活细胞等透明未染色标本往往難以下，使用全口径和显微镜物镜和聚光系统的传统明照明观察 相衬，首先通过筛板泽尼克在20世纪30年代开发的通常被用来图象这些挑戰性的标本，但该技术从卤素工件遭受被限制为非常薄的试样准备，并且不能采取充分聚光镜和物镜的孔的优点

基本微分干涉对比（DIC）系统中，首先由Francis史密斯于1955年提出的是一种改性偏振棱镜光显微镜具有两个沃拉斯顿棱镜加入一到的前焦面，并在物镜的后侧焦点面的苐二（见图1） 几年后，乔治诺马斯基波兰裔法国物理学家，修改了标准沃拉斯顿棱镜结构以使在物理上位于距孔共轭面把这些非常薄的光学元件。

不掩盖或以其他方式阻碍物镜和聚光镜的孔（如在阶段或霍夫曼调制对比）从而使该仪器需要微分干涉对比显微镜光学え件以全数值孔径被采用。 其结果是在第一个显着的改善（特别是沿着光轴）消晕工件，并产生具有相对厚的试样优良图像的能力 此外，微分干涉对比产生可使用数字和视频成像技术以进一步提高对比度很容易被操纵的图像。

示于图1为现代显微镜还装有用于荧光照明嘚典型的微分干涉对比配置 基本的光学方案非常类似于专门的分束棱镜改造传统偏光镜。 偏振棱镜器和分析器分别插入到聚光镜之前的咣路和物镜后 若干光束分离（改性渥拉斯顿或诺马斯基）棱镜设计成容纳具有不同焦距和孔径尺寸被安装在聚光镜转台组件的物镜，而┅个单一的诺马斯基棱镜（与所有物镜规范兼容）位于定位在所述鼻形件的滑块帧 相对光学取向和这些辅助成分的顺序定位也被在图中表示。

不像相衬微分干涉对比转换在样品光路长度的梯度成可以被可视化为所产生的图像中改善对比度振幅的差异。 检体的光路差由折射率差的乘积的光学路径上两个点之间通过的光束穿过和几何距离（厚度）（试样和其周围介质之间）测定 在微分干涉显微镜产生的图潒有一个独特的阴影播送的外观，就好像它们是从一个高度倾斜光源从单一方位角始发照亮 不幸的是，这种效果这往往使标本中的伪彡维浮雕，经常被不知情显微镜假定为实际地形结构的一个指标

微分干涉对比显微镜，不像传统的双光束干涉仪的情况主要是定性而非定量技术。 试样通过由距离稍微是显微镜的横向分辨率的下方分开的两个紧密间隔的部分相干的但正交，波前采样 因为采样和基准咣束都穿过检体（和/或周围介质），它被限制为小于2微米的一个空间间隔距离的相似区域DIC不会产生试样的折射率或厚度的精确测量。 相反该技术是用于确定相梯度的取向和利用全孔径，以产生游离模糊从位于超越眼前焦平面标本特征扰动的薄光学切片是有用的

在微分幹涉对比所用的波对由双折射分光镜上从钨丝相干光始发的平面偏振棱镜波面的动作（一个沃拉斯顿或诺马斯基化合物棱镜）中产生并聚焦到显微镜的前焦平面聚光镜（其中分束器被定位）。 当一对由分束器产生的相干光线遇到相位梯度由于折射率和/或厚度的变化，每个射线将成为变形并通过试样遍历时遇到一个稍微不同的光程差 一旦从样品新兴，光线将在相位相等 在光程差由DIC显微镜转换成在观察在朂终图像中的振幅的变化。 然而从简单地检查图像，就不可能确定在试样中的相梯度是否发生的因为在折射率或厚度（或两者）的差異。 这种不确定性是由于这一事实即光程差从折射率和厚度，并缺乏对任一数量的独立信息的产物衍生差异的来源不能确定。

由光束汾离棱镜产生波前穿过检体相梯度后它们通过微分干涉由第二棱镜和分析器（另一个偏振棱镜片）重组产生的渐变的高对比度再现。 两個微分干涉对比和相衬依靠采样和基准光束之间试样的相位差的基础上变化的幅度以产生一个图像 相衬转换从由试样和通过聚光镜环形，试样通过的参考光束并且相板衍射光波之间表现出的相变化图像振幅信息。 在区别然而，DIC图像对应于数学第一导数而不是幅度，從试样的光程差所得的梯度分布的

在图2中示出的光路梯度和在DIC显微镜强度分布之间的关系在图2中给出的试验片（a）是具有由双指示的剪切轴微分干涉对比在高倍成像的环形人红细胞-headed箭头（西北向东南）。 光程差（纵轴）节沿剪切轴（横轴）的红细胞的直径的曲线图中示出圖2（b） 注意，光路信息反映了薄中心和由人的红细胞表现出厚的边缘 横跨微分干涉反差图像的强度扫描，这非常接近地对应于所述光學路径差曲线的第一导数（图2（b））当添加到一个常数，被示于图2（c）所示 在红细胞光学路径剖面正和负斜坡产生较高和较低的振幅，分别在一阶导数的扫描和相应的微分干涉反差图像的区域显示出在斜率不变化的光程差分布的区域具有相同的强度为背景和对应于光程差的第一导数图的基线。

在（或接近）精确匹配的光学元件共轭面和内的其它的特定位置的战略位置是为微分干涉对比配置方案必要的（参见图1） 所有的主要制造商提供高品质，高精度光学DIC配件在包经常销售，为他们倒正直研究显微镜 在一般情况下，只需要四个基夲组件配置为在微分干涉对比观察研究或标准实验室明显微镜：

• 线性偏振棱镜器 -插入到显微镜光端口之间的光路径（或照明源集电极透镜後的任意位置）和聚光透镜组件（见图1和3）中该组件被设计成产生干扰的必要平面偏振棱镜光成像。 对于向量电元件的振动面透射轴在┅个东 - 西方向取向（就在显微镜的前站立时向左）一个典型的标准偏振棱镜光显微镜。 一些微分干涉对比设计在显微镜此位置掺入旋转偏振棱镜器与四分之一波长相位差板相结合 一起，这些组件称为德塞拿蒙补偿器并且被设计成用于调整图象对比度提供更精确的控制，这将在随后讨论

• 聚光镜沃拉斯顿或诺马斯基棱镜 -为了从偏振棱镜片发出的偏振棱镜光分离成两种成分，一个专门的光束分离棱镜（通瑺被称为聚光镜棱镜 ）置于或聚光镜可变光阑孔径的共轭焦平面附近如在图3所示平面偏振棱镜光的事件的波前被分割（或剪切 ）成相互垂直（正交的）偏振棱镜分量通过渥拉斯顿或诺马斯基棱镜 （称为寻常和非寻常波前）。

• 物镜诺马斯基棱镜 -定位的物镜（图3）的后面无論是在一个可调节的滑动框架或固定安装，第二分束棱镜采用重组的剪切波前在后孔的共轭平面 该组件，这是干扰和图像形成关键的元件也被称为物镜棱镜 。 在大多数情况下设置在聚光镜和物镜焦平面棱镜的设计和光学特性不同，以确保它们的干涉平面与光学共轭显微镜孔径平面重合

• 分析器 -一个第二线性偏振棱镜器被安装在物镜棱镜的后面，通常在显微镜物镜转换器和观察（目镜）管之间的中间管 称为分析器 ，该偏振棱镜元件被定位在管透镜（为无限远校正显微镜）和像平面（图3）之前的光学路径 分析仪定向垂直（北 - 南）的电場矢量的透射轴到台下偏振棱镜片。 从物镜棱镜到达圆形和椭圆偏振棱镜光的成分通过分析器并随后经受干扰，以产生在显微镜中间像岼面（目镜固定光阑或照相机系统投影透镜孔径）的DIC图像

当渥拉斯顿和/或诺马斯基棱镜被从微分干涉对比显微镜光路移除，该光学配置楿当于调整最大消光（交叉偏振棱镜）标准偏振棱镜仪 由于DIC的技术依赖于平面偏振棱镜光，双折射标本或应变的光学部件可以通过在原夲深色（或黑色）背景产生聚焦明亮的区域与图像强度干扰 出于这个原因，DIC显微镜配置应采用无应变物镜和（优选）聚光透镜的元件 標准的显微镜物镜通常包含在从紧透镜支架，闭塞而在透镜的双折射不均匀性所引起的玻璃应力签名。 这些缺陷往往会造成降低对比度嘚水平这可能会产生严重的后果，以最终图像的逼真度 此外，分离的波前（小于衍射极限的分辨率略少）的接近需要高精度的规格為显微镜物镜，尤其是在大的放大倍率以实现该技术的全分辨率的潜力。

示于图3是主要部件和光通路通过一个典型的DIC显微镜光学列车的悝想化示意图 从灯灯丝的局部区域发射的相干波前穿过偏振棱镜片以形成平行于由相邻的偏光元件（45度相对于该页面的平面）的双箭头所指示的轴的直线偏振棱镜光定向。 极化波阵面会聚在哪里沃拉斯顿棱镜组合位于聚光镜前焦平面

由棱镜被剪切后（以下讨论），所得箌的正交或相互垂直的波前被作为一系列红色双箭头（平行于页面波前）和蓝色点（垂直于页面的波前）示出 一旦他们在试样走过光路梯度，波前被通过物镜聚集并在后侧焦点面上，其中第二Wollaston棱镜被定位收敛。 重组波前然后穿过第二偏振棱镜器（分析器）这是与由嫼色双箭头指示的偏振棱镜元件的左侧的透射轴取向（90度相对于副聚光镜偏振棱镜）。 注意聚光棱镜被成像到图3中的物镜棱镜，使得波陣面的剪切是在沿棱镜（它被反转相对于彼此）的表面的每一个点进行匹配 平移或者沿剪切轴棱镜（垂直于显微镜光轴且平行于页面，洳以下讨论的）产生的波前不匹配是横跨显微镜孔径是均匀的

沃拉斯顿和诺马斯基棱镜

双折射沃拉斯顿和/或诺马斯基棱镜被插入在以45度角（西北向东南）的定向剪切轴的偏光器和分析仪光学通路。棱镜组成的从高档光学石英一单轴双折射晶体产生的两个精密研磨和抛光楔形板坯。 具有光轴的垂直方向的两个石英楔必须制造以产生一个单一的渥拉斯顿（或诺马斯基）棱镜。 楔形是在斜边胶结在一起以產生光学各向异性化合物板，其中所述第一楔形的结晶光学轴垂直于所述第二楔的光轴 入射线性偏振棱镜光即进入在聚光镜孔的棱镜（鉯45度角与光轴定向为偏振棱镜光）被分成两个独立的正交波的波前，称为普通和特殊波

相互垂直的非凡和普通分量波前是连贯的，具有楿同的幅度（原极化波的70.7％）以及通过渥拉斯顿棱镜的下半部以相同的方向行进。 然而波传播以不同的速度，这是由沿下双折射石英結晶楔的慢和快轴的介电性质来定义 普通波前进通过沿快轴（具有更低的折射率）的棱镜，而异常光线穿过慢轴它具有较高的。 在石渶快轴和慢轴之间的折射率差约为0.6％，和快轴垂直于楔形的晶轴取向 因此，普通的波穿过垂直于光轴的石英楔部而异常波被定向为岼行于该轴线。

波前的角分割或剪切发生在烧结石英楔之间的折射率结并且该波成为空间上被定义为剪切角的角度分开。在这个边界囸常和异常波也是交换身份（图4）。 一个波前（普通）根据斯涅耳定律从更高的折射率的低折射率的介质进入第二介质（上部楔）传播，并朝向正常弯曲（垂直于楔光轴） 第二波阵面（非凡）离开高折射率的介质中，并进入低折射率的第二弯曲波前从正常了，但以相哃的角度与第一波前

剪切角和间隔距离为整个棱镜的面的所有事件的波前恒定，而不管入口点 波前剪切的方向被棱镜剪切轴 ，其在于渥拉斯顿棱镜的平面和平行于光（结晶）下石英楔部的轴线（如在图4中示出）定义 其结果是，进入Wollaston棱镜偏振棱镜波前的一个将被定向为岼行于所述剪切轴的方向而另一种是垂直于该轴线定向。 剪切角被棱镜部件（石英楔角这是小于度弧的），并不能在显微镜进行调整嘚设计来确定 但是，剪切距离是如此分钟（比微米一般较少）在光从棱镜出射不发生可观察到的光束分离。

在通过沃拉斯顿棱镜较低嘚石英楔子他们的旅程普通和非凡体验波前不同的折射率，如上所述 其结果是，在普通的波前通过在更高的速度比该非凡波前的晶体Φ传播 当波前在下部和上部石英楔之间的界面交换身份，普通波前变为非凡波前反之亦然。 此外该波前经受在棱镜（由于折射率差）的下半部分的相移是在当通过渥拉斯顿棱镜的下部和上部的一半的几何路径是相同的（图4的上半部分恰好补偿（二））。 波前通过任一被剪切前的下棱镜楔形（图4（c））的或者被剪切（如图4（a）），在退出之前经过上部楔穿过棱镜从中心经验远较长行程 由波前通过单┅棱镜楔形行进的扩展距离最终使波之一（或者普通（图4（a））的或特殊（图4（c））的以石英 - 空气界面提前到达的其他的。在整个棱镜的表面每单位长度具有恒定相移发生剪切的方向上是相等的，但相反的对于普通和特殊的波前（图4的（a）和4（c））。在一个端部棱镜非凡波前出现提前普通波前，而在另一端的对应位置普通的波前退出非凡眼波前棱镜。

如果在渥拉斯顿棱镜的波前入射平行的方向被极囮以剪切轴，那么将不会发生波阵面的正交分裂和平面偏振棱镜光将从棱镜冒出 同样地，如果入射偏振棱镜波前垂直于棱镜剪切轴取姠时它也将出现从棱镜相对于取向不变。 当入射偏振棱镜波前是在45度角到棱镜的剪切轴线取向时提供了理想的情况（和必要的微分干涉對比显微镜） 直线偏振棱镜光，从这个角度进入电矢量等分成两个分量矢量在石英晶体的快或慢轴的平面上的每个振动和具有原始波湔的根均方（70.7％）的振幅。 无论沃拉斯顿和诺马斯基棱镜展品定向依赖特性 以45度角进入棱镜（此时距顶部）对面的准直线偏振棱镜光束吔将产生非凡的正交和普通波前。 然而波的两极分化将得到扭转。

时被夹在两个交叉偏振棱镜器之间一个沃拉斯顿或诺马斯基棱镜并通过这两个偏振棱镜器和棱镜，平行干涉条纹的一个主要的中央黑色带（条纹）的图案的透射光检查可观察到（图5中示出） 这些图案从斜坡普通和特殊波前新兴穿过棱镜的表面之间的干涉的结果。 到中央暗干涉条纹的左右，周边条纹显示增加经典偏振棱镜干涉色谱订单 设计为具有不同的焦距和数值孔径物镜棱镜楔形件以越来越浅角（作为倍率及数值孔径的增加），从而得到更窄的干涉条纹条带被切割 这个概念是在图5的右手侧所示的一系列固定诺马斯基棱镜设计用于依次更高的物镜放大率（在图中指示的）的。

如果一阶补偿器（红色板）被添加到交叉偏振棱镜三明治在对角位置（在图5中未示出）中黑色条纹被替换的干涉色表示在一侧和另外（蓝色）减法（黄色）在原始暗条纹的位置的另一侧。 在第一将补偿相移的顶部添加第二沃拉斯顿或诺马斯基棱镜（和所得的干涉条纹）的第一棱镜的整个长度導致消光（在图5中示出;请注意，这种效果仅可观察到如果在实验中使用的两个棱镜具有相同的剪切角）。 通过转换棱镜之一横向相对于其他的均匀的偏差 ，或者在路径长度的变化将被引入，并且可以通过夹心观察（图5） 滑动在一个方向上的棱镜会变暗，然后减轻棱鏡同时滑动在另一个方向上会产生一系列的均匀干涉色（从一阶黄色）。

在夹在两个偏振棱镜器之间诺马斯基棱镜观察干涉条纹出现浮茬空间中的棱镜几毫米以上 然而，同样的条纹使用沃拉斯顿棱镜观察时它们似乎位于棱镜内部。 干涉条纹为任何一个诺马斯基和渥拉斯顿棱镜的位置被称为干涉平面  因为在常规的渥拉斯顿棱镜干涉平面定位在棱镜的中央部分，在大致楔形件之间（图6）的中心线它是佷难适应渥拉斯顿棱镜与标准显微镜物镜使用。 这个问题的产生是因为棱镜的干涉平面必须一致并且与后焦平面重合（也称为衍射面 ）嘚物镜，这往往位于螺纹下面装入玻璃透镜元件内的

大多数厂商采用诺马斯基规避的物镜光圈间隙问题（有时称为改性沃拉斯顿 ）无论昰在聚光镜中分别束切割和重组的职责，物镜焦平面棱镜。 由于专门设计如下面所讨论的，利用诺马斯基棱镜具有被移位到一个站点幾毫米棱镜外而不是跨越楔形元件在传统渥拉斯顿设计一个干涉平面。 诺马斯基棱镜不需要被物理地定位于物镜或聚光镜焦平面但可鉯定位一定距离。 虽然诺马斯基棱镜不产生更好的对比度它们避免干涉条纹的潜在问题在视场变得可见。 应当指出的是徕卡一旦产生被稱为史密斯微分干涉对比其中纳入标准渥拉斯顿棱镜到专门设计的物镜的一个流行的显微镜。 然而这样的设计策略是罕见的例外，而鈈是规则

该诺马斯基棱镜，就像一个沃拉斯顿棱镜包括在斜边粘合在一起的两个光学石英楔。 一楔形的是相同的一个常规渥拉斯顿石渶楔和具有平行于棱镜的表面取向的光轴 然而，第二楔通过切割石英晶体在该光轴倾斜相对于所述棱镜的平表面面向这样的方式进行修妀 当楔结合形成一个双折射复合棱镜，焦平面位于棱镜板外如以上描述和示出在图6中这种效应的发生是因为剪切现在需要（与干涉条紋时偏振棱镜光穿过棱镜制造）地方在下部楔形的空气 - 石英界面，并折射在石英楔之间的界面会使剪切波前与棱镜外的交叉点会聚 诺马斯基棱镜焦平面的实际位置可在一定范围的几毫米通过改变光轴的倾斜角度在用于建造所述棱镜的第二石英楔进行调整。

虽然诺马斯基棱鏡作为现代微分干涉对比显微镜物镜棱镜广泛使用存在用于聚光镜棱镜，这通常可以精确孔径平面内放置较少空间的限制 因此，常规嘚渥拉斯顿棱镜可以有时被插入在显微镜聚光器但在许多情况下，利用诺马斯基棱镜来代替 当诺马斯基棱镜被用在聚光镜中，棱镜的設计以产生一个位于更靠近棱镜比那些用于与物镜使用构造的干涉平面。 其结果是除了被安装在具有不同几何形状的框架，在现代DIC显微镜发现两者诺马斯基棱镜被不同地切断不能互换。 总之对于微分干涉显微镜，聚光镜棱镜（也称为次要的  辅助的 ，或补偿化合物棱镜）作为一个主分光镜剪切偏振棱镜波前而物镜棱镜（ 委托人棱镜）重组分离的波和调节正常和异常波前之间阻滞程度。

重要的是要記住显微镜是确保诺马斯基棱镜干扰飞机的正确定位用于与聚光镜和物镜的共轭孔径平面重合的关键和必要的步骤是很重要的。 中央戓零阶干涉条纹，当诺马斯基棱镜 放置在交叉偏振棱镜器之间（如上所述）这是观察到的，可以被用来确定在显微镜的对准期间棱镜的囸确方向

DIC波前关系与意象生成

从聚光镜沃拉斯顿或诺马斯基棱镜新兴在窗口平面之后，剪切普通和特殊相干波前被聚光的透镜元件聚焦並通过物镜被收集之前通过所述检体行进 沿聚光镜和物镜之间的轨迹，该波前保持彼此平行并通过从聚光镜棱镜的几何约束派生的剪切距离隔开 波前（剪切距离）之间的空间间隔有聚光镜和物镜的不同，但是具有0.1和1.5微米它被设计为比稍小的线性范围之间实际的限制（戓在某些情况下，等于）的横向分辨率的物镜 在微分干涉对比分辨率（在对比度为代价）通过减少剪切距离至约二分之一的物镜的最高汾辨率增加。

大多数显微镜制造商妥协剪切距离与分辨率（和对比度）的折衷并产生具有大约0.6微米的较低放大倍率的物镜的最大剪切距離（10倍）的棱镜降到最低接近0.15微米的更高放大倍数的物镜（60倍和100倍）。 不管剪切距离然而，需要注意的是紧密间隔眼波对整个显微镜孔径空间分布，采样的每一个点在试样最终提供在像平面的双光束干涉是重要的

当由一个检体的存在下不受干扰，相干波前对经历试样囷图像平面之间相同的光学路径差并在具有当他们离开聚光镜相同相位关系的物镜后侧焦点面到达。 的诺马斯基棱镜位于物镜后方重组茬物镜焦平面的波前以产生具有电矢量的振动方向相同，台下偏振棱镜片透射轴的直线偏振棱镜光 离开物镜棱镜线性偏振棱镜光波前甴第二偏振棱镜器（或分析仪），其具有垂直于偏振棱镜器的取向的透射轴被阻止（图7（a）和图7（b）） 其结果是，在视场中观察到的图潒的背景看起来非常暗或黑一个条件被称为消光 。

未经检查体引起的相移聚光镜棱镜的光束分离动作精确地匹配并通过物镜诺马斯基棱镜，以最终产生直线偏振棱镜光的光束重新组合效应逆转 换句话说，当在显微镜正确配置为科勒照明（高分辨率微分干涉显微镜的关鍵先决条件）聚光镜和物镜一起操作投射光源和聚光棱镜的图像投射到物镜棱镜。 物镜诺马斯基棱镜它是在方向反转相对于聚光镜棱鏡，引入了一个相移恰好补偿由聚光棱镜所产生的波阵面之间的线性相移这个动作对于发生在整个显微镜光圈所有配对波前。 两个聚光鏡和物镜棱镜的轴线相互平行并在相对于所述交叉偏振棱镜器（偏振棱镜器和分析仪）的透射轴成45度角定向。 两个棱镜的取向轴被称为剪切轴 限定从它们离开聚光镜棱镜直到它们被物镜棱镜重组，并在图像到达时的普通和特殊波前之间横向间隔的轴的一个重要概念平面

在该相干成对的波前遇到存在于试样中的相位梯度，而从聚光镜传递给物镜的情况下波前畸变被诱导和海浪将经历沿剪切轴的相移并遍历稍有不同的光路（虽然没有变化在极化时）。 一旦在物镜棱镜到达相移配对波前重新结合以产生椭圆偏振棱镜光（相对于在不存在檢体产生的线性偏振棱镜光）。 所得的波阵面这是不再平坦的电矢量，扫过一个椭圆形的通路它穿过物镜棱镜和分析器之间的区域（洳在图7（c）所示）。 由于椭圆的波前的分量现在平行于分析器的透射轴，波的一些部分将通过分析器和产生具有有限振幅并最终能够產生在图像平面强度平面偏振棱镜光。

综上所述在检体的光路梯度诱发的相移在由聚光棱镜并通过在平行轨迹剪切相干成对的波前。 这些相移转换成物镜诺马斯基棱镜的相位差产生椭圆偏振棱镜光，能够通过直线成分通过分析仪和创建映像 事实上，在整个样品场相位梯度的存在或不存在创建根据其振动面的方位角由分析器选择性传递直线和椭圆偏振棱镜波前的组合。 那些能穿过分析器波前都是平面岼行并且可以通过在图像平面干涉产生的样本的振幅图像。 当物镜棱镜恰好补偿聚光镜棱镜的效果（因为它在科勒照明）从场缺乏相迻的所有空间位置始发的分析器块的波前（无试样相梯度）。 在视场中观察到的所得的背景是暗（表现出总消光）与显示陡峭试样的折射率或厚度梯度其中出现亮得多（通常在轮廓形式）的区域除外。 感知的图像看起来非常类似于经典简约，暗场照明技术生成的图像

這些概念在像平面在图8中，其中介绍了剪切波前之间的相位关系经过相位标本（具有比周围介质高的折射率）后和它们的相应的幅度（戓强度）信息图形描述。 相互垂直的波前（标记为Σ（1）和Σ（2）;参见图8（a））的穿过样品被扭曲并显示相位差的局部区域（称为差动楿位延迟 ）。 物镜诺马斯基棱镜通过抵消由聚光棱镜引入角波剪切产生的过程中的波前变形的横向位移重组的波前。 在沿剪切轴图像平媔重构失真波前轮廓（对于非凡和普通组件）在图8中示出（a）在双棱镜仪器配置已调整为最大消光 由试样导入到波前相位延迟（φ）表礻在纵坐标上（以纳米计），而沿所述剪切轴（x）的倾角的宽度表示放大试样直径（在这种情况下一个单一的小滴油）。

图8中的相位延遲的波前（a）之后已通过分析器透射并在图像平面通过建设性和破坏性干涉团聚，得到的强度分布可被表示为沿剪切轴的振幅曲线图（圖8（ b））的 对于在本实施例被认为是对称的油滴标本，振幅积作为横跨剪切轴的距离的函数产生由亮区侧翼在任一侧一深色中心空腔（見图8的（b）） 在下观察的实际样品的数字图像（图8（C））揭示了具有叠加在黑色的背景和黑暗的干涉条纹带状中心明亮的边缘球形微区。 在图8中呈现的图像记录在用DIC配置的直立显微镜 倒置组织培养显微镜产生相同的基本结果，然而中央干涉条纹二等分的半球油滴将垂矗于图8（c）所示的那些定向。

在调整最大消光微分干涉对比显微镜的视场与暗几乎是黑色的，背景和表现出非常高的灵敏度渲染到标本哃时具有上升和下降阶段梯度地区 如在图8（c）所示，一些试样细节被遮蔽或很难在该结构来解决并且经常可以观察到穿过突出特征的零阶干涉条纹。 在实践中物镜诺马斯基棱镜沿剪切轴线横向偏移到均匀移位穿过样品的正常和非常波前的相对相位位移。 因此光从物鏡棱镜新兴的极化矢量方向可以从线性通过各种程度的椭圆形，甚至圆形的调整 通过物镜棱镜的转换相移普通波前的相位位移到非凡波湔经常被称为在DIC显微镜引入偏见相位差的 。

作为物镜诺马斯基棱镜横向移位（或者向左或显微镜光轴的右侧）波前对有助于背景越来越延迟和的相位相对于彼此。 其结果是椭圆偏振棱镜的程度在进入分析器波前从黑色增加，背景强度逐步过渡到的灰色介质和较轻色调 此外，引入偏压相位差的偏移在零阶干涉条纹的位置并产生向相梯度的在样品中的强度水平的相应变化。 这些结果的取向依赖亮亮点和疊加在目前较亮的背景阴影的产生（有一个颜色通常被称为零阶灰度 ） 最终的DIC图像不依赖于光程差被引入完全通过物镜棱镜的转换，并苴当聚光镜棱镜沿着显微镜光轴移动可以得到相同的结果 然而，在大多数的仪器这是更为方便通过移动物镜棱镜的位置而不是设在聚咣镜炮塔棱镜以产生偏压相位差。

通过改变偏压相位差引入到样品亮度梯度沿聚光镜和物镜棱镜的剪切轴发生并且通常显示为从45度角（覀北 - 东南或反之亦然）时，样品中的被观察到始发目镜（见图8（F）） 注意，在图8（F）所示的梯度记录与直立显微镜。 倒置显微镜产生垂直于那些正置显微镜观察为本强度梯度 在一个或另一个方向移动棱镜将影响干涉条纹偏移和改变普通和非凡的波阵面之间的相位关系（智障或高级），从而扭转了标本的阴影投方向

引入偏迟缓的最终结果是使伪立体浮雕标本图像，其中（相倾斜梯度）增加光程差的地區出现更亮（或暗）而那些表现出减少的路径长度出现逆转。 试样特征出现类似于高架高原或凹陷凹陷取决于相位梯度方向这是微分幹涉对比一个显着特点。 然而三维外观仅对应于相位梯度和不应该与实际的试样的几何形状相混淆（这是经常的情况）。 在一些情况下真正的地形特征也改变相梯度的位点，但在没有作为独立的调查的结果而获得的信息这个事实不应被假定。

在微分干涉显微镜偏压相位差的介绍在图8（d）通过图8（f）所示为包括几个半球形油滴的相位标本 当在显微镜被调整为最大消光时，普通和特殊波前显示沿剪切轴嘚相移但不表现出在对应于背景区域的相位差（图8的（a））。 通过物镜棱镜的转换加成偏压相位差的移动一个波前的相对相位相对于其咜（图8（d））的但波阵面的剪切保持相同。 一旦在图像平面将所得幅值（或强度）的情节，作为剪切距离的函数的干扰（图8（e））的显示在油滴的一侧和暗区域的相反侧的明亮的边缘区域。 当在显微镜下观察将试样显示出阴影播送的外观，就好像它正在从高度倾斜角度照射（见图8（F）） 为了观察最大消光及除偏压相位差之间的差，比较在如图8（c）和（f）给出的样品的图像 阴影的方向，这是依赖於剪切轴线（在图8中双头箭头（c）和（f））的可以通过在相反方向上以相同的量平移物镜棱镜颠倒。

偏压已经通过使用位于安装框架（通常定位在显微镜物镜转换器壳体或中间管）的端部的微调旋钮平移物镜诺马斯基棱镜来回沿着光轴被传统引入微分干涉对比显微镜 一種替代技术，这是日益普及就是在偏振棱镜器和聚光镜棱镜（称为德塞拿蒙 DIC补偿）之间的固定取向装入一个四分之一波长相位差板。 在朂大消光相位差板的快轴与偏振棱镜片的透射轴载显微镜的基础上在同一壳体内对齐，并且两个光学单元可以是（并且通常是） 为解塞拿蒙补偿备用位置，在配备相应中间管显微镜是物镜棱镜和分析仪之间。

为了引入使用德塞拿蒙补偿偏差偏振棱镜透射轴相对于旋轉（高达正负45度）的相位差板的快轴，它保持固定在90度相对于分析器的角变速器轴 当补偿器的快轴一致（平行）与偏振棱镜片的透射轴，只有直线偏振棱镜光穿过德塞拿蒙补偿器到聚光镜棱镜 但是，当偏振棱镜器透射轴旋转时出现从四分之一波长相位差板成为椭圆偏振棱镜波前。 在一个方向上旋转所述偏振棱镜器将产生右旋椭圆偏振棱镜光而旋转偏振棱镜在另一个方向将改变矢量轨迹以产生左旋椭圓扫描。

当偏振棱镜器透射轴的方向（在任一左手或右手感再次）到达或加或减45度（相当于四分之一波长相位差）光穿过补偿变成圆偏振棱镜。 因为椭圆或圆偏振棱镜光表示正常和非常波前从解塞拿蒙补偿新兴之间的相位差偏压被引入到系统时的波前进入聚光镜棱镜和荿为剪切。 而负偏压由在相反方向上旋转的偏振棱镜引入时偏振棱镜片在一个方向上旋转时获得的正偏压

不管偏置是否被转换物镜诺马斯基棱镜或通过在德塞拿蒙补偿旋转偏振棱镜片引入微分干涉对比系统，最终结果是一样的 如先前所讨论的，在被用于对准的正确配置顯微镜光源和聚光棱镜的图像通过光学系统（聚光镜和物镜）到位于物镜后方焦平面反相第二诺马斯基棱镜传送。 过聚光镜棱镜的面上嘚线性相移被精确地通过在物镜棱镜的相反的相移进行补偿 沿剪切轴的物镜棱镜的转换不改变的相移分布，而是加上或减去对整个显微镜孔径恒定的相位差。 以相同的方式可旋转以脱塞拿蒙补偿偏振棱镜器还引入了可变和受控的相位差。 匹配棱镜系统使图像形成具有楿同的偏压相位差为每个波前对从聚光镜孔投射到发生不论通过它穿过样品到达物镜的路由的。

示于图9是一系列使用二十分之一至四分の一波长的偏压相位差范围几个中间步骤中记录的DIC数字图像 检体是包含脉动的厚度的区域的固定和安装小鼠小肠的15微米部分。 标本细节嘚再现性和阴影铸伪三维效果最显着的较低的偏置延迟值（图9（a）和图9（b））但对比度和细样品细节的定义都恶化的偏压相位差增加（通过9（F图9的（c）））。 在最高偏置延迟值（四分之一波长;图9（F））对比度极差，极少数的结构细节可见 对于这个特定的标本中，最佳楿位差范围出现的二十分之一和波长的十二分之一之间撒谎

如在样品的增加的光路梯度，所以确实图像对比度 改变所述偏压相位差不哃程度也可以产生于如在目镜（图9）中观察到的检体显著对比度波动。 在一般情况下位移的最佳程度由物镜棱镜的平移引起的普通和特殊波前之间，或在脱塞拿蒙补偿旋转偏振棱镜片是小于十分之一波长的量级。 但是该值是在很大程度上依赖于样品厚度，和偏压相位差的生物标本的有用范围位于三十分之一和四分之一波长之间 相反在样本具有非常大的光学梯度通常可以从更大的偏压相位差值受益（朂多全波长）。 引入偏压相位差成微分干涉反差显微镜使相位标本更容易地观察到并显着地促进了与传统的胶卷或数码相机系统成像的努力。

在DIC显微镜补偿延迟片

在微分干涉对比正常和非常波前之间偏压相位差也可以通过使用最初的物镜作为定量相位差测量装置和用于偏振棱镜光显微镜对比增强元件补偿器的操纵 补偿板赋予更大的控制，用于调节样本细节的对比度相对于背景亮度和颜色值并且还使波湔之间的偏差值的更精确的调整。 这些双折射组件也经常采用透明的标本其通常呈现在灰度值的有限范围的光染色 。

当一个标准的物镜諾马斯基棱镜沿着超越四分之一波长的路径差的显微镜光轴平移两个样品的特征和背景获得的牛顿干涉色类似于在偏振棱镜光显微镜观察的光谱。 试样和背景成为与穿过白黄，红蓝和更高顺序的一系列的灰度值的迁移颜色的过渡光学染色。 光染色产生的戏剧性和精美嘚彩色图像但科学应用有限使用。 通常最佳的标本对比度限于二十分之一的范围内相位差的四分之一波长。

补偿器可插入任一物镜棱鏡和分析仪或偏振棱镜片和聚光镜棱镜之间的DIC显微镜的光学路径 许多显微镜具有位于中间管或台下聚光镜壳体为此物镜设计的槽。 一阶補偿加成（通常称为全波或一阶红色板）具有等于在可见光（大约550纳米）的绿色区域的全波长的相位差值引入的干涉色给频谱试样和背景。 与代替补偿器绿色光无法穿过分析器，因为它从相位差板与具有相同的方向作为偏振棱镜片的电场矢量线性偏振棱镜射出 但是，茬红色和蓝色光谱区域的波前遇到相位差小于一个波长而成为椭圆偏振棱镜光使他们能够通过分析器传递组件。 其结果是这些颜色成為混合以形成视场品红背景。

因此当在白色光用微分干涉对比光学和一阶补偿观察试样，而图像的对比度以蓝色和一阶黄颜色（取决于方向）二阶的显示的背景显示品红色牛顿干涉色光谱 与代替补偿器，通过诺马斯基棱镜的转换（或以脱塞拿蒙补偿旋转偏振棱镜器）嘚到在具有大的光学相位梯度结构中观察到干涉色的快速变化获得偏压相位差小的变化。 这种技术是用于引入颜色（光学染色）具有高折射率的边界比如细胞膜，大细胞内颗粒纤毛，细胞核区域是有用的 由检体的特性所显示的干涉色可以比作一个米歇尔利维颜色图表仩的值，以获得光程差的估计

图10所示是几个透明标本已旋光染色并通过DIC光学技术在伪三维浮雕呈现。 图10（a）示出突起在栉鱼鳞的边缘洏犬钩虫（ 犬钩虫 ）的口在图10（b）的功能。 大豹蛾（Ecpantheria scribonia）的炫彩翼秤在图10（C）提出 在所有情况下，利用诺马斯基棱镜被穿过显微镜光轴转換到偏置延迟值超过全波长 虽然这些图像没有透露有关该标本隐藏的科学信息，他们必须提前DIC光学显微镜的技术科学和艺术之间的桥梁合法的潜力。

上搭载了德塞拿蒙补偿器用于将偏压成差分干涉对比的显微镜可以加入一个全波相位差板以光学染色与牛顿干涉色检体，并提供有关路径差异的详细的定量信息 如上所讨论的，去塞拿蒙补偿器经常在DIC显微镜用于获得偏压相位差的精确测量的水平但该装置也有用监测光学部件的对准。 在视频增强DIC显微镜德塞拿蒙补偿器通常用于优化在该位于下方的显微镜的分辨率极限标本细节对比度。

間与微分干涉相衬显微镜获得的图像的最显着的和公认的方面是高度可见浮雕的通过阴影播送效果，即赋予的伪三维现实表现 在一般凊况下，试样显示为通过它们是从低角度与高度倾斜光源令人联想起与传统的斜光或霍夫曼调制对比得到的结果的照射。 在谨慎但是，图像应始终以理解阴影和高光的影子投引渡只能说明相或光路梯度的符号和坡向不一定准确揭示几何或地形参数解释。

从观察阴影投射方向当前通过偏压相位差产生几乎每一个图象中光学剪切方向是显而易见的，并且可以精确地定义为连接显示所述最高值和最低亮度徝的区域的轴 应当考虑的另一个考虑是试样和其周围介质之间的关系，因为阴影的方向经常被颠倒为具有比其周围环境或者更高或更低嘚折射率标本的信息 其结果，密亚细胞颗粒如核，核仁线粒体，长丝中期染色体，和溶酶体通常显示升高高程（山顶）的外观洏较低的折射率夹杂物（例如，胞饮泡含水空泡，和脂滴）似乎凹陷洼地（火山口）

对比度赋予试样相位梯度通过微分干涉对比的水岼（和伪立体感的程度）是偏压相位差的通过转换诺马斯基棱镜或以脱塞拿蒙旋转偏振棱镜片引入光学系统的量的函数补偿器。 因为剪切軸通过诺马斯基和Wollaston棱镜设计和参与波前方向为微分干涉对比其他约束固定的轴方向不能改变，以影响通过在显微镜的简单设置标本的对仳度 然而，普通和特殊波前之间的相对的相位延迟也可以从显微镜光轴的一侧重新定位所述物镜棱镜的其它（从负转移偏压相位差为正反之亦然）可以相反。 这个操作也可以通过旋转偏振棱镜片上的德塞拿蒙补偿相应的负值来完成 当相位延迟被改变如刚才所述，亮和暗边的试样上的方位反转180度 在本质上，可为显微镜的唯一机制相对于检体剪切轴改变是调整试样本身即从圆形的360度旋转的阶段（主要設计用于偏振棱镜光显微镜）的利用有利于一个机动。

在微分干涉对比图像阴影和高亮强度是沿显微镜的剪切轴最大，这是相同的背景的恒定折射率显示的强度值的区域。 当从多个方位检查在接壤背景边缘对比度具有球形的几何形状（图8（f））的检体它被发现对比度嘚区域垂直于剪切轴最小的。 事实上对比试样和背景之间的差异逐渐减小，直至达到（垂直于剪切轴）的方向限定所述零阶干涉条纹的軸的最小值 在图8（c）和8（f）所示，显示的对比度（由未标记的白色箭头指示）的最低水平的样品区域在油滴躺在精确地垂直于剪切轴的Φ央区域的边缘 为了验证这一概念，比较其中干涉条纹满足（图8（c））的记录，在最大消光图像以引入偏压相位差（图8（F）的后生成嘚图像中的对应区中的背景的边缘） 由未标记的白色箭头标记区，普通和特殊的波前畸变已经对准剖面这是在分析仪中减去，以取消剩余延迟和屈服完全与背景相匹配的强度值

在微分干涉显微镜观察每个样品将有产生的最终图像的对比度的最高水平的最佳偏压相位差設定。 非常薄的标本显示浅折射率梯度例如生活在培养细胞中，通常可使用同样低偏压设置比相移存在于试样最大仅稍大（波长约二十汾之一的量级上或约30纳米）。 然而更厚的标本常常需要在大聚光镜孔较高的偏置设置（可达四分之一波长），以产生令人满意的结果通常是通过光学切片。 因为许多试样组成显示了各种不同的尺寸和折射率的特性而最佳的偏置相位差设置通常是一种妥协。

在几个样品微分干涉对比取向现象方位角效应在图11中呈现在所有情况下剪切轴西北涉及东南，但对个人数字图像不指示 图11（a）和11（b）示出毛孔囷皮纹通过从硅藻布纹attenuatum一个安装frustule表现的周期性间距。 当frustule的长轴垂直于剪切轴取向（图11（a））毛孔出现合并成一系列紧密间隔的脊的和不單独解决。 与此相反在平行于剪切轴的方向上的frustule的重新定位揭示了在这种孔结构的旋钮状几何形状。

包含淡水水蚤 （水蚤）的鳃肋骨胸蔀区域呈现如图11（C） 在该取向，从个人肋结构是清楚可见的（垂直于剪切轴）和连接到一个共同的脊柱作为长系列旋钮平行于剪切轴絀现。 当试样被旋转90度（图11（d））的大部分的肋结构的丧失对比度和脊旋钮合并成一个单一的脊。 最后在栉鱼鳞夹杂物缺乏对比度，並且难以叠加在横纹肌体棘（图11（e））的时区分开来 转动样品使平行于剪切轴的棘（图11（f））的降低了它们的对比度并呈现夹杂清晰可見。

有若干因素应该调整偏压相位差时产生最佳的标本对比度加以考虑。 必须引入到最大限度变暗某边坡或边缘检体的偏压的水平也产苼试样和背景之间的最大可能的对比度 因此，对于每个标本一个特定的物镜棱镜（或德塞拿蒙补偿器）的设置通常会引进最大程度的對比。 当超出此值时对比度将降低。 厚的标本其常常从光散射工件遭受通常需要比更薄标本较大偏压相位差设定（最多全波长）中具囿显著相位梯度区域，得到的消光 最后，当在聚光镜中的光圈开口的大小超过了物镜后孔的75％对比度减小在光学系统过度的光散射的結果。 有了这个困难一点打开聚光镜光圈时进行光学切片实验，谨慎使用

的能力的图像中具有大聚光镜和物镜的数值孔径微分干涉对仳试样使从聚焦图像显着地浅光学切片的创建。无光晕和在从焦点除去侧向平面亮区分心强度波动的扰动该技术产生被整齐地从复杂的彡维相位标本切片的清晰图像。 此属性常常用于获得蜂窝轮廓脆光学切片与来自结构的上方和下方的聚焦平面的干扰最小复杂的组织

在透射和反射光显微术的所有传统形式，聚光镜孔径光阑在界定图像对比度和分辨率的主要作用 减小光圈大小增加了现场和整体图像锐度嘚深度，同时产生对比度更强 然而，如果隔膜太远关闭衍射伪像变得清楚和分辨率牺牲。 通常情况下最佳的光圈设置之间足够的对仳度，精确的渲染标本细节和保持必要的图像分钟特征的分辨率同时避免衍射文物妥协。

高性能微分干涉显微镜的光学系统产生的优异嘚对比度与聚光镜光阑部分关闭（物镜后孔大小的大约70％）但是当隔膜被打开，以匹配物镜孔径大小也执行上好 为了实现对光学切片汾辨率和对比度之间的最佳平衡，显微镜必须正确配置为科勒照明和棱镜元件和偏振棱镜器应该被精确地对准 设计用于油浸高数值孔径粅镜应该仅被用于具有油聚光镜下侧图像标本幻灯片。

在高放大倍率和数值孔径（例如100倍和1.4），场的微分干涉对比的深度接近约400纳米（0.40微米约1.5倍物镜的横向分辨率极限）限制值。 通过在高放大倍率（100倍物镜）和数值孔径（1.30）人颊上皮细胞的中央区域取光学部分在图12中示絀的单元是为配置约3微米厚的核附近而景深用于获得图12中的图像是大约0.5微米。 细菌是显然对细胞的上表面上可见（图12（a））的因为是茬可以非常类似于人类的指纹的纹理的膜平行，旋流脊 在对应于细胞核膜隆起也是在该图的下部中心部分可见的。 作为焦平面移动到细胞内部（图12（b））的核结构的细节和细胞内颗粒变得可见。 最后在下部边界，在那里细胞膜在于（图12（c））的表面上许多折叠脊部顯露（类似于那些在上表面上观察到的）。

当较厚的生物样品（尤其是那些沉浸在水性盐溶液）进行光学切片实验显微镜必须警惕可能引入在盖玻片和安装介质之间的接口由折射率不连续性产生的球面像差。 这些文物将在光学部分系列更高的穿透深度降低分辨率

在微分幹涉对比目前的研究和理论发展的显著量主要集中在技术的显着的光学切片特性。 最终从检体的三维折射率分布的定量估计可以通过计算模型来实现。 此外目前的研究还冲着新车型在部分相干透射光DIC光学元件和成像正在开发中。

微分干涉显微镜基本上是一个束剪切干扰系统其中所述参考光束被一个微小量剪切，通常略小于一个艾里斑的直径 事实上，在检体的每个点由最终图像在两个重叠的艾里斑其中之一是明亮，比背景其他较暗表示 基本显微镜系统中，首先由Francis史密斯1955年提出的是一种改性偏振棱镜光显微镜添加了两个沃拉斯顿棱镜，一个聚光镜的前焦面和第二在物镜的后焦平面

后来的修改，由乔治诺马斯基建议使棱镜在物理上位于距光学孔径共轭平面了。 聚光镜棱镜将每个波前照射该样品成被正交相对于彼此偏振棱镜两个稍微移位平行光束，而物镜棱镜用于重组的光束 这两个棱镜，这昰由该光学系统镜像到彼此的结合是在微分干涉对比以形成高数值孔径的清晰图像的能力的重要特征。

相位差是由几何路径长度或检体这将导致椭圆偏振棱镜的重组光束离开物镜渥拉斯顿棱镜的折射率的梯度引入到两个正交波前。 偏压相位差可以通过平移沿着显微镜光軸物镜棱镜或由1/4波长板与偏振棱镜器或分析器结合被引入到系统中 因此，最佳的对比度场亮度和灵敏度可通过控制旋钮的简单旋转而獲得的。

所得的DIC图像具有一阴影投射的外观有效地显示为低和高空间频率的光路的梯度。 其中光路沿参照方向增加这些标本的地区显嘚更亮（或暗），而其中路径的差异减小地区出现相反的对比 在光程差较陡的梯度导致更大的对比度。 各种各样的试样是用于与微分干涉对比成像的良好候选包括非常薄的长丝或尖锐的接口，即产生即使它们的直径低于该光学系统的分辨率极限良好的对比度

间微分干涉显微镜的主要成像优点是，不像暗场或相位相反较小的样品特征的图像不被相邻的具有大的光学梯度区域遮蔽。 此外图像的阴影播送外观上的中性灰色的背景，其耦合到所述灵敏度非常小的特征与那些大得多成像一起（例如分钟附属物到活细胞或动态夹杂物和移动┅个细胞内的细胞器）是比传统的相位对比技术的显著改善。 这些好处除了对比度控制和浅景深的宽动态范围，这些都促成了该技术的廣泛普及

相反在DIC显微镜是方向性的，表现出沿剪切的轴线和在正交方向上的最小值最大值 艾里斑分离的方向（平均峰 - 峰间隔的二分之┅至三分之二的磁盘半径）与显微镜，这是最大对比度的方向的剪切轴线重合其结果是，该DIC对比度传递函数（CTF）也是沿剪切轴定向 穿過样品2波前之间的横向位移大约为一半的物镜的分辨率极限。 这个小程度的剪切通过渥拉斯顿或诺马斯基棱镜引起的，是在动作为空间頻率的细节在试样的对比度的高通滤波器类似 相应的调制传递函数（MTF）紧随在明照明为高空间频率观察到的，但显示的检查体急剧下降設有大小（较低空间频率）超过几微米

适合在DIC观察标本包括流体涂片，活细胞培养物血细胞，亚细胞器未染色的组织，染色体原苼动物，胚硅藻，聚合物复制品，以及相对厚的或超薄切片机切片 附加信息可以通过检查幅度和混合相振幅的标本，如自然着色原苼生物藻类和淡染组织标本而获得。 该技术通常在组合使用荧光显微镜来揭示用荧光区域相关联的细胞形态 当耦合到增强视频技术（稱为VEC-DIC视频增强对比度微分干涉对比），DIC可以用于生产具有显微镜的光学分辨率低于维度结构的图像