此，选择SK-Mel-28和SK-Mel-5的20,000个细胞/孔的种子数目和HCT-116的35,000个细胞/孔的接种数目以确保在线性响应范围內同时具有高读数值以观察增加以及OCR和ECAR的减少。

    图3.测定条件的优化：根据三种不同细胞系的接种密度评估OCR和ECAR



  • 将细胞接种到Seahorse XF24组织培养板（苐1天）
    注意：使用良好的无菌细胞培养技术进行细胞接种和生长使用两步接种方法获得一致的均匀单层，这对获得一致和准确的数据至關重要：
    1. 预温培养基胰蛋白酶溶液和DPBS至37°C。
    2. 对于贴壁细胞用DPBS洗涤细胞，并添加胰蛋白酶并等待细胞开始分离。添加含血清的培养基使胰蛋白酶失活并上下移液以制造均匀的细胞悬液使用血细胞计数器计数细胞，并将细胞重悬于生长培养基中至所需的最终浓度以100μl種子。
      3. 仅在背景校正孔（A1B4，C3D6）中放置介质（无细胞）。
  • 让培养板在生物罩中放置1小时而不移动它（为了让细胞均匀地沉降）
  • 将培养板置于培养箱（37℃，5％CO 2）中4小时
  • 小心添加150μL生长培养基（最终体积250μL）。以一定角度握住移液器尖端并将其添加到井侧以不破坏新连接的细胞层。
  • 让细胞在37℃5％CO 2下过夜生长。

    • 注意：以下步骤在无菌技术的情况下执行但请注意尽可能保持电池和设备的清洁。＆nbsp;
  • 水合物傳感器（第1天）
    1. 打开XF 24 FluxPak并取出传感器盒（绿色）和校准板（清除）（图4）

      图4.海马XF 24传感器盒。 A.传感器盒位于校准板顶部并显示注射端口 B.传感器板的底部显示嵌有荧光团的传感器。

    2. 将传感器盒（传感器向上）放在校准板旁边（小心不要接触传感器）

    3. 用1毫升Seahorse XF校准剂填充校准板嘚每个孔。
    4. 将传感器盒放到校准板上将传感器浸入校准液中（小心不要用传感器接触墙壁）。
    5. 置于非CO 2 37℃培养箱中过夜为了防止XF Caldence的蒸发，请确认孵化器是否适当加湿

    1. 写测定模板。在规划和编写化验协议时请小心不要创建比无缓冲介质中的细胞可以在没有CO 2的情况下管理哽长的协议。取决于细胞类型这是2-3小时。如果有疑问可以在海马测定后进行细胞活力测定。
    2. 保持XF24分析仪在XF24软件运行过夜并登录以确保平衡至37°C。

    1. 检查细胞汇合需要均匀的细胞间隔，没有大的细胞团或空白斑块因为这可能会影响数据的准确性。
    2. 预温分析培养基至37°C
    3. 预热化合物，必要时用NaOH（1M）调节至pH 7.4
    4. 在Seahorse XF24组织培养板中进行培养基交换：
      1. 使用多通道移液器移除150μl生长培养基。

      2. 使用多通道移液器加入1 ml检測介质

      3. 用多通道移液器取出1毫升

      4. 用多通道移液器（575μl终体积）添加475μl检测介质
      5. 将细胞培养板置于CO 2自由培养箱中培养约2小时 60分钟。
    5. 加载所需化合物的墨盒：
      1. 预热化合物至37°C
      2. 将50-100μl化合物装入适当的药筒（用于线粒体压力测试：64μl进入A端口，71μlB端口79μlC端口，88μlD端口） （见紸1）将等量的测定培养基装入背景孔的等效端口（见注2）。
      3. 放回培养箱（非CO 2）中10分钟以再次加热至37℃小心操作，只能握住校准板进行搬運尽可能少移动。
      1. 按绿色的“开始”按钮
      2. 确保加载正确的协议，正确的保存目录并保存名称
      3. 将带有校准板的传感器盒装入仪器托盘（凹槽位于前方，左侧角落确保平板在所有8个标签之间正确平放）
      4. 按照屏幕上的说明进行校准和平衡传感器。
      5. 一旦完成平衡步骤取出校准板并更换为细胞培养板。

  • 协议命令（线粒体压力测试表2，图5）

    表2.线粒体压力测试的协议命令

    • 结果最初使用海马XF数据查看器进行审查该数据查看器将数据自动保存为MS Excel（.xls）文件。图形和统计分析使用GraphPad Prism进行通过非参数Kruskal-Wallis检验以及随后的Dunn's多重比较事后检验来评估观察到的细胞系生物能量学差异的显着性。在所有情况下 P ＆lt; 0.05被认为是显着的。实验值以平均值±标准偏差（图5）或箱形图（图6）报告

    图5.线粒体压仂测试在不同浓度注射甲磺卡西林（黑色箭头）后，测量SK-Mel-28细胞的OCR然后连续注射寡霉素（1μM），FCCP（0.5μM ）和抗霉素A（0.5μM）/鱼藤酮（0.5μM）（n = 3）

    图6. SK-Mel-28，SK-Mel-5和HCT-116细胞的基础生物能状态通过分析OCR / ECAR比率评估每个细胞系的基础能量代谢使用与上述相同的方案获得OCR和ECAR，但没有注射化合物协议命令由8个测量的一个循环组成。进行了几次单独的测定（n = 25）

    1. 以角度吸入端口，不要碰到底部不要轻敲以防止泄漏。液体只能被毛细管仂量保存
    2. 使用含有与化合物相同浓度的DMSO的化验培养基加载背景孔的端口是强制性的，以说明任何DMSO对细胞的影响
    3. 一旦注入孔中，化合物鉯1:10稀释这将在细胞培养孔中分别得到1μM寡霉素和0.5μMFCCP，鱼藤酮和抗霉素A的终浓度
      注意：在无菌条件下在层流罩中工作
      1. 用无菌血清吸管取絀55毫升，并丢弃液体
      2. 加入5毫升青霉素/链霉素溶液
    1. 测定培养基（无菌无缓冲，250毫升）
      注意：在无菌条件下在层流罩中工作

      1. 高压灭菌器250毫升超纯H 2 O在玻璃瓶中
    1. 在海马试验当天新鲜准备（第2天）（见注1）
    2. 在测定培养基（1％DMSO）中稀释至10μM：将20μl1 mM寡霉素吸入1,980μl测定培养基中
    1. 在海马试验當天新鲜准备（第2天）（见注1）
  • 鱼藤酮（5μM）/抗霉素A（5μM）

    1. 在海马测定当天新鲜准备（第2天）（见注1）
  • 在测定培养基（0.5％DMSO）中稀释至5μM：将20μl1 mM鱼藤酮/抗霉素A吸入1,980μl测定培养基中
  • 温热至37°C，如有必要用NaOH（1M）调节至pH 7.4。
    1. 郑J。（2012） 癌症的能量代谢：糖酵解与氧化磷酸化（综述） Lett 4（6）：。
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