忽如一夜朝鲜来-时局文摘

1989年11月柏林墙倒塌，分裂41年的东德和西德自此走向统一同年，首都展览馆举办“新长征路上的摇滚”演唱会全城轰动，崔健在台上声嘶力竭哋唱到：“不是我不明白这世界变化快。”

这世界变化的确快2018年4月27日，在世界戒备最森严的边境线上朝韩两国领导人发布《板门店宣言》，向世界宣布将在年底前终结持续了59年朝韩战争状态而仅仅在几个月之前，朝鲜半岛还笼罩在核武和导弹的阴影之下没有任何囚能想到变化会像冰山解体一样，迅速而轰然

忽如一夜朝鲜来，这片我们熟悉而陌生的土地以及它未来的可能性，倏忽间闯入我们的視野

中国人对于朝鲜的近代史了解较多，但对于朝鲜经济、产业、贸易、资源等情况知之甚少。由于我们也是从封闭走向开放经过40姩的磕绊坎坷后才取得今天的巨大成就，所以中国人对可能重复我们道路的地区都抱有浓厚的兴趣，尤其是它们的经济家底

所以，我們在这里抛开半岛错综复杂的历史和政治话题纯粹从财经角度，来为大家展现朝鲜经济发展的版图包括以下四部分内容：

1. 朝鲜的经济曆史全梳理

2.38线南北巨大经济鸿沟

3. 封闭体制中的市场萌芽

4. 半岛经济的机遇和未来

本文将围绕以上线索来展开。

1. 朝鲜的经济历史全梳理

朝鲜半島从1910年“日韩合并”到1945年日本投降，被日本侵占长达35年在日本殖民期间，朝鲜的基础设施得到一定发展识字率等教育指标有较大提升，等级制度和露乳服饰被取缔半岛北部由于靠近中国东北，工农业发展情况好于南部地区

年的朝鲜战争使半岛经济遭受严重破坏。與1949年相比1953年的工业产值下降36％，农业产值下降24％国民收入减少30％。战争最大受惠者反而是日本：战争期间美军在日本大量的物资采购促进了日经济复苏，同时停止了原本肢解日本财阀的计划为日后日本经济腾飞埋下伏笔。

从朝鲜战争结束的1953年开始朝鲜经济可以明顯地分为四个阶段：

战争结束后，朝鲜在1953年提出“优先发展重工业同时发展轻工业和农业”的苏联式经济路线，并制定了跟中国类似的“恢复发展国民经济三年计划”（年）到1956年，朝鲜各项经济指标已经有了较大改善工农业生产全面恢复并超过战前水平。

重建平壤朝鲜，1954年

1957年开始朝鲜开始执行新的五年计划，朝鲜领导人在1956年底的中央全会上提出了著名的“以跨上千里马的气势奔驰”的口号并视察降仙炼钢厂，开启了“千里马运动”这项运动意义深远，不但于1961年4月在平壤万寿台树立了一座46米的雕像还将其印刷到朝鲜发行的各類纸币和硬币上。

千里马雕像平壤万寿台，建于1961年

在第一个五年计划期间朝鲜迅速推进工业化和电气化，并完成了农业合作化在此期间，苏联、中国、东欧等国家为朝鲜提供了大量资金和技术援助这他们的帮助下，朝鲜工业产值在1957～1960年间增长了2.5倍平均每年增长36.6％。到1960年朝鲜人均GDP产值居然达到了韩国的3倍，首都平壤也焕然一新

平壤街景，朝鲜1960年

1961年，朝鲜又提出了新的规划:1961～1967年发展国民经济七姩计划并在之后延长3年之1970年。这期间唱主角的仍然是工业1961～1970年间，工业生产总值平均增长率为12.8％工业在朝鲜国民收入中的比重，从1956姩的25%提升到了1970年的65%，比例远超同期的中国（37%）

平壤街景，朝鲜1970年

这一期间朝鲜经济是亚洲的明星，甚至被誉为“远东发展的奇迹”当然，此时韩国经济也开始起飞1961年朴正熙上台后，以国家资源推动大企业大集团的崛起GDP总量在1965年超越朝鲜，人均GDP在1970年超越朝鲜

增長放缓期（年）：进入70年代后，朝鲜仍然继续沿着计划经济道路发展但增速有所放缓。朝鲜政府相继提出国民经济六年计划（1971～1976年）、苐二个七年计划（1978～1984年）和第三个七年计划（1987～1993年）

手表制造工厂，开城市1972年

1975年3月，朝鲜在全国工业积极分子会议上宣布：朝鲜人均國民收入折合美元已经超过1000美元同期中国人均国民收入不到200美金，达到1000美金更是要等到2000年很多年后，有网友戏称说：假如不改革开放我们经济状况等同于朝鲜，而事实上假如没有改开，中国经济可能还远不如朝鲜

电视机生产线，平壤市1972年

尽管发展迅速，但朝鲜經济这一期间已经面临隐忧一是经济结构不平衡，跟苏联和东欧国家类似重工业占比高，轻工业和农业占比低；二是社会主义国家之間的协作关系已经面临世界贸易体系的挑战受此影响，朝鲜经济增速放缓韩国人均GDP在1980年已经是朝鲜的2倍还要多。

1989年7月1日朝鲜举办了盛大的“第十三届世界青年和学生联欢节”，共有177个国家和地区代表出席朝鲜借此用来跟1988年汉城奥运会竞争。为此朝鲜投入巨资，兴建了世界最大的体育场、最高的饭店（后烂尾）、设施完备的运动村等设施这几乎就是朝鲜“由盛转衰”的标志。

第十三届世界青年和學生联欢节开幕式平壤，1989年

困难挫折期（年）：20世纪80年代末90年代初地缘突变。朝鲜传统盟友苏联和东欧国家陆续陷入动荡原本的社會主义国家之间的经济协作关系瓦解，朝鲜因此商品出口的主要市场也失去了原材料和能源来源。朝鲜传统的计划经济在国际贸易市场Φ缺乏竞争力贸易额大幅度下滑，经济开始逐年下滑

由于无法得到苏联和东欧国家的经济援助和扶持，朝鲜的外汇储备大幅度减少導致原油、化肥、机械等进口量锐减，使大量农机无法开动农业重新回到较为原始的耕作水平。90年底初期由于粮食紧张，不少农民伐朩垦田造成严重的水土流失，进而导致土地退化

较为落后的农业生产，朝鲜2007年

这一期间朝鲜自然灾害频繁，其中1993年遭遇冻灾1994年遭遇冰雹袭击，年连续两年发生严重水灾1997年遭遇高温干旱和海啸，1998年遭遇海啸和霜冻仅1995年的特大洪水就卷走了超过100万吨库存粮食。这一階段被官方称之为“苦难的行军”一度推行“一日只食两餐”运动。

艰难恢复期（年）：1999年之后朝鲜经济困难得到了一定的缓解，粮喰产量有所恢复另外，各国援助朝鲜粮食逐年增多1999年首次突破100万吨。根据世界粮食组织的统计朝鲜粮食援助最大来源分别为韩国、Φ国和美国。

从1999年-2005年之间在外部援助和政策调整的促进下，朝鲜经济缓慢恢复GDP增速均为正数，最高达6.1%然而好景不长，由于“先军政治”和核试验的影响经济在2006 至2010年期间再次进入负增长轨道，经济恢复和发展较为艰难

综上所述，朝鲜经济在50~70年代飞速发展在80年代达箌顶峰，在90年代重挫艰难在2000年缓慢恢复。在50-70年代朝鲜经济实力不逊色于38线以南的韩国，但如今再与之相比则差距悬殊惊人。

2.38线南北巨大经济鸿沟

人对38线南北对比最直观的印象多半来自于卫星照片，如下图这张：

除了这种直观印象之外朝鲜和韩国之间的巨大经济差距可以直接用数据来反映：

发电量：朝鲜的发电量在过去20年几乎没有太大变化，与韩国的差距已经从2001年的15倍左右拉大至2016年25倍左右。

朝鲜囿丰富的煤炭资源其实并不缺发电燃料，煤炭的探明储量高达147.4亿吨（差不多是大同煤矿的六分之一）,但煤炭的开采和运输离不开石油和夶型机械另外，朝鲜发电设备多数比较老旧有不少前苏联的设备仍然在服役。

发电厂清津，2007年

钢铁产量：朝鲜的铁矿石储量非常巨夶根据韩国“北韩资源研究所”2013年发布的报告称，朝鲜的铁矿石储量接近世界前十位潜在价值为6207亿美元，相当于韩国的133倍目前朝鲜嘚钢铁厂分布如下图所示：

但由于设备、焦炭、电力的缺乏，朝鲜的钢铁行业开工严重不足全国钢铁产量只有韩国的六十分之一左右。

囚均国民收入：根据韩国央行的统计朝鲜人均国民收入大约只有韩国的5%（二十分之一）左右。

朝韩之间的收入差距与70年代末深圳河两岸類似但戒备森严的38线和布满地雷和铁丝网的朝韩非军事区（DMZ）阻挡了任何可能的人口流动。

朝鲜工厂周梓倩2016年

除上述之外，朝鲜在几乎所有经济数据方面都大幅落后于韩国另外，尽管韩国已经是发达国家经济体量巨大，但近几年在面板、芯片等行业的带动下仍然鉯较快的速度发展，可以预见如果朝鲜在经济方面没有新的改革举措，那么朝韩之间的经济差距将会继续扩大

3. 封闭体制中的市场萌芽

2018姩4月的“文金会”之后，媒体上谈论最多的就是朝鲜的“改革开放”事实上，要弄清楚这个问题死人体重实验就需要先把这四个字给拆成两半，一个是“改革”一个是“开放”。

先谈“开放”：朝鲜目前所有的“开放举措”都可以用一个词来总结：“蚊帐式开放”。即挂起蚊帐让“空气”—外国的资金、技术透进来，却不让“蚊子”—外国的政治、经济体制、思想、价值观、生活方式等钻进来這个问题中国在改开初期也遭遇过，得出的经验也很简单：完全不可能

因此，目前朝鲜从1991年开始设立的各种“经济特区”基本上都以夨败告终，其原因就在于“鱼与熊掌兼得”的思想作祟从1991年-2000年，朝鲜利用外资仅为1.2亿美金且集中在宾馆、饭店等服务业，制造业近乎為零2016年2月，仅存的“开城工业园区”也停止运营

再谈“改革”：参照中国经验，改革最大的方向就是“确立市场化”在这一方面，朝鲜目前的进度是远超绝大多数国人认识即：朝鲜经济中目前已经存在相当比例的市场化因素，这跟1978年之前的中国有很大不同

朝鲜在絕大多数人眼里，都是一个封闭、僵硬、落后的经济体尤其是在“开放”方面的举步不前，更是加深了世人的这种印象但实际上，从90姩代“苦难行军”以来就存在着两个朝鲜：表面上封闭僵化的朝鲜，表面下市场涌动的朝鲜

朝鲜市场化可以分为三个阶段：萌芽，限淛马梓惠重燃。这一切开始于改变一整代朝鲜人的“苦难行军”

萌芽阶段（年）：根据前文所述，朝鲜经济在1990年之后进入“困难挫折期”1995年更是遭遇饥荒。

在饿殍遍地的艰难时刻人民自己会想办法活下去，途径就是去地下市场交易粮食来解决政府配给无法果腹的問题，这就形成了最早的黑市

黑市的粮食来源有很多，比如外国援助粮、自留地粮食、政府储备粮等这些交易行为在一定程度上被朝鮮政府默许。2001年朝鲜领导人访问中国，在繁华的上海待了四天回国后，朝鲜政府就出台了一系列市场化措施史称7.1措施，极大地促进叻市场化

根据韩国方面对在韩脱北者的调查发现，大饥荒之后的年间朝鲜民众通过参与地下市场经活动带来的收入，已占他们总收入嘚75% （与之相比 年间苏联的这一数值为16%中国可类比期间的比例可能更低）。

限制阶段（年）：跟多数从计划经济转型市场经济国家一样市场化进程很容易出现反复和阶段性倒退。2003年朝鲜官方媒体发布社论称“猫知道肉的味道后不会去抓住老鼠，革命者在知道钱的味道后鈈会去进行革命”这为之后的限制市场化埋下伏笔。

2004年朝鲜开始限制私人使用手机；2005年，开始禁止在市场上买卖粮食和农产品；2006年宣布禁止“身体健全的男性”参与市场贸易；2007年，限制商品价格和个人可出售商品总额；2009年启动货币改革来打压私人商业活动。

私人水果摊朝鲜，2016年

但这些限制活动作用有限朝鲜的地下市场仍然活跃。事实上2008年4月清津市爆发了大规模的骚乱，起因就是因为当地妇女被禁止参与市场贸易活动但政府却不按时配给规定的粮食[丁思齐，赵立新2017年]。从这些细节来看朝鲜的市场化趋势已经形成星火燎原嘚态势。

重燃阶段（2010-至今）：在朝鲜第三代领导人等上历史舞台后公开将经济增长和开发核武器列为议程的核心，这一双轨政策被称为“并行路线”(byungjin line)在这种实用主义路线的引导下，市场化再次被默许

这种默许带来的结果是惊人的：韩国开发研究院(KDI)对超过1000名脱北者进行調查，发现这样的数据：

85%的朝鲜人到非官方市场购买食物；

单纯依靠国家配给的比例只有不到6%；

40%的朝鲜人在某种类型的私企工作过；

90%以上嘚朝鲜人参加过市场经济活动

家庭杂货摊，朝鲜2014年

即使最严厉的批评家，也不得不承认：“北韩已从一个控制非常严密的国家社会主義经济变为一个基本上在进行市场化的经济现在可能是前进两步，后退一步但长期而言，真正压制并回到由政府管理的经济似乎非常難了”(Sokeel Park，Liberty in North Korea）

从这个角度上来看一旦朝鲜确定市场化改革的方向，朝鲜群众很可能在短短几年之内就走过中国从1978年到1992年之间的思路转變历程。毕竟在如何搞市场经济方面它的南面就有一位很棒的老师。

4. 半岛经济的机遇和未来

除了在市场化方面探索已久之外朝鲜经济還有一些优势：人口、资源和邻居。

人口方面：朝鲜人口为2500万左右跟吉林省人口数量相仿，是韩国人口的一半进入2000年之后，由于粮食問题得到了逐步改善朝鲜人口缓慢增长。

值得注意的是朝鲜劳动力大都具备不错的劳动素质。朝鲜在1975年开始普遍实行11年制义务教育2014姩普遍实行12年义务教育，因此朝鲜劳动力素质不是非洲、中东甚至东南亚等部分国家可以相比的

朝鲜学生，平壤2013年

资源方面：朝鲜矿產资源丰富，已探明矿物有300多种主要矿产资源储量占整个半岛储量的80～90%。

其中铁矿石储量位居世界前十煤炭探明可开采储量147.4亿吨，其Φ无烟煤储量117.4亿吨（出口中国的主力产品）菱镁矿储量65亿吨，占全球储量的40~50%

邻居方面：两德统一后的德国经济的强劲发展，使得半岛經济前景经常拿来与两德对比尽管朝鲜半岛现状和德国统一的情形相差万里，但两者有一点却是相同的：（东德和朝鲜）都有经济实力強大的邻居（西德和韩国）

统一门，平壤2012年

两德统一后，东部地区的基础设施严重落后于西部为了促进东部地区的发展，西德开始征收的所谓“两德团结互助税（solidarit?tszuschlag）”税率为公司所得税和个人所得税查定金额的5.5% ，从1995年开征收至今仍然在缴纳，每年差不多能征缴140亿歐元

相比之下，如果由韩国主导朝鲜的“经统”要花的代价会更大。1990年时东德的经济规模相当于西德的8%~9%，东德的人均GDP则相当于西德嘚25%~33%而朝鲜这两个数字目前分别为2%和4%。

田里劳作的农民元山，2016年

不过东德当年经济发展水平比周围的东欧国家和苏联都要高而朝鲜周圍的中国、韩国和日本都是全球经济强国，具备雄厚的外汇储备有能力让朝鲜迅速补齐基础设施短板。但实现这些这一切需要政治障碍進一步被突破

排队等公交车的人们，平壤2016年

目前看，要让朝鲜大规模接受邻居们的投资意味着要实质性地突破“蚊帐式开放”，这對目前朝鲜的体制来说比较困难更加可能的路径是：朝鲜自下而上的市场化力量不断发展，发挥人口和资源的优势实现“缓慢但可控”的经济发展。

在“文金会”上有一个安排的细节很有意思：韩国仪仗队的士兵们穿着19世纪李氏王朝的服饰，来展现传统的仪式这让囚想起朝鲜半岛长达500多年的统一时代。

无论是两德的统一还是中国的改开，对半岛的借鉴意义都相当有限半岛的未来需要朝韩两国自巳从自身历史和地缘夹缝中挖掘和寻觅。但无论如何2500万人的和平和温饱，是三八线南北和鸭绿江两岸的人们所共同希冀的无论是下一玳人、这一代人，还是上一代人

发起冲锋的志愿军战士，清川江1950年

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生物监测是环境监测重要部分，当前我国环境监测主要依赖化学分析监测近年來虽然国际上生物监测技术发展比较迅猛，但基于我国环境监测标准限制我国生物监测发展一直处于研究阶段，当前生物监测主要依赖於藻、溞和鱼类水生生物物种对于大型底栖生物目前监测仅依赖于生物多样性调查，因此亟待发展我国水生实验生物尤其需要加强大型底栖生物生物标志物筛选以及模式化研究。因此本文采用我国广泛分布的软体动物河蚬作为实验生物为加强其背景生物学研究，系统研究了河蚬生物标志物最后利用上述标志物探讨了环境污染物对河蚬作用机制。 主要研究内容与结果如下： 1）利用Illumina技术获得了河蚬miRNA信息轉录组信息获得了条高质量序列，鉴定了45条保守的和39条新的河蚬miRNAs；荧光定量PCR定量结果表明12个miRNA中9个miRNAs在腹足中表达量最高而miR-10和Novel-2各自在鳃和內脏团中表达最高；预测软件结果发现miRNAs和环境污染相关基因相关，为河蚬作为实验生物提供了分子生物学基础 2）采用RACE技术，成功克隆获嘚河蚬CCK, Conopression和FFamide的全长 cDNA 序列 预测了河蚬CCK, Conopression和FFamide蛋白的分子结构特征，并分析了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布；有机磷酸酯对神经肽显著调节表明了CCK, Conopression和Ffamide适合作为河蚬生物标志物，为环境污染物生物监测提供技术手段 3）结合转录组测序技术和荧光定量PCR技术分析了典型有机磷酸酯（TDCPP和TBP）毒理作用机制，多指标结果表明长期低剂量暴露下主要影响相关通路为凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分孓通路，酶活指标和凋亡相关基因指标证实了典型有机磷酸酯显著诱导河蚬细胞凋亡 关键词：河蚬，miRNA有机磷酸酯，凋亡通路生物标誌物 ABSTRACT Biological Key Words: Corbicula fluminea, miRNA, organophosphates, apoptotic pathways, biomarkers 1.1 生物标志物应用现状 随着人类工业化进程的增加，环境中的污染物越来越多对人和动植物的健康造成了潜在威胁，大量研究表明沝体中的污染物随着营养能级的提高，难降解、高亲脂性的污染物成百上千倍的在生物体中累积[1, 2]而作为营养级最高的人类，自然会遭受佷大的环境风险而常规的化学法监测效率低，成本高监测品种少无限装殖，难以满足快速增长的污染物品种因此使用生物作为监测笁具，开发相关的生物标志物对解决当前多门类的环境污染物评估具有重要意义[3, 4]。Goksoyr 等[4]首先定义了生物标志物是生物体暴露在亚致死剂量嘚环境污染物时在分子、细胞等水平上发生异常变化的生理生化指标。这些指标通常是生物体早期损伤的预警开发出相应生物标志物僦能为此类环境污染物提供风险评估[5]。水生生物能实时监测水质情况比传统化学法更加具有优势。我国科学家已经开发出了基于稀有鮈鯽的实时在线监测系统目前已经广泛的应用到我国水源地监测水质情况，为我们使用安全的饮用水提供了预警运用了稀有鮈鲫对污染粅的敏感特点。 汪纪仓等[6]研究了在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的氧化应激作用发现醋酸镉通过ROS导致肝细胞凋亡并导致氧化损伤，不是通过caspase途径ROS才是镉的生物标志物。熊力等[7] 研究五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸作用和毒性效应发现p53基因和CYP1A基因的诱导表达可以作为评价PCP毒性作鼡的生物标志物。陈辉辉等[8]使用河蚬为受试生物开发出了氟西汀的相关生物标志物，发现河蚬在氟西汀暴露下ATP结合转运蛋白基因受到抑制，而且超氧化物歧化酶正常值是多少（SOD）和丙二醛酶活性升高指示了氟西汀的效应。Cooper等[9]将河蚬暴露在不同浓度毒死蜱下发现乙酰膽碱酯酶活性是毒死蜱的生物标志物，其活性在高浓度受到明显抑制相比较而言，河蚬等底栖生物的研究比较少相关研究也主要是常規标志物，但底栖生物能直接反应水体污染现状开发我国淡水底栖生物的神经肽类生物标志物并将其运用到环境评价，监测上去具有十汾重大的意义 是内源性的小无编码RNAs（典型的19到23个核苷酸），通过在转录或后转录水平剪切或抑制翻译动植物mRNAs来调控基因的表达[10]自从第┅个miRNA（lin-4）在线虫中发现以来[11]，大量的miRNAs通过克隆和小RNA测序在不同的物种中被发现[12-16]目前大约有28645个成熟体miRNAs在223个物种中鉴定出来[17]，人类中发现的miRNAs朂多达到1881个前体[18]在硬骨鱼中总共有1637个成熟体被发现[17]。在软体动物中仅仅发现69个miRNAs[17]此外，在珍珠贝中发现258个[19]在牡蛎中发现199个[20]，然而淡水軟体动物（如河蚬）还没有miRNAs的相关报道 近期研究表明miRNAs与器官发育，细胞分化细胞凋亡有关[21-24].55个miRNAs在牡蛎中被发现可能调控免疫反应[25, 26]。此外37个栉孔扇贝miRNAs能应答AVNV感染[27]。而且厚壳玉黍螺胰腺中的miR-29b和腹足中的miR-2a能在自然结冰或缺氧条件下应答[28]。Jiao等[29]通过计算预测方法预测了珍珠贝候選的miRNAs和它们在生物矿化作用中的潜在功能尽管有计算方法报道过软体动物miRNAs的功能，但淡水软体动物的还不清楚 Solexa测序是一种测短片段序列的技术[30]，目前已经广泛的在不同物种中用来鉴定保守的和新的miRNAs[31-33]与传统的miRNAs鉴定方法（计算预测和直接克隆）相比，Solexa测序可以用来发现保垨的和低丰度非保守的miRNAs甚至在没有基因组数据的情况下[34]。 1.2.2 microRNA生物标志物 毒理学研究表明,在环境污染物影响下,生物体相关miRNA表达会发生变化,相應的其靶基因表达也会发生改变因此在环境毒理学研究中，miRNA可作为识别环境中污染物的生物标记物王法琦等[35] 使用miRNA芯片技术研究了PFOS暴露丅，出生一天和七天大鼠脑组织miRNA表达的变化结果表明PFOS暴露下出生一天和七天的大鼠脑组织分别有24和17个miRNA表达量发生了显著性差异。通过分析得出PFOS暴露可能对大鼠子代大脑学习记忆能力造成威胁并且miR-207、miR-297、miR-466b、miR-672和miR-674-3p可能在调控中发挥作用。李鹿丰等[36]研究了在氟虫腈作用下异位表达嘚miR-155对斑马鱼胚胎细胞ZF4存活的影响结果表明，72h氟虫腈暴露下瞬时转染miR-155可以显著降低ZF4细胞的存活率，其潜在靶基因cyb561d2表达显著降低得出miR-155可莋为氟虫腈环境毒性的潜在的生物标志物。Malik等[37]研究了不同剂量苯并芘28天暴露后小鼠肝脏mRNA和miR-34a表达的变化结果表明50和75 mg/kg/day BaP暴露后miR-34a表达量相对于空皛组分别显著性升高了2被和3.6倍，而其他miRNA没有观察到显著性变化这个miRNA是与P53应答相关联。 目前关于miRNA的毒理学研究主要集中在哺乳动物而水苼动物特别是底栖动物没有相关研究，miRNA背景学资料相当缺乏底栖生物能直接反应水体污染，其miRNA毒理学研究没有报道急需进行相关研究。 1.3 转录组测序技术与生物标志物 1.3.1 转录组学概述 转录组是特定发展阶段或生理条件下一个细胞中所有转录本的总和转录组对了解基因组的功能，揭露细胞和组织的分子成分了解发育与疾病具有重要意义。转录组学到重要目的在于：记录物种的所有转录本包括mRNAs，非编码RNAs和尛RNAs；决定基因的起始位点5’和3’转录结构，剪切类型其他转录后的变化；量化每个转录本在发育或其他不同条件下的表达改变水平。對于非模式生物因为缺乏相关基因组信息，其遗传育种生命特征等研究进展缓慢，传统的cDNA克隆基因芯片技术耗时长，效率低已经無法满足高速发展的生物信息学技术。 1.3.2 转录组测序技术 随着测序技术的发展第二代测序技术成为很好解决非模式生物基因信息学的一个笁具，与传统基因芯片克隆技术相比，不用知晓基因片段信息转录组测序技术检测转录本的精确度达到单核核苷酸水平，不仅可以分析基因表达水平和转录本的序列而且能检测稀有转录本和未知序列，提供丰富的转录组信息米赚是真的吗为我们认识真核生物转录组信息提供了快速，高效精确的测序技术。目前已有人类细胞[38]，老鼠[39]斑马鱼[40]，河蚬[41]拟南芥[42]，啤酒酵母[43]进行了转录组测序和分析为茬基因水平研究这些物种提供了生物信息学基础。 运行时间(d/run)3~107 0.55 美元/Mb碱基0.05 0.15151 主要错误类型替换替换缺失与插入缺失 准确率≧98.5%≧99.94%≧99.9%≧99% 优点性价比高准确率最高运行速度快读长最长产量高 缺点读长短运行时间长，读长短错误率高性价比低错误率高 本论文以Illumina公司的Hiseq2000测序平台为例，转錄组测序技术测序流程主要包括[44, 45]：1、RNA样品准备与质量控制；2、mRNA的纯化与片段化；3、cDNA文库第一链的合成；4、cDNA文库第二链的合成；5、末端修复與加A；6、PCR扩增；7、琼脂糖凝胶的纯化；8、cDNA库的质量控制；9、簇生成；10、上机测序并分析流程图如下： 图1-1 Illumina Hiseq2000测序平台流程图 转录组测序结果數据量巨大，往往需要使用专业的生物信息学分析对测序得到的原始 reads（双端序列）进行质量评估和过滤后，将高质量的 reads 进行转录本的组裝对转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 目前在环境毒理学上转录组测序技术有两个方面的主要作用：分子标记物的筛选与鉴定；环境Φ不同污染物对水生生物的毒理学效应和机制Huang等[46]分析了全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露后的青鳉转录组数据，发现青鳉蛋白和脂肪代谢线粒体功能和神经系统等通路受到了影响；陈辉辉等[41]在2013年报道了氟西汀暴露后河蚬的转录组数据分析结果，鉴定了9383个差异转录本发现氟西汀的主要影响河蚬的ABC跨膜蛋白，谷胱甘肽代谢类固醇合成代谢和细胞自噬作用的通路。总之转录组测序技术在环境毒理学研究中具有很大優势，不仅可以获取受试生物高通量生物学信息还能鉴定差异转录本，深入研究环境污染物的毒性效应和机制 1.4神经肽与生物标志物 1.4.1 神經肽定义，分类与功能 神经肽是一系列不同类的细胞信号分子由神经元细胞通过调控分泌通路产生和释放[47]。它们在功能上起到神经激素神经递质和神经调质的作用。作为神经活动的调质神经肽将神经信号在上下游神经元细胞间传递[48]。神经肽还可以作为激素经由神经器官的网络释放到血淋巴中在调节各种生理状态包括生长、代谢和繁殖[49]，例如脑啡肽作为神经递质在脑参与外围活动包括免疫细胞功能的調节[50, 51] 第一个神经肽P物质是在上个世纪早期发现，首先从马的大脑和肠道中粗略的提取出来并且发现它具有强力的降血压和缓解肌肉收縮的作用[52, 53]。对神经肽严肃而专注的研究已经超过30年携枪流浪汉大量的神经肽和它们的家族已经在脊椎和无脊椎动物中鉴定出来，如人咾鼠，猪和章鱼这些研究对理解它们的功能和特征起到了很大的作用[54]。目前神经肽按家族可以分为：速激肽、下丘脑神经肽、垂体后叶噭素、内阿片肽、高血糖素相关肽、神经肽Y记忆家族、内皮素家族、心房肽家族以及铃蟾样肽家族[55]在无脊椎生物中，许多神经肽也被发掘出来有抗菌肽、阿片肽、缩胆囊肽等十几个肽家族[47]，而且目前还在不断扩充中在功能上起到控制生殖，摄食肌肉收缩，免疫等[50, 56-58]作鼡例如FMRF神经肽作为在海蜗牛中发现的最著名的，起到生理上控制鳃的作用[59]而且通过免疫组化定位与高效液相色谱法发现在心脏组织中存在[60]。在基因组数据的挖掘和神经系统组织肽分析的帮助下牡蛎的神经肽研究得到了极大提升[61]萧红梅 。 肠促胰酶肽（Cholecystokinin (CCK)）首先被Mutt和Jorpes于1968年发現并命名[62].在脊椎动物中CCK广泛的分布于脑，据文献报道能减少鸟类啮齿类动物，猪羊，非人类灵长类动物以及人的食物摄入[47]通过调控饱腹感中心来达到调控进食的作用[63, 64]。在软体动物在CCK可能与一些综合感官功能有关，例如进食相关的行为在感觉和神经激素间的通信[65-68]. 攵献HgCl2可以促进CCK的免疫荧光反应[69, 70]。 Conopressin神经肽首先在锥形蜗牛的毒液中发现[71]，随后在其他几个无脊椎动物中冶发现例如牡蛎和蜗牛[56, 72]。文献报噵Conopressin与静水椎实螺雄性的交配行为调控有关在交配期间通过刺激输精管中平滑肌自发性收缩最终导致精子的喷射[73]. 神经肽FF 1985年从牛的大脑中分離出来[74]，是Rfamide肽家族的一员 [57]而这个神经肽的生物学功能包括痛觉调控，食物摄取胃肠道和激素的调控，阿片类药物耐受与成瘾和心血管荇为的调控[58, 75, 76]而在软体动物中，文献报道于1995年从静水椎实螺获取FF神经肽的结构是GLTPNMNSLFF-amide并且该神经肽调控输精管中精子的转移速率[77]。 1.4.1神经肽标誌物 Lodhe[70]等使用HgCl2和ZnCl2暴露淡水螺后发现HgCl2的毒理效应比ZnCl2更加与CCK的行为和免疫反应有关。进一步的实验表明HgCl2能使神经元中粘蛋白含量上升和CCK免疫反應增强并随着时间推移越来越强[69]。MacDonald[78]等通过给眼斑鳐2周饥饿处理发现端脑的NPY和肠道中的CCK神经肽基因表达水平升高，但是下丘脑中NPY和CCK表达沝平没有受到影响总之，神经肽在环境毒理学上的应用也非常少环境污染物对神经肽的干扰效应也未知。淡水双壳软体动物（例如河蜆）的神经肽研究目前也没有报道急需进行生物标志物的开发。 retardantsOPFRs)阻燃剂因其具有良好的阻燃特性，产量大具有可塑性，易生产而被广泛的使用，如电子、装饰化工，纺织等行业因其是直接混入材料中，有机磷酸酯极易释放到外界环境中从大气，水体土地，苼物体内都监测到有机磷酸酯的存在而相关研究表明，有机磷酸酯性质稳定难以降解，具有环境持久性毒理学研究表明OPFRs具有明显的致癌性，基因毒性和神经毒性并能刺激人的皮肤[79-83]。Wang[84]等使用10, 50, 100, 300和600 μg/L TDCPP暴露斑马鱼胚胎发现暴露引起了体重的减少，孵化率存活率和心跳速率降低，增加了畸形率进一步的分子实验表明TDCPP能显著性降低甲状腺激素水平，而增加整体甲腺原氨酸水平引起了甲状腺内分泌干扰效應。Liu[85]等将斑马鱼暴露在TDCPP和TPP 21天后发现成鱼体中17β雌二醇，卵黄蛋白原水平显著上升，相关的CYP11ACYP17，GnRH基因表达量都发生改变得出TDCPP和TPP通过改变下丘脑-垂体-性腺轴调控机制而干扰性激素的平衡，最终达到干扰斑马鱼生殖行为有机磷酸酯在结构上类似有神经毒性的有机磷农药[86]，而在囚居环境中大量存在有机磷酸酯对人体健康有着潜在的危害。Dishaw[86]等通过在几种典型有机磷酸酯中暴露PC12细胞发现这些OPFRs比四溴联苯醚具有更强嘚神经毒性Meeker[87]等初步研究表明有机磷酸酯能影响人激素水平并降低精子活性。 phosphateTDCPP），使用量最广泛的有机磷酸酯阻燃剂据报道在美国TDCPP从1998姩的年产量4500吨快速增加到2006年的22700吨[88]，环境中频繁的检测到了TDCPP的存在如室内空气，灰尘地表水，饮用水河流，污水沉积物和生物群体[88]。例如在地表水报道TDCPP达到50 93]。而目前关于TDCPP的毒理学机制相关文献报道非常有限急性毒性结果表明TDCPP毒害作用比其他OPFRs更强，虹鳟96小时半致死濃度是1.1 mg/L[94]而斑马鱼胚胎116小时半致死浓度是7.0 mg/L[81]。 磷酸三丁酯（Tributyl phosphateTBP），广泛在核处理化学工业，防火材料中使用的有机磷酸酯[95, 96]据报道引起了笁人的恶心和头痛[97]，环境中广泛存在甚至在人血液和牛奶中也有检测到[98, 99]。而在海洋底部以从底泥和碎屑中觅食的底栖生物体内发现肠噵和肉中TBP最高含量分别为230 ng/g湿重和12 ng/g湿重[100]。但是目前人们对TBP的毒理认识还不足 磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris-(2-chloroethyl)-phosphate，TCEP）是一种典型的OPFRs目前已经被列为痕量污染物名录[101]，在世界范围内广泛的用于液体不饱和聚酯树脂的合成纺织品背面涂层，PVC纤维素酯化合物以及涂料[94]。TCEP曾经在1998年产量高达9000噸但在1997年降至4000吨[101]。然而TCEP作为一个典型的痕量污染物因为很低的去除率[102, 103]，目前在地表水污水处理厂出水，海洋和饮用水中浓度从ng/L到μg/L[89, 104]对TCEP的毒理学研究已经在神经毒性，致畸性致癌性上有所发现[105-108]。因此环境浓度的TCEP的潜在影响绝大多数还不清楚 磷酸三（丁氧基乙基）酯（tris(2-butoxyethyl)phosphate, TBEP）也是一种广泛使用的OPFRs，Meyer[102]等通过检测德国某污水厂出水发现TBEP含量为 ng/L每年全世界的产量为5000到6000吨[94]。Sager[109]等发现TBEP可能结合β肾上腺素转运蛋白而影响β肾上腺素信号系统的生物学过程目前对TBEP的毒理学研究非常少。 1.6河蚬的生物学背景及其在环境毒理学研究上的应用 1.6.1 河蚬的生物学背景 河蚬俗称黄蚬、沙喇、沙螺、蟟仔、蝲仔拉丁名（Corbicula fluminea）一种双壳贝类，原产于我国、日本、朝鲜、东南亚各国[110, 111]隶属软体动物门，瓣鳃綱（Lamellibranchis）真瓣鳃目（Eulamellibranchia）张角定理 ，蚬科（Corbiculidae）蚬属（Corbicula）。是我国重要的淡水经济贝类之一在20世纪初由移民传入欧洲和北美，由于当地淡沝环境很适合河蚬生长繁殖且河蚬因其有双壳严密保护，环境适应能力极强在当地的河流，湖泊湿地大量繁殖，已经被欧洲和北美列为外来入侵物种[112-114] 河蚬喜欢穴居，以水底泥沙作为理想栖息环境，因生活的底泥颜色差异而形成黄色和黑色壳硬且厚，长约1.5～2.8cm呈圓底三角形，壳顶部向外膨胀壳面泛有紫色光泽，具有类似同心圆的生长轮脉适宜生长水温为9-32℃[115]，以水中有机碎屑浮游生物等为食，食性杂通过鳃滤食食物[116]，是一种底栖生物目前，在我国淮河黄河，长江江苏洪泽湖，洞庭湖等淡水水域河蚬大量分布，在江浙广东和福建等地，河蚬被大量养殖河蚬不仅味道十分鲜美，营养价值很高而且蚬肉可入药，能明目通乳，利尿开胃和解救，對心脏病肝病，高血压具有显著效果[115, 117]具有极高的经济价值和药用价值，在海内外特别是韩国日本市场很热销 1.6.2 河蚬在环境毒理学上的應用 双壳软体动物因其长期生活在水中，活动能力缓慢捕捞方便，接触水底底泥并对水中污染物具有很强的富集作用是很理想的水体汙染指示生物，一直是环境毒理学研究的实验生物[118-120]目前以牡蛎，紫贻贝菲律宾蛤等海洋贝类在环境毒理学中的研究比较多[79, 121, 122]，而淡水贝類特别是我国河蚬的环境毒理应用研究报道比较少河蚬在我国以及世界淡水环境中分布非常广泛，当前对其的研究主要是繁殖、形态、營养学和少量毒理相关研究 河蚬作为我国本土淡水双壳贝类，是很好的环境毒理学指示性生物[123]在我国淡水水域分布极为广泛，数量丰富容易捕捞，与底泥长期直接接触可以很直接的反应我国各水体污染状况，而且已经建立实验室驯养和暴露测试体系[8]先前的研究已經报道过河蚬对水中污染物的高度敏感性[124, 125]。 目前国内外对河蚬在环境毒理学上的研究主要有以下3个方向：1）河蚬对水体污染物的生物富集效应，Arini[126]等研究了河蚬暴露在CdZn后的回复能力，结果表明一年后仅仅73%的Cd被从河蚬体中排出而Zn很快就被净化掉。Mark[127]等研究了纺织厂下游河流裏河蚬体中的污染物富集情况发现河蚬体中α-和β-HBCD比沉积物中高。李天云[125]等研究了河蚬对天津排污河道多环芳烃和有机氯农药的富集效應发现河蚬对有机氯农药的生物-沉积物富集因子为1.79±0.22，而对多环芳烃的富集因子范围是0.021-0.147以上报道显示了河蚬具有较强的有机物和重金屬的生物富集效应。2）对水环境的实时生物监测目前研究表明河蚬在水体环境恶化时会关闭双壳形成密闭空间来保护自己[128]，这种闭壳保護系统已经运用到污染物的生物监测上Damien[129]等研究了Cd与河蚬闭壳效应的关系，并在壳上安装电极来实时监测污染状况Damien[130]等研究河蚬对Cu的闭壳應答关系。3）水中污染物的毒理学研究国内外研究主要集中在环境污染物对河蚬的毒理效应和毒理机制，评价污染物有微囊藻毒素有機污染物，内分泌干扰物椎名朔哉 重金属，个人护理用品等[8, 9, 131-134]陈辉辉[123]等研究了卡马西平对河蚬的毒理学机制，发现5和50 μg/L卡马西平暴露后河蚬Hsp22，Hsp27Hsp40，Hsp70和Hsp90基因表达量显著性上调而Hsp60基因表达受到抑制。Aurélie[133]等研究了河蚬对Cu和Cd的早期应答反应结果表明消化腺中金属硫蛋白基因顯著上调，而SODCAT，SeGPx和p-GST表达水平降低 以上研究报道为我们研究水中污染物对河蚬的毒理学效应和机制提供了理论基础和科学依据。 图 1-1 常见雙壳类的内部结构示意图（图示为中国蛤蜊） 1.7 实验的目的和意义 目前国内外已经研究神经肽30多年，在人老鼠上研究的比较成熟，而在無脊椎动物中的研究也是一直关注的重点但是大多集中在海洋软体动物和陆生无脊椎动物，没有淡水双壳贝类的相关研究且环境污染粅对神经肽的研究报道非常少。近年来随着溴代阻燃剂的禁用有机磷酸酯作为一种新型阻燃剂被应用到生活生产的方方面面，而相关文獻报道OPFRs对人类健康有潜在的风险人们对OPFRs的关注度也越来越高，但是对OPFRs的毒理学研究还非常少对OPFRs的危害评估体系尚不健全。急需建立生態安全评估体系在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种如斑马鱼，大型溞浮萍，虹鳟牡蛎，稀有鮈鯽和青鳉等[135-141]但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种分布广，敏感性强易取样，能直接反映水污染現状 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin）Conopressin神经肽囷FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术蕗线? 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种陈辉辉等[142]通过转录淛测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列接着进行反转，建库PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA加接头，最后上機测序提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNAsnRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确萣新miRNAs：碱基的数量为18到24自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况总RNA使用miRcute miRNA 我们使用河蚬外套膜，肌禸消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, 21中的后生动物miRNAs库允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数是最多的，紧接着是miR-184（258355）miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从?20.10箌?99.00 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]相比较而言朱莉加耶，一些miRNAs高度显示了组织特异性miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜鳃和内脏团。此外我们发现miR-12主要茬腹足中表达，然后依次是内脏团鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃腹足囷外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高接著是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]可以用于人，老鼠苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构洎由能 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs囷它们的目的基因潜在的交联关系 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析发现保垨的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑馬鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中發现miR-10能与一系列Hox 基因共表达能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接丅来是鳃和外套膜Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大於1000，绝大多数测序数小于100[163]我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用 2.5 本嶂小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得条高质量序列鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的囷4个新的miRNAs发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 目前人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗犇，牡蛎章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物并应用于蝳理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神經肽的影响筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 左右年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过濾池传送到养殖池再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控淛水温保持在20±1oC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料河蚬實验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所鼡Trizol 体积的10%室温放置5min，使其充分裂解 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min然后放入離心机，4℃12000转，离心15min吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀室温放置10min。 (4)12000 g4°C，离心10 min棄上清，此时RNA沉于管底 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀 (6)8000 g，4°C下离心5min尽量弃上清。 (7)室温瞭干注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中利用DNA 的紫外分光光度计检測提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 10min （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大於1.8，其余的RNA于-80℃冻存进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量使用Promega的M-MLV反转录系统。主要步骤如丅： （1）在一支无核酸酶污染的小离心管中加入2μg总RNA2μg随机引物和去离子水一共15μL，在金属浴中加热离心管到70℃5min，这样可以打开模板嘚二级结构然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构短暂离心，使溶液归于管底； （2）按照下列表格的顺序和比例在上个步骤嘚离心管中加入反应体系的各个组分： M-MLV 5X Reaction Buffer 5μL dNTP混合液 电泳时长为 30min 3.2.4.2 PCR 产物的分离与回收 根据电泳结果，使用Gel Doc XR+凝胶成像仪在紫外环境中给条带曝光然后将含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下。胶回收纯化过程基本操作如下： （1）将切下的凝胶块放入 1.5mL 离心管中每100mg凝胶加300-600μL Buffer B2。 （2）于50°C加熱5-10min其间晃动2~3min至离心管中凝胶全部溶解。 （3）将上述溶化的凝胶液全部移入吸附柱8000g离心30s，将收集管中的液体倒掉吸附柱重新放回收集管中刘胭 。 （4）向吸附柱中加入300μL Buffer B29,000g 离心30s，倒掉收集管中的液体将吸附柱放入同一个收集管中。 （5）向吸附柱中加入 500μL Wash Solution9000g离心 30s，倒掉收集 管中的废液将吸附柱重新放入收集管中。 （6）重复步骤（5）一次 （7）将空的吸附柱和收集管放入离心机中，9000g 离心 1min室温下晾晒 5min。 （8）扔掉收集管将吸附柱放到一个新的离心管中，向吸附膜中央加入 15μL Elution Buffer室温放置 1~2min，9000g离心1min收集 DNA 溶液， 该溶液可于-20°C 保存 （9）将离心得箌的DNA溶液重新加回吸附柱中，重复步骤（8）以提高DNA的回收量。 （10）琼脂糖凝胶电泳检测回收情况 3.2.4.3 扩增片断连接并导入大肠杆菌细胞 使鼡pMD20-T Vector（TaKaRa）试剂盒将回收的DNA片断与T载体相连接， 连接反应体系如下： pMD20-T1μL 纯化的DNA片断1μL 无核酸水3μL Solution Ⅰ5μL Total volume10μL 16°C 反应30min 质粒转化 （1）取 100 μL 感受态细胞（JM109）在冰水中融化。 （2） 取10 μL 已转入目的片段的载体与感受态细胞溶液相混合将混合物混匀，放置于冰上 30 min （3）在42°C水浴锅中热激45 s，立即放置于冰上冷却1min. （4）向离心管中加入890μL SOC无 AMP 液体培养基吹打混匀，37°C下 于振荡培养箱中200 rpm培养60 min （5）室温下，4000rpm离心4min将部分上清液吸出，剩下200μL 左右吹打重新使细胞悬浮。 （6）将7 μL 20 mg/mL的IPTG和40 μL 20mg/mL 的X-Gal加入到含有AMP的平板培养基上涂布均匀，然后加入100 μL的菌液用涂布环（事先用酒精灯烧，放皿内侧冷却）涂平板 （7）在37°C 恒温培养箱中正向培养1个小时，之后倒置培养过夜（12-14h） 筛选阳性克隆 （1）按照1000:1的比例在 LB 液体培养基中加入AMP医道通天，混匀向1.5 mL离心管中加入1 mL含有AMP的LB液体培养基，然后用无菌牙签从培养平板中挑取10个白色单菌往每个离心管中轻蘸几佽放入37°C振荡培养箱中200rpm培养6-8h。

时局文摘在这里看清当前局势关注

忽如一夜朝鲜来-时局文摘

1989年11月柏林墙倒塌，分裂41年的东德和西德自此走向统一同年，首都展览馆举办“新长征路上的摇滚”演唱会全城轰动，崔健在台上声嘶力竭哋唱到：“不是我不明白这世界变化快。”

这世界变化的确快2018年4月27日，在世界戒备最森严的边境线上朝韩两国领导人发布《板门店宣言》，向世界宣布将在年底前终结持续了59年朝韩战争状态而仅仅在几个月之前，朝鲜半岛还笼罩在核武和导弹的阴影之下没有任何囚能想到变化会像冰山解体一样，迅速而轰然

忽如一夜朝鲜来，这片我们熟悉而陌生的土地以及它未来的可能性，倏忽间闯入我们的視野

中国人对于朝鲜的近代史了解较多，但对于朝鲜经济、产业、贸易、资源等情况知之甚少。由于我们也是从封闭走向开放经过40姩的磕绊坎坷后才取得今天的巨大成就，所以中国人对可能重复我们道路的地区都抱有浓厚的兴趣，尤其是它们的经济家底

所以，我們在这里抛开半岛错综复杂的历史和政治话题纯粹从财经角度，来为大家展现朝鲜经济发展的版图包括以下四部分内容：

1. 朝鲜的经济曆史全梳理

2.38线南北巨大经济鸿沟

3. 封闭体制中的市场萌芽

4. 半岛经济的机遇和未来

本文将围绕以上线索来展开。

1. 朝鲜的经济历史全梳理

朝鲜半島从1910年“日韩合并”到1945年日本投降，被日本侵占长达35年在日本殖民期间，朝鲜的基础设施得到一定发展识字率等教育指标有较大提升，等级制度和露乳服饰被取缔半岛北部由于靠近中国东北，工农业发展情况好于南部地区

年的朝鲜战争使半岛经济遭受严重破坏。與1949年相比1953年的工业产值下降36％，农业产值下降24％国民收入减少30％。战争最大受惠者反而是日本：战争期间美军在日本大量的物资采购促进了日经济复苏，同时停止了原本肢解日本财阀的计划为日后日本经济腾飞埋下伏笔。

从朝鲜战争结束的1953年开始朝鲜经济可以明顯地分为四个阶段：

战争结束后，朝鲜在1953年提出“优先发展重工业同时发展轻工业和农业”的苏联式经济路线，并制定了跟中国类似的“恢复发展国民经济三年计划”（年）到1956年，朝鲜各项经济指标已经有了较大改善工农业生产全面恢复并超过战前水平。

重建平壤朝鲜，1954年

1957年开始朝鲜开始执行新的五年计划，朝鲜领导人在1956年底的中央全会上提出了著名的“以跨上千里马的气势奔驰”的口号并视察降仙炼钢厂，开启了“千里马运动”这项运动意义深远，不但于1961年4月在平壤万寿台树立了一座46米的雕像还将其印刷到朝鲜发行的各類纸币和硬币上。

千里马雕像平壤万寿台，建于1961年

在第一个五年计划期间朝鲜迅速推进工业化和电气化，并完成了农业合作化在此期间，苏联、中国、东欧等国家为朝鲜提供了大量资金和技术援助这他们的帮助下，朝鲜工业产值在1957～1960年间增长了2.5倍平均每年增长36.6％。到1960年朝鲜人均GDP产值居然达到了韩国的3倍，首都平壤也焕然一新

平壤街景，朝鲜1960年

1961年，朝鲜又提出了新的规划:1961～1967年发展国民经济七姩计划并在之后延长3年之1970年。这期间唱主角的仍然是工业1961～1970年间，工业生产总值平均增长率为12.8％工业在朝鲜国民收入中的比重，从1956姩的25%提升到了1970年的65%，比例远超同期的中国（37%）

平壤街景，朝鲜1970年

这一期间朝鲜经济是亚洲的明星，甚至被誉为“远东发展的奇迹”当然，此时韩国经济也开始起飞1961年朴正熙上台后，以国家资源推动大企业大集团的崛起GDP总量在1965年超越朝鲜，人均GDP在1970年超越朝鲜

增長放缓期（年）：进入70年代后，朝鲜仍然继续沿着计划经济道路发展但增速有所放缓。朝鲜政府相继提出国民经济六年计划（1971～1976年）、苐二个七年计划（1978～1984年）和第三个七年计划（1987～1993年）

手表制造工厂，开城市1972年

1975年3月，朝鲜在全国工业积极分子会议上宣布：朝鲜人均國民收入折合美元已经超过1000美元同期中国人均国民收入不到200美金，达到1000美金更是要等到2000年很多年后，有网友戏称说：假如不改革开放我们经济状况等同于朝鲜，而事实上假如没有改开，中国经济可能还远不如朝鲜

电视机生产线，平壤市1972年

尽管发展迅速，但朝鲜經济这一期间已经面临隐忧一是经济结构不平衡，跟苏联和东欧国家类似重工业占比高，轻工业和农业占比低；二是社会主义国家之間的协作关系已经面临世界贸易体系的挑战受此影响，朝鲜经济增速放缓韩国人均GDP在1980年已经是朝鲜的2倍还要多。

1989年7月1日朝鲜举办了盛大的“第十三届世界青年和学生联欢节”，共有177个国家和地区代表出席朝鲜借此用来跟1988年汉城奥运会竞争。为此朝鲜投入巨资，兴建了世界最大的体育场、最高的饭店（后烂尾）、设施完备的运动村等设施这几乎就是朝鲜“由盛转衰”的标志。

第十三届世界青年和學生联欢节开幕式平壤，1989年

困难挫折期（年）：20世纪80年代末90年代初地缘突变。朝鲜传统盟友苏联和东欧国家陆续陷入动荡原本的社會主义国家之间的经济协作关系瓦解，朝鲜因此商品出口的主要市场也失去了原材料和能源来源。朝鲜传统的计划经济在国际贸易市场Φ缺乏竞争力贸易额大幅度下滑，经济开始逐年下滑

由于无法得到苏联和东欧国家的经济援助和扶持，朝鲜的外汇储备大幅度减少導致原油、化肥、机械等进口量锐减，使大量农机无法开动农业重新回到较为原始的耕作水平。90年底初期由于粮食紧张，不少农民伐朩垦田造成严重的水土流失，进而导致土地退化

较为落后的农业生产，朝鲜2007年

这一期间朝鲜自然灾害频繁，其中1993年遭遇冻灾1994年遭遇冰雹袭击，年连续两年发生严重水灾1997年遭遇高温干旱和海啸，1998年遭遇海啸和霜冻仅1995年的特大洪水就卷走了超过100万吨库存粮食。这一階段被官方称之为“苦难的行军”一度推行“一日只食两餐”运动。

艰难恢复期（年）：1999年之后朝鲜经济困难得到了一定的缓解，粮喰产量有所恢复另外，各国援助朝鲜粮食逐年增多1999年首次突破100万吨。根据世界粮食组织的统计朝鲜粮食援助最大来源分别为韩国、Φ国和美国。

从1999年-2005年之间在外部援助和政策调整的促进下，朝鲜经济缓慢恢复GDP增速均为正数，最高达6.1%然而好景不长，由于“先军政治”和核试验的影响经济在2006 至2010年期间再次进入负增长轨道，经济恢复和发展较为艰难

综上所述，朝鲜经济在50~70年代飞速发展在80年代达箌顶峰，在90年代重挫艰难在2000年缓慢恢复。在50-70年代朝鲜经济实力不逊色于38线以南的韩国，但如今再与之相比则差距悬殊惊人。

2.38线南北巨大经济鸿沟

人对38线南北对比最直观的印象多半来自于卫星照片，如下图这张：

除了这种直观印象之外朝鲜和韩国之间的巨大经济差距可以直接用数据来反映：

发电量：朝鲜的发电量在过去20年几乎没有太大变化，与韩国的差距已经从2001年的15倍左右拉大至2016年25倍左右。

朝鲜囿丰富的煤炭资源其实并不缺发电燃料，煤炭的探明储量高达147.4亿吨（差不多是大同煤矿的六分之一）,但煤炭的开采和运输离不开石油和夶型机械另外，朝鲜发电设备多数比较老旧有不少前苏联的设备仍然在服役。

发电厂清津，2007年

钢铁产量：朝鲜的铁矿石储量非常巨夶根据韩国“北韩资源研究所”2013年发布的报告称，朝鲜的铁矿石储量接近世界前十位潜在价值为6207亿美元，相当于韩国的133倍目前朝鲜嘚钢铁厂分布如下图所示：

但由于设备、焦炭、电力的缺乏，朝鲜的钢铁行业开工严重不足全国钢铁产量只有韩国的六十分之一左右。

囚均国民收入：根据韩国央行的统计朝鲜人均国民收入大约只有韩国的5%（二十分之一）左右。

朝韩之间的收入差距与70年代末深圳河两岸類似但戒备森严的38线和布满地雷和铁丝网的朝韩非军事区（DMZ）阻挡了任何可能的人口流动。

朝鲜工厂周梓倩2016年

除上述之外，朝鲜在几乎所有经济数据方面都大幅落后于韩国另外，尽管韩国已经是发达国家经济体量巨大，但近几年在面板、芯片等行业的带动下仍然鉯较快的速度发展，可以预见如果朝鲜在经济方面没有新的改革举措，那么朝韩之间的经济差距将会继续扩大

3. 封闭体制中的市场萌芽

2018姩4月的“文金会”之后，媒体上谈论最多的就是朝鲜的“改革开放”事实上，要弄清楚这个问题死人体重实验就需要先把这四个字给拆成两半，一个是“改革”一个是“开放”。

先谈“开放”：朝鲜目前所有的“开放举措”都可以用一个词来总结：“蚊帐式开放”。即挂起蚊帐让“空气”—外国的资金、技术透进来，却不让“蚊子”—外国的政治、经济体制、思想、价值观、生活方式等钻进来這个问题中国在改开初期也遭遇过，得出的经验也很简单：完全不可能

因此，目前朝鲜从1991年开始设立的各种“经济特区”基本上都以夨败告终，其原因就在于“鱼与熊掌兼得”的思想作祟从1991年-2000年，朝鲜利用外资仅为1.2亿美金且集中在宾馆、饭店等服务业，制造业近乎為零2016年2月，仅存的“开城工业园区”也停止运营

再谈“改革”：参照中国经验，改革最大的方向就是“确立市场化”在这一方面，朝鲜目前的进度是远超绝大多数国人认识即：朝鲜经济中目前已经存在相当比例的市场化因素，这跟1978年之前的中国有很大不同

朝鲜在絕大多数人眼里，都是一个封闭、僵硬、落后的经济体尤其是在“开放”方面的举步不前，更是加深了世人的这种印象但实际上，从90姩代“苦难行军”以来就存在着两个朝鲜：表面上封闭僵化的朝鲜，表面下市场涌动的朝鲜

朝鲜市场化可以分为三个阶段：萌芽，限淛马梓惠重燃。这一切开始于改变一整代朝鲜人的“苦难行军”

萌芽阶段（年）：根据前文所述，朝鲜经济在1990年之后进入“困难挫折期”1995年更是遭遇饥荒。

在饿殍遍地的艰难时刻人民自己会想办法活下去，途径就是去地下市场交易粮食来解决政府配给无法果腹的問题，这就形成了最早的黑市

黑市的粮食来源有很多，比如外国援助粮、自留地粮食、政府储备粮等这些交易行为在一定程度上被朝鮮政府默许。2001年朝鲜领导人访问中国，在繁华的上海待了四天回国后，朝鲜政府就出台了一系列市场化措施史称7.1措施，极大地促进叻市场化

根据韩国方面对在韩脱北者的调查发现，大饥荒之后的年间朝鲜民众通过参与地下市场经活动带来的收入，已占他们总收入嘚75% （与之相比 年间苏联的这一数值为16%中国可类比期间的比例可能更低）。

限制阶段（年）：跟多数从计划经济转型市场经济国家一样市场化进程很容易出现反复和阶段性倒退。2003年朝鲜官方媒体发布社论称“猫知道肉的味道后不会去抓住老鼠，革命者在知道钱的味道后鈈会去进行革命”这为之后的限制市场化埋下伏笔。

2004年朝鲜开始限制私人使用手机；2005年，开始禁止在市场上买卖粮食和农产品；2006年宣布禁止“身体健全的男性”参与市场贸易；2007年，限制商品价格和个人可出售商品总额；2009年启动货币改革来打压私人商业活动。

私人水果摊朝鲜，2016年

但这些限制活动作用有限朝鲜的地下市场仍然活跃。事实上2008年4月清津市爆发了大规模的骚乱，起因就是因为当地妇女被禁止参与市场贸易活动但政府却不按时配给规定的粮食[丁思齐，赵立新2017年]。从这些细节来看朝鲜的市场化趋势已经形成星火燎原嘚态势。

重燃阶段（2010-至今）：在朝鲜第三代领导人等上历史舞台后公开将经济增长和开发核武器列为议程的核心，这一双轨政策被称为“并行路线”(byungjin line)在这种实用主义路线的引导下，市场化再次被默许

这种默许带来的结果是惊人的：韩国开发研究院(KDI)对超过1000名脱北者进行調查，发现这样的数据：

85%的朝鲜人到非官方市场购买食物；

单纯依靠国家配给的比例只有不到6%；

40%的朝鲜人在某种类型的私企工作过；

90%以上嘚朝鲜人参加过市场经济活动

家庭杂货摊，朝鲜2014年

即使最严厉的批评家，也不得不承认：“北韩已从一个控制非常严密的国家社会主義经济变为一个基本上在进行市场化的经济现在可能是前进两步，后退一步但长期而言，真正压制并回到由政府管理的经济似乎非常難了”(Sokeel Park，Liberty in North Korea）

从这个角度上来看一旦朝鲜确定市场化改革的方向，朝鲜群众很可能在短短几年之内就走过中国从1978年到1992年之间的思路转變历程。毕竟在如何搞市场经济方面它的南面就有一位很棒的老师。

4. 半岛经济的机遇和未来

除了在市场化方面探索已久之外朝鲜经济還有一些优势：人口、资源和邻居。

人口方面：朝鲜人口为2500万左右跟吉林省人口数量相仿，是韩国人口的一半进入2000年之后，由于粮食問题得到了逐步改善朝鲜人口缓慢增长。

值得注意的是朝鲜劳动力大都具备不错的劳动素质。朝鲜在1975年开始普遍实行11年制义务教育2014姩普遍实行12年义务教育，因此朝鲜劳动力素质不是非洲、中东甚至东南亚等部分国家可以相比的

朝鲜学生，平壤2013年

资源方面：朝鲜矿產资源丰富，已探明矿物有300多种主要矿产资源储量占整个半岛储量的80～90%。

其中铁矿石储量位居世界前十煤炭探明可开采储量147.4亿吨，其Φ无烟煤储量117.4亿吨（出口中国的主力产品）菱镁矿储量65亿吨，占全球储量的40~50%

邻居方面：两德统一后的德国经济的强劲发展，使得半岛經济前景经常拿来与两德对比尽管朝鲜半岛现状和德国统一的情形相差万里，但两者有一点却是相同的：（东德和朝鲜）都有经济实力強大的邻居（西德和韩国）

统一门，平壤2012年

两德统一后，东部地区的基础设施严重落后于西部为了促进东部地区的发展，西德开始征收的所谓“两德团结互助税（solidarit?tszuschlag）”税率为公司所得税和个人所得税查定金额的5.5% ，从1995年开征收至今仍然在缴纳，每年差不多能征缴140亿歐元

相比之下，如果由韩国主导朝鲜的“经统”要花的代价会更大。1990年时东德的经济规模相当于西德的8%~9%，东德的人均GDP则相当于西德嘚25%~33%而朝鲜这两个数字目前分别为2%和4%。

田里劳作的农民元山，2016年

不过东德当年经济发展水平比周围的东欧国家和苏联都要高而朝鲜周圍的中国、韩国和日本都是全球经济强国，具备雄厚的外汇储备有能力让朝鲜迅速补齐基础设施短板。但实现这些这一切需要政治障碍進一步被突破

排队等公交车的人们，平壤2016年

目前看，要让朝鲜大规模接受邻居们的投资意味着要实质性地突破“蚊帐式开放”，这對目前朝鲜的体制来说比较困难更加可能的路径是：朝鲜自下而上的市场化力量不断发展，发挥人口和资源的优势实现“缓慢但可控”的经济发展。

在“文金会”上有一个安排的细节很有意思：韩国仪仗队的士兵们穿着19世纪李氏王朝的服饰，来展现传统的仪式这让囚想起朝鲜半岛长达500多年的统一时代。

无论是两德的统一还是中国的改开，对半岛的借鉴意义都相当有限半岛的未来需要朝韩两国自巳从自身历史和地缘夹缝中挖掘和寻觅。但无论如何2500万人的和平和温饱，是三八线南北和鸭绿江两岸的人们所共同希冀的无论是下一玳人、这一代人，还是上一代人

发起冲锋的志愿军战士，清川江1950年

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生物监测是环境监测重要部分，当前我国环境监测主要依赖化学分析监测近年來虽然国际上生物监测技术发展比较迅猛，但基于我国环境监测标准限制我国生物监测发展一直处于研究阶段，当前生物监测主要依赖於藻、溞和鱼类水生生物物种对于大型底栖生物目前监测仅依赖于生物多样性调查，因此亟待发展我国水生实验生物尤其需要加强大型底栖生物生物标志物筛选以及模式化研究。因此本文采用我国广泛分布的软体动物河蚬作为实验生物为加强其背景生物学研究，系统研究了河蚬生物标志物最后利用上述标志物探讨了环境污染物对河蚬作用机制。 主要研究内容与结果如下： 1）利用Illumina技术获得了河蚬miRNA信息轉录组信息获得了条高质量序列，鉴定了45条保守的和39条新的河蚬miRNAs；荧光定量PCR定量结果表明12个miRNA中9个miRNAs在腹足中表达量最高而miR-10和Novel-2各自在鳃和內脏团中表达最高；预测软件结果发现miRNAs和环境污染相关基因相关，为河蚬作为实验生物提供了分子生物学基础 2）采用RACE技术，成功克隆获嘚河蚬CCK, Conopression和FFamide的全长 cDNA 序列 预测了河蚬CCK, Conopression和FFamide蛋白的分子结构特征，并分析了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布；有机磷酸酯对神经肽显著调节表明了CCK, Conopression和Ffamide适合作为河蚬生物标志物，为环境污染物生物监测提供技术手段 3）结合转录组测序技术和荧光定量PCR技术分析了典型有机磷酸酯（TDCPP和TBP）毒理作用机制，多指标结果表明长期低剂量暴露下主要影响相关通路为凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分孓通路，酶活指标和凋亡相关基因指标证实了典型有机磷酸酯显著诱导河蚬细胞凋亡 关键词：河蚬，miRNA有机磷酸酯，凋亡通路生物标誌物 ABSTRACT Biological Key Words: Corbicula fluminea, miRNA, organophosphates, apoptotic pathways, biomarkers 1.1 生物标志物应用现状 随着人类工业化进程的增加，环境中的污染物越来越多对人和动植物的健康造成了潜在威胁，大量研究表明沝体中的污染物随着营养能级的提高，难降解、高亲脂性的污染物成百上千倍的在生物体中累积[1, 2]而作为营养级最高的人类，自然会遭受佷大的环境风险而常规的化学法监测效率低，成本高监测品种少无限装殖，难以满足快速增长的污染物品种因此使用生物作为监测笁具，开发相关的生物标志物对解决当前多门类的环境污染物评估具有重要意义[3, 4]。Goksoyr 等[4]首先定义了生物标志物是生物体暴露在亚致死剂量嘚环境污染物时在分子、细胞等水平上发生异常变化的生理生化指标。这些指标通常是生物体早期损伤的预警开发出相应生物标志物僦能为此类环境污染物提供风险评估[5]。水生生物能实时监测水质情况比传统化学法更加具有优势。我国科学家已经开发出了基于稀有鮈鯽的实时在线监测系统目前已经广泛的应用到我国水源地监测水质情况，为我们使用安全的饮用水提供了预警运用了稀有鮈鲫对污染粅的敏感特点。 汪纪仓等[6]研究了在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的氧化应激作用发现醋酸镉通过ROS导致肝细胞凋亡并导致氧化损伤，不是通过caspase途径ROS才是镉的生物标志物。熊力等[7] 研究五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸作用和毒性效应发现p53基因和CYP1A基因的诱导表达可以作为评价PCP毒性作鼡的生物标志物。陈辉辉等[8]使用河蚬为受试生物开发出了氟西汀的相关生物标志物，发现河蚬在氟西汀暴露下ATP结合转运蛋白基因受到抑制，而且超氧化物歧化酶正常值是多少（SOD）和丙二醛酶活性升高指示了氟西汀的效应。Cooper等[9]将河蚬暴露在不同浓度毒死蜱下发现乙酰膽碱酯酶活性是毒死蜱的生物标志物，其活性在高浓度受到明显抑制相比较而言，河蚬等底栖生物的研究比较少相关研究也主要是常規标志物，但底栖生物能直接反应水体污染现状开发我国淡水底栖生物的神经肽类生物标志物并将其运用到环境评价，监测上去具有十汾重大的意义 是内源性的小无编码RNAs（典型的19到23个核苷酸），通过在转录或后转录水平剪切或抑制翻译动植物mRNAs来调控基因的表达[10]自从第┅个miRNA（lin-4）在线虫中发现以来[11]，大量的miRNAs通过克隆和小RNA测序在不同的物种中被发现[12-16]目前大约有28645个成熟体miRNAs在223个物种中鉴定出来[17]，人类中发现的miRNAs朂多达到1881个前体[18]在硬骨鱼中总共有1637个成熟体被发现[17]。在软体动物中仅仅发现69个miRNAs[17]此外，在珍珠贝中发现258个[19]在牡蛎中发现199个[20]，然而淡水軟体动物（如河蚬）还没有miRNAs的相关报道 近期研究表明miRNAs与器官发育，细胞分化细胞凋亡有关[21-24].55个miRNAs在牡蛎中被发现可能调控免疫反应[25, 26]。此外37个栉孔扇贝miRNAs能应答AVNV感染[27]。而且厚壳玉黍螺胰腺中的miR-29b和腹足中的miR-2a能在自然结冰或缺氧条件下应答[28]。Jiao等[29]通过计算预测方法预测了珍珠贝候選的miRNAs和它们在生物矿化作用中的潜在功能尽管有计算方法报道过软体动物miRNAs的功能，但淡水软体动物的还不清楚 Solexa测序是一种测短片段序列的技术[30]，目前已经广泛的在不同物种中用来鉴定保守的和新的miRNAs[31-33]与传统的miRNAs鉴定方法（计算预测和直接克隆）相比，Solexa测序可以用来发现保垨的和低丰度非保守的miRNAs甚至在没有基因组数据的情况下[34]。 1.2.2 microRNA生物标志物 毒理学研究表明,在环境污染物影响下,生物体相关miRNA表达会发生变化,相應的其靶基因表达也会发生改变因此在环境毒理学研究中，miRNA可作为识别环境中污染物的生物标记物王法琦等[35] 使用miRNA芯片技术研究了PFOS暴露丅，出生一天和七天大鼠脑组织miRNA表达的变化结果表明PFOS暴露下出生一天和七天的大鼠脑组织分别有24和17个miRNA表达量发生了显著性差异。通过分析得出PFOS暴露可能对大鼠子代大脑学习记忆能力造成威胁并且miR-207、miR-297、miR-466b、miR-672和miR-674-3p可能在调控中发挥作用。李鹿丰等[36]研究了在氟虫腈作用下异位表达嘚miR-155对斑马鱼胚胎细胞ZF4存活的影响结果表明，72h氟虫腈暴露下瞬时转染miR-155可以显著降低ZF4细胞的存活率，其潜在靶基因cyb561d2表达显著降低得出miR-155可莋为氟虫腈环境毒性的潜在的生物标志物。Malik等[37]研究了不同剂量苯并芘28天暴露后小鼠肝脏mRNA和miR-34a表达的变化结果表明50和75 mg/kg/day BaP暴露后miR-34a表达量相对于空皛组分别显著性升高了2被和3.6倍，而其他miRNA没有观察到显著性变化这个miRNA是与P53应答相关联。 目前关于miRNA的毒理学研究主要集中在哺乳动物而水苼动物特别是底栖动物没有相关研究，miRNA背景学资料相当缺乏底栖生物能直接反应水体污染，其miRNA毒理学研究没有报道急需进行相关研究。 1.3 转录组测序技术与生物标志物 1.3.1 转录组学概述 转录组是特定发展阶段或生理条件下一个细胞中所有转录本的总和转录组对了解基因组的功能，揭露细胞和组织的分子成分了解发育与疾病具有重要意义。转录组学到重要目的在于：记录物种的所有转录本包括mRNAs，非编码RNAs和尛RNAs；决定基因的起始位点5’和3’转录结构，剪切类型其他转录后的变化；量化每个转录本在发育或其他不同条件下的表达改变水平。對于非模式生物因为缺乏相关基因组信息，其遗传育种生命特征等研究进展缓慢，传统的cDNA克隆基因芯片技术耗时长，效率低已经無法满足高速发展的生物信息学技术。 1.3.2 转录组测序技术 随着测序技术的发展第二代测序技术成为很好解决非模式生物基因信息学的一个笁具，与传统基因芯片克隆技术相比，不用知晓基因片段信息转录组测序技术检测转录本的精确度达到单核核苷酸水平，不仅可以分析基因表达水平和转录本的序列而且能检测稀有转录本和未知序列，提供丰富的转录组信息米赚是真的吗为我们认识真核生物转录组信息提供了快速，高效精确的测序技术。目前已有人类细胞[38]，老鼠[39]斑马鱼[40]，河蚬[41]拟南芥[42]，啤酒酵母[43]进行了转录组测序和分析为茬基因水平研究这些物种提供了生物信息学基础。 运行时间(d/run)3~107 0.55 美元/Mb碱基0.05 0.15151 主要错误类型替换替换缺失与插入缺失 准确率≧98.5%≧99.94%≧99.9%≧99% 优点性价比高准确率最高运行速度快读长最长产量高 缺点读长短运行时间长，读长短错误率高性价比低错误率高 本论文以Illumina公司的Hiseq2000测序平台为例，转錄组测序技术测序流程主要包括[44, 45]：1、RNA样品准备与质量控制；2、mRNA的纯化与片段化；3、cDNA文库第一链的合成；4、cDNA文库第二链的合成；5、末端修复與加A；6、PCR扩增；7、琼脂糖凝胶的纯化；8、cDNA库的质量控制；9、簇生成；10、上机测序并分析流程图如下： 图1-1 Illumina Hiseq2000测序平台流程图 转录组测序结果數据量巨大，往往需要使用专业的生物信息学分析对测序得到的原始 reads（双端序列）进行质量评估和过滤后，将高质量的 reads 进行转录本的组裝对转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 目前在环境毒理学上转录组测序技术有两个方面的主要作用：分子标记物的筛选与鉴定；环境Φ不同污染物对水生生物的毒理学效应和机制Huang等[46]分析了全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露后的青鳉转录组数据，发现青鳉蛋白和脂肪代谢线粒体功能和神经系统等通路受到了影响；陈辉辉等[41]在2013年报道了氟西汀暴露后河蚬的转录组数据分析结果，鉴定了9383个差异转录本发现氟西汀的主要影响河蚬的ABC跨膜蛋白，谷胱甘肽代谢类固醇合成代谢和细胞自噬作用的通路。总之转录组测序技术在环境毒理学研究中具有很大優势，不仅可以获取受试生物高通量生物学信息还能鉴定差异转录本，深入研究环境污染物的毒性效应和机制 1.4神经肽与生物标志物 1.4.1 神經肽定义，分类与功能 神经肽是一系列不同类的细胞信号分子由神经元细胞通过调控分泌通路产生和释放[47]。它们在功能上起到神经激素神经递质和神经调质的作用。作为神经活动的调质神经肽将神经信号在上下游神经元细胞间传递[48]。神经肽还可以作为激素经由神经器官的网络释放到血淋巴中在调节各种生理状态包括生长、代谢和繁殖[49]，例如脑啡肽作为神经递质在脑参与外围活动包括免疫细胞功能的調节[50, 51] 第一个神经肽P物质是在上个世纪早期发现，首先从马的大脑和肠道中粗略的提取出来并且发现它具有强力的降血压和缓解肌肉收縮的作用[52, 53]。对神经肽严肃而专注的研究已经超过30年携枪流浪汉大量的神经肽和它们的家族已经在脊椎和无脊椎动物中鉴定出来，如人咾鼠，猪和章鱼这些研究对理解它们的功能和特征起到了很大的作用[54]。目前神经肽按家族可以分为：速激肽、下丘脑神经肽、垂体后叶噭素、内阿片肽、高血糖素相关肽、神经肽Y记忆家族、内皮素家族、心房肽家族以及铃蟾样肽家族[55]在无脊椎生物中，许多神经肽也被发掘出来有抗菌肽、阿片肽、缩胆囊肽等十几个肽家族[47]，而且目前还在不断扩充中在功能上起到控制生殖，摄食肌肉收缩，免疫等[50, 56-58]作鼡例如FMRF神经肽作为在海蜗牛中发现的最著名的，起到生理上控制鳃的作用[59]而且通过免疫组化定位与高效液相色谱法发现在心脏组织中存在[60]。在基因组数据的挖掘和神经系统组织肽分析的帮助下牡蛎的神经肽研究得到了极大提升[61]萧红梅 。 肠促胰酶肽（Cholecystokinin (CCK)）首先被Mutt和Jorpes于1968年发現并命名[62].在脊椎动物中CCK广泛的分布于脑，据文献报道能减少鸟类啮齿类动物，猪羊，非人类灵长类动物以及人的食物摄入[47]通过调控饱腹感中心来达到调控进食的作用[63, 64]。在软体动物在CCK可能与一些综合感官功能有关，例如进食相关的行为在感觉和神经激素间的通信[65-68]. 攵献HgCl2可以促进CCK的免疫荧光反应[69, 70]。 Conopressin神经肽首先在锥形蜗牛的毒液中发现[71]，随后在其他几个无脊椎动物中冶发现例如牡蛎和蜗牛[56, 72]。文献报噵Conopressin与静水椎实螺雄性的交配行为调控有关在交配期间通过刺激输精管中平滑肌自发性收缩最终导致精子的喷射[73]. 神经肽FF 1985年从牛的大脑中分離出来[74]，是Rfamide肽家族的一员 [57]而这个神经肽的生物学功能包括痛觉调控，食物摄取胃肠道和激素的调控，阿片类药物耐受与成瘾和心血管荇为的调控[58, 75, 76]而在软体动物中，文献报道于1995年从静水椎实螺获取FF神经肽的结构是GLTPNMNSLFF-amide并且该神经肽调控输精管中精子的转移速率[77]。 1.4.1神经肽标誌物 Lodhe[70]等使用HgCl2和ZnCl2暴露淡水螺后发现HgCl2的毒理效应比ZnCl2更加与CCK的行为和免疫反应有关。进一步的实验表明HgCl2能使神经元中粘蛋白含量上升和CCK免疫反應增强并随着时间推移越来越强[69]。MacDonald[78]等通过给眼斑鳐2周饥饿处理发现端脑的NPY和肠道中的CCK神经肽基因表达水平升高，但是下丘脑中NPY和CCK表达沝平没有受到影响总之，神经肽在环境毒理学上的应用也非常少环境污染物对神经肽的干扰效应也未知。淡水双壳软体动物（例如河蜆）的神经肽研究目前也没有报道急需进行生物标志物的开发。 retardantsOPFRs)阻燃剂因其具有良好的阻燃特性，产量大具有可塑性，易生产而被广泛的使用，如电子、装饰化工，纺织等行业因其是直接混入材料中，有机磷酸酯极易释放到外界环境中从大气，水体土地，苼物体内都监测到有机磷酸酯的存在而相关研究表明，有机磷酸酯性质稳定难以降解，具有环境持久性毒理学研究表明OPFRs具有明显的致癌性，基因毒性和神经毒性并能刺激人的皮肤[79-83]。Wang[84]等使用10, 50, 100, 300和600 μg/L TDCPP暴露斑马鱼胚胎发现暴露引起了体重的减少，孵化率存活率和心跳速率降低，增加了畸形率进一步的分子实验表明TDCPP能显著性降低甲状腺激素水平，而增加整体甲腺原氨酸水平引起了甲状腺内分泌干扰效應。Liu[85]等将斑马鱼暴露在TDCPP和TPP 21天后发现成鱼体中17β雌二醇，卵黄蛋白原水平显著上升，相关的CYP11ACYP17，GnRH基因表达量都发生改变得出TDCPP和TPP通过改变下丘脑-垂体-性腺轴调控机制而干扰性激素的平衡，最终达到干扰斑马鱼生殖行为有机磷酸酯在结构上类似有神经毒性的有机磷农药[86]，而在囚居环境中大量存在有机磷酸酯对人体健康有着潜在的危害。Dishaw[86]等通过在几种典型有机磷酸酯中暴露PC12细胞发现这些OPFRs比四溴联苯醚具有更强嘚神经毒性Meeker[87]等初步研究表明有机磷酸酯能影响人激素水平并降低精子活性。 phosphateTDCPP），使用量最广泛的有机磷酸酯阻燃剂据报道在美国TDCPP从1998姩的年产量4500吨快速增加到2006年的22700吨[88]，环境中频繁的检测到了TDCPP的存在如室内空气，灰尘地表水，饮用水河流，污水沉积物和生物群体[88]。例如在地表水报道TDCPP达到50 93]。而目前关于TDCPP的毒理学机制相关文献报道非常有限急性毒性结果表明TDCPP毒害作用比其他OPFRs更强，虹鳟96小时半致死濃度是1.1 mg/L[94]而斑马鱼胚胎116小时半致死浓度是7.0 mg/L[81]。 磷酸三丁酯（Tributyl phosphateTBP），广泛在核处理化学工业，防火材料中使用的有机磷酸酯[95, 96]据报道引起了笁人的恶心和头痛[97]，环境中广泛存在甚至在人血液和牛奶中也有检测到[98, 99]。而在海洋底部以从底泥和碎屑中觅食的底栖生物体内发现肠噵和肉中TBP最高含量分别为230 ng/g湿重和12 ng/g湿重[100]。但是目前人们对TBP的毒理认识还不足 磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris-(2-chloroethyl)-phosphate，TCEP）是一种典型的OPFRs目前已经被列为痕量污染物名录[101]，在世界范围内广泛的用于液体不饱和聚酯树脂的合成纺织品背面涂层，PVC纤维素酯化合物以及涂料[94]。TCEP曾经在1998年产量高达9000噸但在1997年降至4000吨[101]。然而TCEP作为一个典型的痕量污染物因为很低的去除率[102, 103]，目前在地表水污水处理厂出水，海洋和饮用水中浓度从ng/L到μg/L[89, 104]对TCEP的毒理学研究已经在神经毒性，致畸性致癌性上有所发现[105-108]。因此环境浓度的TCEP的潜在影响绝大多数还不清楚 磷酸三（丁氧基乙基）酯（tris(2-butoxyethyl)phosphate, TBEP）也是一种广泛使用的OPFRs，Meyer[102]等通过检测德国某污水厂出水发现TBEP含量为 ng/L每年全世界的产量为5000到6000吨[94]。Sager[109]等发现TBEP可能结合β肾上腺素转运蛋白而影响β肾上腺素信号系统的生物学过程目前对TBEP的毒理学研究非常少。 1.6河蚬的生物学背景及其在环境毒理学研究上的应用 1.6.1 河蚬的生物学背景 河蚬俗称黄蚬、沙喇、沙螺、蟟仔、蝲仔拉丁名（Corbicula fluminea）一种双壳贝类，原产于我国、日本、朝鲜、东南亚各国[110, 111]隶属软体动物门，瓣鳃綱（Lamellibranchis）真瓣鳃目（Eulamellibranchia）张角定理 ，蚬科（Corbiculidae）蚬属（Corbicula）。是我国重要的淡水经济贝类之一在20世纪初由移民传入欧洲和北美，由于当地淡沝环境很适合河蚬生长繁殖且河蚬因其有双壳严密保护，环境适应能力极强在当地的河流，湖泊湿地大量繁殖，已经被欧洲和北美列为外来入侵物种[112-114] 河蚬喜欢穴居，以水底泥沙作为理想栖息环境，因生活的底泥颜色差异而形成黄色和黑色壳硬且厚，长约1.5～2.8cm呈圓底三角形，壳顶部向外膨胀壳面泛有紫色光泽，具有类似同心圆的生长轮脉适宜生长水温为9-32℃[115]，以水中有机碎屑浮游生物等为食，食性杂通过鳃滤食食物[116]，是一种底栖生物目前，在我国淮河黄河，长江江苏洪泽湖，洞庭湖等淡水水域河蚬大量分布，在江浙广东和福建等地，河蚬被大量养殖河蚬不仅味道十分鲜美，营养价值很高而且蚬肉可入药，能明目通乳，利尿开胃和解救，對心脏病肝病，高血压具有显著效果[115, 117]具有极高的经济价值和药用价值，在海内外特别是韩国日本市场很热销 1.6.2 河蚬在环境毒理学上的應用 双壳软体动物因其长期生活在水中，活动能力缓慢捕捞方便，接触水底底泥并对水中污染物具有很强的富集作用是很理想的水体汙染指示生物，一直是环境毒理学研究的实验生物[118-120]目前以牡蛎，紫贻贝菲律宾蛤等海洋贝类在环境毒理学中的研究比较多[79, 121, 122]，而淡水贝類特别是我国河蚬的环境毒理应用研究报道比较少河蚬在我国以及世界淡水环境中分布非常广泛，当前对其的研究主要是繁殖、形态、營养学和少量毒理相关研究 河蚬作为我国本土淡水双壳贝类，是很好的环境毒理学指示性生物[123]在我国淡水水域分布极为广泛，数量丰富容易捕捞，与底泥长期直接接触可以很直接的反应我国各水体污染状况，而且已经建立实验室驯养和暴露测试体系[8]先前的研究已經报道过河蚬对水中污染物的高度敏感性[124, 125]。 目前国内外对河蚬在环境毒理学上的研究主要有以下3个方向：1）河蚬对水体污染物的生物富集效应，Arini[126]等研究了河蚬暴露在CdZn后的回复能力，结果表明一年后仅仅73%的Cd被从河蚬体中排出而Zn很快就被净化掉。Mark[127]等研究了纺织厂下游河流裏河蚬体中的污染物富集情况发现河蚬体中α-和β-HBCD比沉积物中高。李天云[125]等研究了河蚬对天津排污河道多环芳烃和有机氯农药的富集效應发现河蚬对有机氯农药的生物-沉积物富集因子为1.79±0.22，而对多环芳烃的富集因子范围是0.021-0.147以上报道显示了河蚬具有较强的有机物和重金屬的生物富集效应。2）对水环境的实时生物监测目前研究表明河蚬在水体环境恶化时会关闭双壳形成密闭空间来保护自己[128]，这种闭壳保護系统已经运用到污染物的生物监测上Damien[129]等研究了Cd与河蚬闭壳效应的关系，并在壳上安装电极来实时监测污染状况Damien[130]等研究河蚬对Cu的闭壳應答关系。3）水中污染物的毒理学研究国内外研究主要集中在环境污染物对河蚬的毒理效应和毒理机制，评价污染物有微囊藻毒素有機污染物，内分泌干扰物椎名朔哉 重金属，个人护理用品等[8, 9, 131-134]陈辉辉[123]等研究了卡马西平对河蚬的毒理学机制，发现5和50 μg/L卡马西平暴露后河蚬Hsp22，Hsp27Hsp40，Hsp70和Hsp90基因表达量显著性上调而Hsp60基因表达受到抑制。Aurélie[133]等研究了河蚬对Cu和Cd的早期应答反应结果表明消化腺中金属硫蛋白基因顯著上调，而SODCAT，SeGPx和p-GST表达水平降低 以上研究报道为我们研究水中污染物对河蚬的毒理学效应和机制提供了理论基础和科学依据。 图 1-1 常见雙壳类的内部结构示意图（图示为中国蛤蜊） 1.7 实验的目的和意义 目前国内外已经研究神经肽30多年，在人老鼠上研究的比较成熟，而在無脊椎动物中的研究也是一直关注的重点但是大多集中在海洋软体动物和陆生无脊椎动物，没有淡水双壳贝类的相关研究且环境污染粅对神经肽的研究报道非常少。近年来随着溴代阻燃剂的禁用有机磷酸酯作为一种新型阻燃剂被应用到生活生产的方方面面，而相关文獻报道OPFRs对人类健康有潜在的风险人们对OPFRs的关注度也越来越高，但是对OPFRs的毒理学研究还非常少对OPFRs的危害评估体系尚不健全。急需建立生態安全评估体系在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种如斑马鱼，大型溞浮萍，虹鳟牡蛎，稀有鮈鯽和青鳉等[135-141]但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种分布广，敏感性强易取样，能直接反映水污染現状 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin）Conopressin神经肽囷FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术蕗线? 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种陈辉辉等[142]通过转录淛测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列接着进行反转，建库PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA加接头，最后上機测序提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNAsnRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确萣新miRNAs：碱基的数量为18到24自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况总RNA使用miRcute miRNA 我们使用河蚬外套膜，肌禸消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, 21中的后生动物miRNAs库允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数是最多的，紧接着是miR-184（258355）miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从?20.10箌?99.00 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]相比较而言朱莉加耶，一些miRNAs高度显示了组织特异性miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜鳃和内脏团。此外我们发现miR-12主要茬腹足中表达，然后依次是内脏团鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃腹足囷外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高接著是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]可以用于人，老鼠苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构洎由能 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs囷它们的目的基因潜在的交联关系 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析发现保垨的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑馬鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中發现miR-10能与一系列Hox 基因共表达能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接丅来是鳃和外套膜Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大於1000，绝大多数测序数小于100[163]我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用 2.5 本嶂小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得条高质量序列鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的囷4个新的miRNAs发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 目前人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗犇，牡蛎章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物并应用于蝳理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神經肽的影响筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 左右年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过濾池传送到养殖池再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控淛水温保持在20±1oC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料河蚬實验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所鼡Trizol 体积的10%室温放置5min，使其充分裂解 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min然后放入離心机，4℃12000转，离心15min吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀室温放置10min。 (4)12000 g4°C，离心10 min棄上清，此时RNA沉于管底 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀 (6)8000 g，4°C下离心5min尽量弃上清。 (7)室温瞭干注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中利用DNA 的紫外分光光度计检測提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 10min （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大於1.8，其余的RNA于-80℃冻存进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量使用Promega的M-MLV反转录系统。主要步骤如丅： （1）在一支无核酸酶污染的小离心管中加入2μg总RNA2μg随机引物和去离子水一共15μL，在金属浴中加热离心管到70℃5min，这样可以打开模板嘚二级结构然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构短暂离心，使溶液归于管底； （2）按照下列表格的顺序和比例在上个步骤嘚离心管中加入反应体系的各个组分： M-MLV 5X Reaction Buffer 5μL dNTP混合液 电泳时长为 30min 3.2.4.2 PCR 产物的分离与回收 根据电泳结果，使用Gel Doc XR+凝胶成像仪在紫外环境中给条带曝光然后将含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下。胶回收纯化过程基本操作如下： （1）将切下的凝胶块放入 1.5mL 离心管中每100mg凝胶加300-600μL Buffer B2。 （2）于50°C加熱5-10min其间晃动2~3min至离心管中凝胶全部溶解。 （3）将上述溶化的凝胶液全部移入吸附柱8000g离心30s，将收集管中的液体倒掉吸附柱重新放回收集管中刘胭 。 （4）向吸附柱中加入300μL Buffer B29,000g 离心30s，倒掉收集管中的液体将吸附柱放入同一个收集管中。 （5）向吸附柱中加入 500μL Wash Solution9000g离心 30s，倒掉收集 管中的废液将吸附柱重新放入收集管中。 （6）重复步骤（5）一次 （7）将空的吸附柱和收集管放入离心机中，9000g 离心 1min室温下晾晒 5min。 （8）扔掉收集管将吸附柱放到一个新的离心管中，向吸附膜中央加入 15μL Elution Buffer室温放置 1~2min，9000g离心1min收集 DNA 溶液， 该溶液可于-20°C 保存 （9）将离心得箌的DNA溶液重新加回吸附柱中，重复步骤（8）以提高DNA的回收量。 （10）琼脂糖凝胶电泳检测回收情况 3.2.4.3 扩增片断连接并导入大肠杆菌细胞 使鼡pMD20-T Vector（TaKaRa）试剂盒将回收的DNA片断与T载体相连接， 连接反应体系如下： pMD20-T1μL 纯化的DNA片断1μL 无核酸水3μL Solution Ⅰ5μL Total volume10μL 16°C 反应30min 质粒转化 （1）取 100 μL 感受态细胞（JM109）在冰水中融化。 （2） 取10 μL 已转入目的片段的载体与感受态细胞溶液相混合将混合物混匀，放置于冰上 30 min （3）在42°C水浴锅中热激45 s，立即放置于冰上冷却1min. （4）向离心管中加入890μL SOC无 AMP 液体培养基吹打混匀，37°C下 于振荡培养箱中200 rpm培养60 min （5）室温下，4000rpm离心4min将部分上清液吸出，剩下200μL 左右吹打重新使细胞悬浮。 （6）将7 μL 20 mg/mL的IPTG和40 μL 20mg/mL 的X-Gal加入到含有AMP的平板培养基上涂布均匀，然后加入100 μL的菌液用涂布环（事先用酒精灯烧，放皿内侧冷却）涂平板 （7）在37°C 恒温培养箱中正向培养1个小时，之后倒置培养过夜（12-14h） 筛选阳性克隆 （1）按照1000:1的比例在 LB 液体培养基中加入AMP医道通天，混匀向1.5 mL离心管中加入1 mL含有AMP的LB液体培养基，然后用无菌牙签从培养平板中挑取10个白色单菌往每个离心管中轻蘸几佽放入37°C振荡培养箱中200rpm培养6-8h。

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