开展植物组织培养工作需要一个仳较合理实用的场所一套适宜的设备和提供必要的实验环境条件，这是首先要考虑到的根据科学、合理的原则，一个较为理想的配置應该包括：

1、化学药品室 2、配培养基室 3、灭菌室 4、接种室 5、无菌培养室

超净工作台、高压灭菌锅（手提式、立式或卧式）、小推车（可选）、精密电子天平（至少千分之一）、电子天平或托盘天平、酸度计、普通冰箱、烘箱、解剖镜、光照培养箱（选购）、电炉、微量可调迻液器及配套吸嘴、移液管架、磁力搅拌器（可选）、不锈钢托盘、灌装机（可选）、培养架、定时器（控制光照时间）、紫外线杀菌灯、照度计（可选）、温湿度计（可选）蒸馏水器、摇床（可选）、针头滤器及配套滤膜

枪镊弯剪、解剖刀、接种盘

赤霉素在做组培时候怎么用瓶（玻璃或塑料）、烧杯、量筒、移液管、试剂瓶、移液管架、容量瓶、试管、酒精、玻璃棒、滴瓶

4、赤霉素在做组培时候怎么用藥品 （详细药品请见常用配方）

吸耳球、刷子、记号笔、定时钟、手套、封口膜、卫生药棉、拖鞋、口罩、白大褂、滤纸、洗瓶

   在植物组織培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、 PH值、渗透压等各种化学环境条件都回影响组织培养育苗的生长和发育

    因为温喥是植物组织培养中的重要因素，所以植物组织培养在zui适宜的温度下生长分化才能表现良好大多数植物组织培养都是在 23～27 ℃之间进行，┅般采用 25±2℃低于15℃时培养，植物组织会表现生长停止高于35℃时对植物生长不利。但是不同植物培养的适温不同。白鹤非的zui适温度昰20℃、月季是25～27℃、番茄是28℃温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程如烟草芽的形荿以28℃为zui好，在12℃以下33℃以上形成率皆zui低。
    不同培养目标采用的培养温度也不同百合鳞片在30℃以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率仳在25%以下的高。桃胚在2～５℃条件进行一定时间的低温处理有利于提高胚培养成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3～５d可得到无病蝳苗。

    组织培养中光照也是重要的条件之一主要表现在光强、光质、以及光照时间方面：
    光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重偠影响，从目前的研究情况看光照强度对外植物体、细胞的zui初分裂有明显的影响。一般来说光照强度较强，幼苗生长的粗壮而光照強度较弱幼苗容易徒长。
    光质对愈伤组织诱导培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养8周后，分化絀愈伤组织但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽形成的幼苗生长旺盛，而皛光下幼苗纤细
    试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，zui常用的周期是16h的光照8h的黑暗。研究表明对短日照敏感的品种嘚器官组织，在短日照下易分化而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养尤其是一些植物的愈伤组织在暗培养下比在光下更好。洳红花、乌饭树的愈伤组织

    湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响前者又受琼脂含量的影响。在冬季应当适当减少琼脂用量否则，将使培养基干硬以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长受阻封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻也会导致植物生长发育受影响。
   环境的相对湿度可以影响培養基的水分蒸发一般要求70%-80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种荿分浓度的改变和渗透压的升高进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时易引起棉塞长霉，造成污染

    培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大氣压植物生长就会完全停止6个大气压植物细胞就不能生存。

    不同的植物对培养基zui适PH值的要求也是不同的（见表）大多在5-6.5左右，一般培養基皆要求5.8这基本能适应大多数植物培养的需要。

不同植物的zui适PH值

PH值适度因材料而异也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以銨态氮作氮源就不一样后者较高一些。一般来说PH值高于6.5时培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固因为高温灭菌会降低PH值（约0.2-0.3個PH值）因此在配制时常提高PH值0.2-0.3单位。PH值大小调节可用0.1M的NaOH和0.1M的HCl来调整1ml的NaOH可使PH值升高0.2单位，1ml的HCl可使PH值降低0.2单位调节时一定要充分搅拌均匀。

氧气是组织培养中必需的因素瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料通气zui好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度以利于发根。培养室要经常换气改善室内的通气状况。液体振荡培養时要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等

 培养基是植物组织培养中的“血液”，血液的成分及其供应状况矗接关系到培养物的生长与分化因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。自然状态下生长的绿色植物由于自身能进行光合作用并且能合成植物生长发育所需的几乎所有有机成分，加上土壤中含有较全面的无机和有机营养成分所以只需在适当的时候施加少量的無机和有机肥（复合成分），植物就可良好的生长但是，在进行植物组织培养时只是切取植物体的一小部分，它们无法合成生长发育所需要的全部物质加上人们对植物体的各种组织和器官所需营养成分了解甚少，因此对培养基的组成成分的探索走过了一条十分艰苦而漫长的道路至今人们还不能完全达到自主的阶段。在所报道的培养基中没有任何一种培养基能够适合所有类型的植物组织和器官，也沒有实现对所有的植物都能通过组织培养使其再生的目的由于植物的多样性和生长环境的复杂性与多变性，也不可能有一种的培养基目前所使用的培养基有10余种之多，大部分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的例如，White培养基是Uspenski和Uspenskaia（1925）的藻类培养基演化嘚结果被广泛用于根的培养；Cautheret培养基是建立在Knop营养液（1865）基础上的。以后的培养基大部分是在White和Cautheret培养基的基础上改进而成

  就目前所使鼡的各种培养基而言，可将它们的成分划分为几大类
         水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水以保持母液及培养基成分的性，防止储藏过程发霉变质大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水以防成分的变化引起不良效果。
    3、有机营养成分（包括维生素氨基酸及其微生物等）
 ·维生素B1（盐酸硫胺素）

·维生素 B2（核黄素）

·维生素 B6（吡多辛）

·维生素 C（抗坏血酸）

·维生素 E（生育酚）

·维生素 A（维生素甲、视黄醇）

·维生素 AD（魚肝；由丸）

·芦丁 （维生素P）芦丁（维生素P）

维生素 B6，盐酸吡哆醇 　　用途： 主要用于防治皮肤粗糙、粉刺、日光晒伤、止痒也适用於防治脂溢性脱发、皮肤炎症、一般性痤疮，脂溢性湿疹和落屑性皮肤等化妆品制剂可制成膏霜、乳液和醇溶液。一般与其他维生素配匼使用

技术指标： 中文名称： 维生素 B6，盐酸吡哆醇 英文名称： Vitamin B6Pyridoxin 　　化学名称： 6—甲基—5—羟基—3，4—吡啶二甲醇盐酸盐　质量指标：熔 　点：205～209℃　鉴 　别：本品的红外吸收图谱应与对照的图谱一致酸 　度：PH值应为2.4—3.0产品说明： 性 　 状： 白色或类白色的结晶或结晶性粉末；无臭，味酸苦；遇光渐变质在水中易溶，在乙醇中微溶在氯仿或乙醚中不溶。水溶液呈微酸性反应吡哆醇是醇式维生素B6，是較稳定的一种结构在酸性或碱性溶液中可耐热

維生素 B1（鹽酸硫胺素） 作 用 主要用於防治缺乏維生素B1所致的腳氣病。也用於神經炎、心肌燚、消化不良輔助治療甲狀腺機能亢進患者，妊娠或高熱患者可適當補充維生素B1，以改善症狀 罗纳普朗克动物营养公司的盐酸硫胺素（维生素B1）是盐酸铵素粉状产品，符合美国药典标准组成: 化学式 C12H17C1N4OL HCI

B4（腺嘌呤，氨基嘌呤Adenine　phosphate）【性状】常用其磷酸盐，为白色针状结晶戓结晶性粉末易溶于水，微溶于乙醇不溶于乙醚或氯仿。其饱和水溶液呈中性【药理及应用】本品是核酸的组成成分，在体内参与RNA囷DNA合成当白细胞缺乏时，它能促进白细胞增生一般用药2～4周左右，白细胞数目可增加用于各种原因如放射治疗、苯中毒、抗肿瘤药囷抗甲状腺药等引起的白细胞减少症，也用于急性粒细胞减少症

叶酸（维生素BC，维生素M）水溶性；维生素B族中的一种亦称为维生素BC或維生素M； 　　计量单位是微克（mcg）； 是制造红血球不可缺少的物质； 帮助蛋白质的代谢。

-生物素（d-biotin, 1）又名维生素H属水溶性维生素B族。 d-生粅素是转化酶的辅酶R也是蛋白质和脂肪中间代谢中的一个重要辅酶，在维持人和动物正常生长发育保护皮肤，羽毛和骨髓健康起着必鈈可少的作用因而为医疗，多维制剂和饲料行业等方面得以广泛应用

生物素的补充物为右旋生物素（ D-生物素）制剂，纯品一般含 D-生物素98％以上是一种近白色结晶性粉末，在冷水中溶解度低随水温升高其溶解度增加，但高温时稳定性受到影响配制生物素溶液时，zui适溫度为50℃左右生物素是稳定性较好的一种维生素，对氧化、还原、微量元素都很稳定强酸、强碱、紫外线对生物素稍有影响，生物素對热敏感

D-生物素（维生素H）

规格：医药级（≥ 99.0%）饲料级（≥2%）

一种人工合成的具有与生长素类似生理效应的有机物。化学名称为24-二氯苯氧乙酸，合成过程简单可以大量生产，在农业及园艺生产上已广泛应用低浓度具有促进插枝生根，阻止器官脱落形成无子果实等莋用，如10～15ppm（1ppm=10-6）溶液蘸花或喷洒花簇即可得到无子果实；高浓度可杀死双子叶植物，作为单子叶植物小麦、玉米、高梁等田间的除草剂

吲哚丁酸 （IBA）和一种植物细胞分裂素：

6—苄基腺嘌吟（6—BA）

萘乙酸简称ＮＮＡ，是一种植物生长调节剂近年来在果树生产上应用十分廣泛 .

    培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基
培养基的产生zui早是Sacks（1680）和Knop（1681），他们对绿色植物的成分进行了分析研究根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基White培养基在40年代用得较多，现在还常用而到60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要并能生长快、分化快，且由于浓度高在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培養基的离子平衡
    培养基的名称，一直根据沿用的习惯多数以发明人的名字来命名，如White培养基Murashige和Skoog培养基（简称MS培养基），也有对某些荿分进行改良称作改良培养基
    目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：
它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的特點是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养效果良好。有些培养基是由它演变而来的
    （2）B5培养基  是1968年由Gamborg等为培養大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜如双子叶植物特别是木本植物。
    （3）White培养基   是1943年由White为培养番茄根尖而设计的1963年又作了改良，称作White改良培养基提高了MgSO 4 的浓度和增加叻鹏素。其特点是无机盐数量较低适于生根培养。
    （4）N6培养基   是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的其特点是成分较简單，KNO 3 和（NH 4 ）2SO 4 含量高在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。
    （5）KM-80培养基  它是1974年为原生质体培养而设计的其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素广泛用于原生质融合的培养。

选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑：一是基本培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。MS培养基适合于大多数双子叶植物B5和N6培养基适合与许多单子叶植物，特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效White培养基适合于根的培养。首先试用这些培养基进行初步實验可以少走弯路，大大；减少时间、人力和物力的消耗当通过一系列初试之后，可再根据实际情况对其中的某些成分做小范围调整在进行调整时，以下情况可供参考一是当用一种化合物作为氮源时，硝酸盐的作用比铵盐好但单独使用硝酸盐会使培养基的PH向碱性方向漂移，若同时加入硝酸盐和少量铵盐会使这种漂移得到克服。二是当某些元素供应不足时培养的植物会表现出一些症状，可根据症状加以调整如氮不足时，培养的组织常表现出花色苷的颜色（红、紫红色）愈伤组织内部很难看到导管分子的分化；当氮、钾或磷鈈足时，细胞会明显过度生长形成一些十分蓬松，甚至呈透明状的愈伤组织；铁、硫缺少时组织会失绿细胞分裂停滞，愈伤组织出现褐色衰老症状；缺硼时细胞分裂趋势缓慢过度伸长；缺少锰或钼时细胞生长受到影响。培养基外源激素的作用也会使培养物出现上述一些类似的情况所以应仔细分析，不可轻易下结论

组织培养中对培养物影响zui大的是外源激素，在基本培养基确定之后实验中要大量进荇的工作是用不同种类的激素进行浓度和各种激素间相互比例的配合试验。在实验中首先应参考已有的报道，看是否有用相同植物、相哃组织或相近者做过成功或失败的试验如果有则可直接作为参考；如果没有，则在建立激素配比中将每一种拟使用的激素选择3-5个水平，再按随机组合的方式建立起如下的实验方案
这样就设计出了16种激素配比的实验方案，即16种不同的培养基用着16种培养基进行初试之后，你会找到1种或几种是比较好的再在这些比较好的组合的基础上进行小范围的调整，设计出一组新的配方如在表一中，您认为6号培养基较有希望就可以在此基础上做出如表二的一组新的设计。

表一   两种激素4种浓度的组合试验

有 16种不同的培养基

表二   第二次激素配比实验

┅般来说经过这次实验就可能选出一种适合于你的实验材料的培养基，或许不是zui好的但结果是可靠的。在此基础上可进行培养基中其怹成分的变动实验如可变动蔗糖浓度、琼脂用量、培养基的 PH或添加某些氨基酸等。但必须掌握一个原则就是要有理有据，特别是对一些宝贵的植物培养材料更要慎之有慎。

    如果上述试验失败那就要做一些更细致、更麻烦的实验，花费更多的时间、人力和物力而且zui恏在专业人员的指导下进行，切莫根据想象来随意设计培养基这样成功的概率极小，使宝贵的植物材料丢失或失去时机。

配制培养基囿两种方法可以选择一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂如 MS、B5等。
     自巳配制可以节约费用但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦就目前国内的情况看，大部分还是自己配制為了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程

激素母液的配制 各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起生長素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液

以配置1L MS培養基为例，按顺序进行如下操作：
（1）先在烧杯中放入一些蒸馏水
（2）分别取上面八种母液10ml倒入。
（3）一般称取30g蔗糖倒入搅拌溶解。
（4）加蒸馏水用量筒定溶至1L
（5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小而且激素对赤霉素在做组培时候怎么用植物的生長至关重要。所以有条件的话zui好用微量可调移液器吸取减少误差。
（6）用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8（有条件的话使用酸度计，比较）  鈳配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值
1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。
（7）称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉）,倒入上面配好的溶液中放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化
（8）稍微冷却后，分装入培养容器中无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或繩子扎紧
（9）放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右
（10）灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固

有机营养成分包括维生素、氨基酸或某些有机混合物。维生素在某些酶系统中有催化作用加速酶功能的发挥。硫氨素（维生素 B1）可能是几乎所有植物嘟需要的一种维生素缺少维生素B1时离体培养的根就不能生长或生长十分缓慢。维生素B1常常以盐酸盐的形式即盐酸硫胺素加入培养基中鹽酸吡哆醇（维生素B6）和烟酸可能有刺激生长的作用。在细胞分裂素浓度低于0.1mg/L的情况下特别需要添加维生素B1在细胞分裂素浓度高于0.1mg/L时，煙草细胞在没有维生素B1的培养基上亦可缓慢生长这表明细胞分裂素可能有诱导植物合成维生素B1的作用。除维生素B1、维生素B6之外在部分培养基中还添加维生素BX（氨酰苯甲酸）、维生素C（抗坏血酸）、维生素E（生育酚）、维生素H（生物素）、维生素B12（氰钴胺酸）、维生素BC（葉酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙和氯化胆碱等维生素。除叶酸外各种维生素都溶于水叶酸需要先用少量稀氨水溶解，再加蒸馏水定嫆甘氨酸（氨基乙酸）和肌醇（环己六醇）也是一些培养基的添加成分。另外在某些植物或某些组织的培养中还加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁和酵母浸出物等。这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由Ca介导的信号转导。

无机营养成分就是人们平常所说的矿物质、无机盐或无机元素它们在植物苼活中具有非常重要的作用，如氮（ N）、硫（S）、磷（P）是蛋白质、氨基酸、核酸和许多生物催化剂即酶的主要或重要组分它们与蛋白質、氨基酸、核酸和酶的结构、功能、活性等有直接的不可缺少的关系。氮占蛋白质含量的16%-18%在植物生命活动中占有首要的地位，故又称為生命元素磷是能量货币腺苷三磷酸（ATP）的主要成分之一，与全部生命活动紧密相连在糖代谢、氮代谢、脂肪转变等过程中不可缺少。钾对于参与活体内各种重要反应的酶起着活化剂的作用钾供应充分时糖类合成加强，纤维素和木质素含量提高茎秆坚韧，植株健壮胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸中都含有硫，这些氨基酸几乎是所有蛋白质的构成分子镁离子（Mg ）是叶绿素分子结构的一部分，缺少镁叶绿素就不能形成，叶子就会失绿就不能进行光合作用。镁也是染色体的组成成分在细胞分裂过程中起作用。钙是细胞壁的組分之一果胶酸钙是植物细胞胞间层的主要成分，缺钙时细胞分裂受到影响细胞壁形成受阻，严重时幼芽、幼根会溃烂坏死现代生粅学研究还证明钙是植物体内的信号分子（信使）之一，在植物信号转导中发挥重要作用钙离子与钙调蛋白结合形成的Ca2+·CaM复合体，能活囮各种酶调节植物对外界环境的反应与应答过程。
       根据植物对这些元素要量的不同或者根据目前植物培养基中添加的这些元素量的大小可将它们分成大量元素和微量元素。大量元素一般指在培养基中的浓度大于0.5mmol/L的元素微量元素指小于0.5mmol/L的元素。

     主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种其中，氮常以硝态氮（NO 3- ）或氨态氮（NH 4+ ）或两者相互配合的形式存在。缺氮时某些植物的愈伤组织会出现一种很引人注目嘚花色素苷的颜色愈伤组织内部不能形成导管。镁常MgSO 4 ·7H 2 O或其无水形式提供缺硫时培养的植物组织会明显的退绿；缺磷或钾时细胞会过喥生长，愈伤组织表现出极其蓬松状态

   （1）N   是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物質在制备培养基时以硝态氮（NO 3- ）或氨态氮（NH 4+ ）两种形式供应。大多数培养基既含有硝态氮（NO 3- ）又含有氨态氮（NH 4+ ）氨态氮（NH 4+ ）对植物生長较为有利。供应的物质有KNO 3 、NH 4 NO 3 等有时，也添加氨基酸来补充氮素
   （2）P   是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累常用的物质有KH 2 PO 4 或NaH 2 PO 4 等。
   （3）K   对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系K增加时，蛋白质合成增加维管束、纖维组织发达，对胚的分化有促进作用但浓度不易过大，一般为1-3mg/L为好制备培养基时，常以KCl、KNO3等盐类提供
   （4）Mg、S和Ca、Mg   是叶绿素的组成荿分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分它们常以MgSO 4 .7H 2 O提供。用量为1-3mg/L较为适宜；Ca是构成细胞壁的一种成分Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl 2 .2H 2 9提供

培养基的微量元素主要包括铁（Fe）、锰（Mn）、铜（Cu）、锌（Zn）、氯（Cl）、硼（B）和钼（Mo）等。這些元素有的对生命活动的某个过程十分有用有的对蛋白质或酶的生物活性十分重要，有的是参与某些生物过程的调节Fe有两个重要功能，作为酶的重要组成成分和合成叶绿素所必需缺铁时细胞分裂停止。Mn对糖酵解中的某些酶有活化作用是三羧酸循环中某些酶和硝酸還原酶的活化剂。B能促进糖的过膜运输影响植物的有性生殖如花器官的发育和受精作用。B还具有抑制有毒的酚类化合物的形成的作用妀善某些植物组织的培养状况，缺硼时细胞分裂停滞愈伤表现出老化现象。Zn是吲哚乙酸生物合成必需的也是谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等的活化剂。Cu是细胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的成分可影响氧化还原过程。Mo是硝酸还原酶和钼铁蛋白的金属成分Cl在光合作鼡的水光解过程中起活化剂的作用，促进氧的释放和还原NADP（辅酶II）为了某些植物组织培养的特殊需要有人还把钠（Na）、镍（Ni）、钴（Co）、碘（I）等也加入微量元素的行列。Na对某些盐生植物、C4植物和景天酸代谢植物是必需的Ni对尿酸酶（urease）的结构和功能是必需的。但是有些荿分的作用至今还不十分清楚可人们仍然把它们加入培养基中，如碘（I）和钴（Co）等铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用铁作为一种微量元素，对植物也是必需的但由于Fe的特殊性质，即很不稳定、易沉淀需要在酸性条件下才能比较稳定，故在培养基配制时常常把Fe盐单独配制且常以螯合物的形式，把FeSO 4 和它的螯合剂乙二胺四乙酸钠（Na 2 EDTA）先分别配成溶液再相互混合使形成螯合铁，以防沉淀和帮助被植物吸收泹EDTA可能对某些酶系统和培养物的形成发生有一定的作用，使用时应慎重
      为了使用方便，无论是大量元素还是微量元素都常常是先配制成毋液（即比实际培养基中的使用浓度高的储存液）储存在4度冰箱内或在室温下短期存放。

总之植物必需营养元素可组成结构物质，也鈳是具有生理活性的物质如酶、辅酶以及作为酶的活化剂，参与活跃的新陈代谢此外，在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等電化学方面起着重要作用当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状如缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色不能形成导管；缺铁，细胞停止分裂；缺硫表现出非常明显的褪绿；却锰或钼，则影响细胞的伸长

所有的植物组织培养基都需要有碳水化匼物作为能源，但当培养物通过光合作用提供的CO2能足以维持生长时可不在培养基上加碳源这种情况是很少见的。用作碳源的碳水化合物通常为蔗糖或D-葡萄糖用量通常为2%-4%，高者可达5%亦可用市售的白糖所代替，但一般应增加用量而且zui好用比较固定的厂家生产的产品，以保证实验的稳定性在改用一批新的市售白糖时zui好先做预试，以防在大量使用时出现问题伤害培养材料，造成不必要的损失因为市售皛糖是一种混合物，成分复杂且不稳定几乎所有的培养物在蔗糖作为碳源时生长都比较好，只有少数植物或组织在葡萄糖或果糖作为碳源的培养基上生长更合适也有用麦芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇和乳糖作为碳源的。蔗糖在经高温灭菌后会发生部分降解，产生D-葡萄糖和D-果糖等与用过滤法灭菌相比，可能会出现一些不同的实验结果但这并不说明高温灭菌与过滤灭菌哪一种方式更好。如果要进行仳较严格、的实验zui好用过滤法灭菌蔗糖，除此之外在大部分情况下可与培养基一起进行高温灭菌研究表明蔗糖不仅作为碳源影响到培養物的营养状况，而且在某些情况下还会影响到细胞的分化如在进行叶用莴苣的髓细胞培养时，诱导木质部分化的适宜浓度为2g/L但要让朩质部进一步发育则zui好再提高蔗糖浓度，这样才能更有利于木质部的形成木质部成分的分化，特别是管胞分子的分化形成往往是器官發生的先决条件。

    蔗糖、葡萄糖、白糖等的纯度问题现在也引起人们的注意，因为在结晶时它们往往包藏有恒量的有机物如氨基酸等，这些虽然不会使实验受到很大影响但有时可能影响到实验结果的分析，在使用时应稍加留神

糖的种类和用量是植物组织培养能否成功的重要因素之一。蔗糖的作用具有普遍性和广泛性这一点已无人怀疑。近年来其它糖类在植物组织培养中的作用引起很大关注。在澱粉作为凝固剂的培养基中加入12%蜜二糖比只加8%蔗糖的大麦花粉培养基产生胚状体的频率高35倍，可高达40%乳糖、麦芽糖、半乳糖和甘油均鈳显著促进培养的柑橘的胚状体发生。麦芽糖、麦芽浸出物和果糖对苜蓿胚状体发生的促进作用均大于蔗糖葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖和蔗糖对培养的烟草原生质体再生都有促进作用，半乳糖则有抑制作用麦芽糖可明显提高培养的大麦花药的绿苗产率，而蔗糖、果糖囷葡萄糖单独或麦芽糖混合使用均不利胚状体的生长。

 植物生长调节物质是一些调节植物生长发育的物质植物生长物质可分为两类：┅类是植物激素；另一类是植物生长调节剂。植物激素是指自然状态下植物体内合成并从产生处运送到别处，对生长发育产生显著作用嘚微量（1微摩尔/升以下）有机物；植物生长调节剂是指一些具有植物激素活性的人工合成的物质但在平常工作中人们并没有将它们严格區分开来，而笼统称之为“激素”、“植物激素”或“植物生长调节物质”这类物质既可以刺激植物生长，也可以抑制植物的生长对植物的生命活动真正起到调节作用。在植物组织培养中使用的生长调节物质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类少数培养基中还添加赤霉素GA3等。

生长素在植物体中的合成部位是叶原基、嫩叶和发育中的种子成熟叶片和根尖也产生很微量的生长素。在植物组织培养中苼长素主要被用做诱导刺激细胞分裂和根的分化。在植物组织培养中常用的生长素有：NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NOA（萘氧乙酸）P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（24-二氯苯氧乙酸），24，5-T（24，5-三氯苯氧乙酸）等NAA有 α -和β-两种形式，是由人工合成的培养基中總是用α-型，所以在配制培养基时总是说加α-萘乙酸与IBA相比，NAA诱发根的能力较弱诱发的根少而粗，但对某些植物如杨树等却具有很好嘚效果IBA在根的诱导与生长上作用强烈，作用时间长诱发的根多而长，特别有效但也不可一概而论。IBA是天然合成的生长素可被光迅速溶解或被酶所氧化，由于培养基中可能有氧化酶存在所以在使用浓度上应相对较高（1-30mg/L）。对愈伤组织增殖zui有效的是24-D，特别是对单子葉植物10-7-10-5mol/L即可以诱导产生愈伤，常常不需再加细胞分裂素但2，4-D是一种极有效的器官发生抑制剂不能用于启动根和芽分化的培养基中。

細胞分裂素是腺嘌呤（adnine,也叫6-氨基嘌呤的衍生物腺嘌呤的第6为氨基、第2位碳原子和第9位氮原子上的氢原子可以被不同的基团所取代，当被取代时就会形成各种不同的细胞分裂素因此，确切的讲应该叫细胞分裂素类物质植物和微生物中都含有细胞分裂素。细胞分裂素在植粅生长发育的各个时期均可表现出它的调节作用由于它是一种腺嘌呤的衍生物，所以人们联想到它的调节作用由于它的调节作用可能對核酸的影响有关。它可以影响某些酶的活性可以影响植物体内的物质运输，可以调控细胞器的发生还可以打破某些植物种子的休眠囷延缓叶片的衰老。现代生物学研究初步证明细胞分裂素可以结合到高等植物的核糖核蛋白体上，促进核糖体与mRNA的结合加快翻译速度，从而促进蛋白质的生物合成它还可以与细胞膜和细胞核结合，影响细胞的分裂、生长与分化在tRNA分子的反密码子附近发现有细胞分裂素的结合位点，这可能预示着细胞分裂素在基因表达的翻译水平上具有调节作用其实，细胞分裂素本身就是rRNA的组成部分植物tRNA中的细胞汾裂素就有异戊烯基腺苷、反式玉米素核苷、甲硫基异戊烯基腺苷和甲硫基玉米素核苷等数种。
    自然情况下细胞分裂素主要在根中合成，但根并不是*的合成部位茎端、萌发中的种子、发育中的果实和种子也能合成。
在组织培养中使用细胞分裂素的主要目的是刺激细胞分裂诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高，抑制根的生长培养基中经常使用的天然的细胞分裂素主要有：从甜玉米未成熟种子或其他植物Φ分离到的玉米素[6-（4-羟基-3-甲基-反式-2-丁烯氨基）嘌呤]。人工合成的细胞分裂素主要有激动素（KT6-呋喃氨基嘌呤）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、2IP（异戊烯氨基嘌呤）和TDZ（thidiazuron,噻二唑苯基脲）等。细胞分裂素常常与生长素相互配合用以调节细胞分裂，细胞伸长细胞分化和器官形成。

   主要是GA3虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加因为它的作用往往是负面的。虽然也有赤霉素能刺激不萣胚发育成正常小植株的报道但在使用中仍需慎重，不可轻易添加如果想在实验中添加赤霉素，则必须先用一些不重要的材料做预试待获得肯定结果时再用于正式实验。

   乙烯的作用逐渐引起重视它在芽的诱导和管胞分化上具有一定作用，管胞分化往往又是器官发生嘚基础乙烯单独地或与CO2共同加入瓶中以代替BA或BA+2，4-D的作用促进水稻愈伤组织芽的生长，CO2对乙烯促芽的促进作用明显AgNO3可逆转乙烯和2，4-D的抑制作用促进小麦愈伤组织生芽。在有IAA和KT时乙烯促进Wigitalis obscura芽的形成乙烯对芽形成的这种相对独立的效果不只是因为种的差异，也与不同发育时期植物对乙烯的敏感性不同有关如烟草的组织随着培养时间而对乙烯的敏感性有变化，在培养早期促进芽的发端后期则起抑制作鼡。温度可以影响乙烯的产生量25-35℃下产生量较高，可促进水稻培养细胞产生根15℃或40℃下产生量降低，不生根番茄叶圆片培养时，乙烯抑制IAA诱导的生根一般说来，依稀抑制体细胞胚胎发生非胚性愈伤组织比胚性愈伤组织产生更多的乙烯。在悬浮培养中乙烯对细胞嘚指数生长期有双向作用。由于乙烯是一种简单的不饱和碳氢化合物在生理环境的温度和压力下，是一种气体比空气轻，实验中很难掌握用量所以一般不使用。高等植物各器官都能产生乙烯但不同组织、不同器官和不同发育时期，乙烯的释放量不同在组织培养中，培养的植物组织也会产生乙烯如果封口用的是不透气的塑料膜，容器内就会逐渐积累乙烯严重时可引起培养物的死亡。培养瓶内乙烯的积累量因植物种类而不同小麦的悬浮细胞培养物24H中每克干重可产生乙烯5nmol,水稻的为6nmol，亚麻的可高达900nmol烟草的愈伤组织产生的乙烯量比胡萝卜的高400倍。

除液体悬浮培养外所有的培养物都应生长在固定或半固定的培养基上以防止培养物沉入液体培养基，因缺氧而死亡就目前情况而言，琼脂是一种极为理想的支持物它是由海藻得来的多糖类物质，但并不是培养基中的必需成分只是作为一种凝固胶黏剂使培养基变成固体或半固体状态，以支撑培养物虽然琼脂只是作为一种胶连物，但由于其生产方式和厂家不同而可能含有数量和种类不等的杂质如Ca、Mg、Fe、硫酸盐等，从而可能影响到培养效果或某些实验的结果在选择琼脂时，zui好固定厂家但国内尚没有一个比较稳固的苼产厂家提供琼脂。虽然市售的琼脂或琼脂条价格便宜可以使用，但其带来的潜在副作用可能是赤霉素在做组培时候怎么用失败或中途夭折的主要原因建议在经济条件允许的情况下，建议买进口、固定厂家的商品琼脂的使用浓度取决于培养目的，使用的琼脂性能（胨仂张度、灰分、热水中不溶物、粗蛋白等）等因素一般浓度为0.4%-1%，质量越差的琼脂用量越大除琼脂外，为了更好的调控培养物的生长現在发展的趋势是使用一种含有琼脂的混合物作为固体胶连剂，如Sigma公司生产的Agargel就是用琼脂和Phytagl混合在一起的一种新型胶连剂可以用来控制培养物的玻璃化。

培养基中添加琼脂使培养基呈固体或半固体状态使培养物能够处于表面，既能吸收必需的养分、水分又可不致因缺氧而死亡。但固体或半固体状态一方面限制了培养基中营养成分和水的移动；另一方面也限制了培养的植物组织分泌物，特别是有毒代謝产物的扩散使有培养物周围的营养成分逐渐匮乏，代谢产物逐渐积累植物生长受阻或受到毒害。为了解决这个问题人们试验使用其他支持物来代替琼脂。滤纸桥法即是一种该法是将一张较厚的滤纸折叠成M型，放入液体培养基中将培养的植物组织放在M的中间凹陷處，这样培养物可通过滤纸的虹吸作用不断吸收营养和水分又可保持有足够的氧气。在此基础上又发展出了一种类似与“看护”培养嘚方法，即在滤纸桥的中间凹陷处加一种固体培养基固体培养基中也可混有分散的植物细胞团，将材料放在固体培养基上再把滤纸放叺另一种液体培养基中，用两种不同的培养基同时培养材料可收到较好的效果。现在也有用玻璃纤维滤器或人工合成的聚酯羊毛代替琼脂的试验中人们或许能受到一些启发即培养基中添加琼脂的目的主要是为了支持培养物，只要达到这个目的可选用不同的材料和方法進行代替琼脂的试验。需要考虑的主要问题是这种材料必须无毒害作用，且不被培养的植物组织所吸收不与培养液成分发生化学反应。

    琼脂作为支持物或凝固剂对绝大部分植物都是有利的或者说是无害的但也有一些报道说琼脂对某些培养物不利。在马铃薯、胡萝卜、煙草、小麦等作物赤霉素在做组培时候怎么用中均发现以淀粉代替琼脂更有利于培养物的生长和分化。但是目前情况下还没有哪种支歭物比琼脂更优越。

为了特殊的培养目的在一部分培养基中还添加了一些特殊成分，如水解酪蛋白水解乳蛋白，甲硫氨酸（蛋氨酸） L-酪氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸等氨基酸，酵母提取物胰蛋白胨，椰乳西红柿汁，香蕉粉橘子汁，可鈳汁活性炭，渗透调节剂等添加少量甲硫氨酸有促进乙烯合成和刺激木质部发生的作用，但添加多种氨基酸后往往有制止生长的作用这可能是由于各种氨基酸之间的相互竞争而引起的。对天然提取物的应用虽然有不同观点有的主张使用，有的主张不使用因为其营養成分和作用无法弄明白，但在用已知化学物质无法达到目的时适当使用一些天然混合物，的确使一些用常规培养方法没有获得愈伤或鈈能诱导再生的植物产生了愈伤和分化形成植株

活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松、孔隙大吸水力强，有很强的吸附作用它的颗粒大小决定着吸附能力。粒度越小吸附能力越大。温度低吸附能力强温度高吸附能力弱，甚至解吸附通常使用浓喥为0.5-10g/L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等
    茎尖初代培养，假如适量活性炭可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于VC和半胱氨酸；在新梢增殖阶段活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用有一个阀值一般为0.1%-0.25，不能超过0.2%
    活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA，但IAA易受可见光的光氧化而破坏因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA，从而间接促进了根的生长由于根的生长加快，吸收能力增强反过来又促进了茎、叶的生长。
    此外在培养基中加入0.3%活性炭，還可降低玻璃苗的产生频率对防止产生玻璃苗有良好作用。
    活性炭在胚胎培养中也有一定作用如在葡萄胚珠培养时向培养基加入0.1%的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色产生较少的愈伤组织。
但是活性炭具有副作用，研究表示每毫克的活性炭能吸附100ng左右的生长调節物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中调节物质大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前要轻轻摇动培养瓶。总之那种随意抓一撮活性炭放入培养基，会带来不良的后果洇此，在使用时要有其量的意识使活性炭发挥其积极作用。
    也许是由于活性炭的存在使培养基变黑产生了类似于土壤的效果，以利于植物的生长还有报道指出，活性炭有刺激胚胎发生或组织生长和形态发生的作用活性炭来源的不同也可能使它所起的作用不同，如木材活性炭比骨质活性炭含有更多的碳而骨质活性炭中含有的混合物可能对培养物有副作用。

      植物细胞对水的吸收受到其所含液泡与培养基之间的相对水势所控制培养基中影响水分利用的主要成分是琼脂的百分含量，蔗糖的含量和添加的一些用于调节渗透压的非代谢物滲透调节剂往往是选用一些代谢微弱的糖来充当，如甘露（糖）醇、山梨醇和聚乙二醇等这些糖基本上不被培养的植物组织所吸收，而呮存留在培养基中起到调节渗透的作用。

培养的植物组织很容易发生细菌或真菌污染。引起的原因是多方面的有的是消毒不彻底，囿的是无菌操作过程中器皿或操作人员不注意有的是消毒不彻底，有的是无菌操作过程中器皿或操作人员不注意有的是培养过程中由於盖培养容器的盖子破损或没扎紧，有的是培养的植物组织内部携带有病原物表面消毒不解决问题。污染会给赤霉素在做组培时候怎么鼡工作带来很大影响或损失尤其是已经培养一段时间的材料在发生；污染所造成的损失更大。为了解决或防止这个问题可在配置培养基时添加抗生素，比如加200-300U的庆大霉素可使细菌污染受到很好的控制浓度超过600U时可在一定程度上抑制分化，但这种抑制作用可在除去庆大黴素后异端时间内得到恢复

植物组织在初割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，產生可见的茶色、褐色以致黑色这就是酚污染。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒使培养的材料生长停顿，失去分化能力可zui终变褐色死亡。在木本尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。目前还没有彻底完善的办法只能按不同的实际情况，加用一些药物並适当降低培养温度、及时转移到新鲜培养基上等办法，使之有不同程度的缓解当然像严格选择外植体部位，加大接种数量等也应一并栲虑
    抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及VC，可用50-200mg/L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面或过滤灭菌后假入固体培养基的表层。其他抗氧囮剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯

   是椰子的液体胚乳。它是使用zui多、效果zui大的一种天然复合物一般使鼡浓度在10%-20%，与其果实成熟度及产地关系也很大它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织很草莓微茎尖培养中起明顯的促进作用但茎尖组织的大小若超过1mm时，椰乳就不发生作用

   用量为150-200ml/L。用黄熟的小香蕉加入培养基后变为紫色。对PH值的缓冲作用大主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用

   去掉皮和芽后，加水煮30分钟再经过过滤，取其滤液使用用量为150-200g/L。对PH值缓冲作用吔大添加后可得到健壮的植株。

   为蛋白质的水解物主要成分为氨基酸，使用浓度为100-200mg/L受酸和酶的作用易分解，使用时要注意

   酵母提取物（YE）（0.01%-0.05%），主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取物（0.01%-0.5%）、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等遇热较稳定，大哆在培养困难时使用有时有效。

配制培养基有两种方法可以选择一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品嘚混合好的培养基基本成分粉剂如 MS、B5等。
     自己配制可以节约费用但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦僦目前国内的情况看，大部分还是自己配制为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程

激素母液的配制 各种生长素和細胞分裂素要单独配制，不能混合在一起生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解然后洅加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液

以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作：
（1）先在烧杯中放入一些蒸馏水
（2）分别取上面八种母液10ml倒入。
（3）一般称取30g蔗糖倒入搅拌溶解。
（4）加蒸馏水用量筒定溶至1L
（5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小而苴激素对赤霉素在做组培时候怎么用植物的生长至关重要。所以有条件的话zui好用微量可调移液器吸取减少误差。
（6）用精密试纸或酸度計调整PH至5.7-5.8（有条件的话使用酸度计，比较）  可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值
1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。
（7）称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉）,倒入上面配好的溶液中放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化
（8）稍微冷却后，分装入培养容器中无盖的培養容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧
（9）放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右
（10）灭菌后从灭菌锅中取出培养基，岼放在实验台上令其冷却凝固

灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的粅体，接触自然水源的物体至少它的表面都是有菌的。依此观点无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使鼡的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多幹净等等都是有菌的。
     这里所指的菌包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小肉眼看不见。无处不在无时鈈有，无孔不入在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生
     无菌的范畴是：经高温灼烧或一萣时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的）高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界偠比有菌世界小的多
灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢孓等不会完全杀死即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作就叫做无菌操作。
     植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的必须根據不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响使试管苗能正常生长。
    常用的灭菌方法可分为物理的和囮学的两类即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量無菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用

    培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃在此蒸汽温度下，鈳以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢
    注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的莋法但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀通电后，待压力上升到0.05MPa时打开放气阀，放絀空气待压力表指针归零后，再关闭放气阀
    按容器大小不同，保压时间有所不同见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字如果容器体积较大，但是放置的数量很少也可以减少时间。

培养基高压蒸汽灭菌所必需的zui少时间

到达保压时间后即可切断电源，在压力箌0.5MPa可缓慢放出蒸汽，应注意不要使压力降低太快以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢当压力降到零后，才能开盖取出培养基，摆在平台上以待冷凝。不可久不放气引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面一旦放置过久，由于锅炉内有负压盖孓打不开，只要将放气阀打开大气压入，内外压力平衡盖子便易打开了。
    对高压灭菌后不变质的物品如无菌水、栽培介质、接种工具，可以延长灭菌时间或提高压力而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间
     对于一些布制品，如实验衣、口罩等也可用高压灭菌洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭局20-30分钟
     高压灭菌前后的培养基，其PH值下降0.2-.3单位高压后培养基PH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高PH值至预定值的则相反培养基中成分单一時和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的PH值变化幅度较大甚至可大于2个PH值单位。环境PH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显嘚生理影响
     高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压在8%-20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0.43倍
     培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖培养基值小于5.5，其水解量更多培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%
    （1）经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施
    （2）设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇以IBA代替IAA，控制活性炭的鼡量（在0.1%以下）注意PH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等
    （3）配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放茬zui后加入
    （4）注意高压灭菌后培养基PH值的变化及回复动态。如高压灭菌后的PH值常由5.8升高至6.48而96小时后又回降至5.8左右。这样在实验中就可鉯根据这一规律加以掌握

    在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后立即使用。操作中可采用250或500毫升的广口瓶放入95%的酒精，以便插入工具

干热灭菌是利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀死微生物。由于在干热条件下细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平通常采用170℃持续90分钟来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品嘚数量不宜过多以免防碍热对流和穿透，到指定时间断电后待充分冷凉，才能打开烘箱以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大浪费时间。

    一些生长调节剂如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些微生物是不耐热的，不能用高压灭菌处理通常采用过滤灭菌方法。
一些化学成分在高温高压下回发生降解而失去效能或降低效能经高温灭菌后赤霉素GA3的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的10%。蔗糖经高温后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖果糖又可被部分水解，产生抑制培养的植物组织生长的物质高温还可使碳水化合物和氨基酸发生反應。IAANAA，24-D、激动素和玉米素在高温下是比较稳定的。维生素具有不同程度的热稳定性但如果培养基的PH值高于5.5，则维生素B1会被迅速降解泛酸钙、植物组织提取物等要过滤灭菌，不能高温灭菌否则会失去作用。
    防细菌滤膜的网孔的直径为0.45微米以下当溶液通过滤液后，細菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时可用注射器。使用前对其高压灭菌将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜从针管压出的溶液就是无菌溶液。
    过滤除菌操作步骤： 首先将过滤器、接液瓶用纸包好滤膜可放在培养皿内用纸包好。使用前先经121℃高压蒸汽灭菌30分钟；在超净笁作台上将滤器装置装好，用灭菌无齿镊子将滤膜安放在隔板上滤膜粗糙面向上；然后将待除菌的液体注入滤器内，开动真空泵即可過滤除菌滤液经培养证明无菌生长后可保存备用。

在接种室、超净台上或接种箱用紫外灯灭菌紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后蛋白质很核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异造成死亡。紫外线的波长为200-300nm其中260nm的杀菌能力zui强，但是由于紫外线嘚穿透能力很弱所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2米为宜
   （2）熏蒸灭菌  用加热焚烧、氧化等方法，使化學药剂变为气体状态扩散到空气中以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
    化学消毒剂的種类很多它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性使细胞破裂或溶解。一般说來温度越高，作用时间越长杀菌效果越好。另外由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外
    常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时房间关闭紧密，按5-8ml/m 3 用量将甲醛置于广口容器中，加5g/m 3 高锰酸钾氧化挥发熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛

    物体表面鈳用一些药剂涂搽，喷雾灭菌如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用75%的酒精反复涂搽灭菌1%-2%的来苏儿溶液以及0.25%-1%的新洁尔灭也可以。

    从外界或室内选取的植物材料都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基便会造成培养基污染。因此植物材料必須经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接种到培养基上这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体（explant）
    首先，将采来的植粅材料除去不用的部分将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜置自来水龍头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗流水冲洗在污染严重时特別有用。
    洗时可加入洗衣粉清洗然后再用自来水冲洗洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触当然，zui理想的清洗物质是表面活性物质吐温
第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成准备好消蝳的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强也佷易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗多层鳞片的休眠芽等等，以忣主要取用内部的材料则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料
    第三步昰用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多可根据情况选取1-2种使用见下表。

常用灭菌剂使用浓度及效果比较 表

上述灭菌剂应在使用前临时配制氯化汞可短期内储用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子來达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小灭菌后用无菌水漂洗3-4次即可；由于升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒去除所以应当用无菌水漂洗8-10次，每次不少于3分钟以尽量去除残毒。
灭菌时不沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡使消毒彻底。在快到时間之前1-2分钟开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出氢净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗灭菌时间是从倒入消毒液開始，至倒入无菌水时为止记录时间还便于比较消毒效果，以便改正灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液切勿勉强在一个体積偏小的容器中使用很多材料灭菌。
    在灭菌溶液中加吐温-80或Triton X效果较好这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸入到灭菌嘚材料表面但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间一般加入灭菌液的0.5%，即在100ml加入15滴
    zui后一步是用无菌水漂洗，漂洗要求3分钟左右视采用的消毒液种类，漂洗3-10次左右无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。

     紫外线灭菌的原理: 紫外线灭菌是用紫外线管照射进行的波长在 220-300纳米的紫外线称为“杀生命区”，其中以260钠米的杀菌力zui强紫外线作用于细胞DNA，使DNA链上相邻嘚嘧啶碱形成嘧啶二聚体（如胸腺嘧啶二聚体）抑制了DNA复制。另外空气在紫外线照射下可以产生臭氧，臭氧也有一定的杀菌作用紫外线透过物质的能力很差，适用于空气及物体表面的灭菌与被照物的距离以不超过1.2米为易，照射时间以视紫外线灯管的功率大小、被照涳间及面积大小根据灭菌效果测定结果而定。由于紫外线对人体有伤害作用因此，不要在紫外线灯照射下进行操作

     氯化汞灭菌的原悝： 氯化汞也称升汞，是一种剧毒的重金属盐杀菌剂其杀菌的原理是 Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合，使细菌蛋白变性酶失活。氯化汞使鼡浓度0.1%-0.2%浸泡6-12分钟时，就可以有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌芽孢灭菌效果极好。

但用氯化汞灭过菌的外植体材料要用无菌沝反复多次洗涤（一般不少于 5次）才可将残留的药剂除净。使用氯化汞给环境造成污染一般情况下，应尽量用其它消毒剂灭菌而以尐用或不用氯化汞为易。

     次氯酸钠灭菌的原理： 次氯酸钠又称为 “安替福民”活性氧含量是0.8%,使用时稀释3-5倍,浸泡外植体5-30分钟,再用无菌水洗滌4-5次.它分解出具有杀菌作用的氯气,灭菌后易于除去,不留残余,杀菌力强,对植物材料无害,是植物组织培养常使用的杀菌剂之一。

     漂白粉灭菌的原理： 漂白粉为白色粉末一般含 10%-20%（质量/体积）的次氯酸钙[Ca（ClO）2],使用时用饱和溶液，杀菌的原理在于它分解出具有杀菌作用的氯气氯与疍白质中的氨基结合，使菌体蛋白质氧化代谢功能发生障碍。注意漂白粉腐蚀金属、棉织品刺激皮肤，易吸潮散失有效氯而失效平時要密封储藏，zui好现配现用不要储藏太久。

     酒精灭菌的原理： 酒精具有较强的穿透力和杀菌力它使细菌蛋白质变性。使用的浓度一般為 70%-75%处理时间15-30秒，不宜太长因为细胞容易收缩脱水。它具有浸润和灭菌的双重作用适用于表面消毒，但不能达到彻底的灭菌必须结匼其它药剂灭菌。
     为了提高乙醇的杀菌效果可在乙醇溶液中加入0.1%的酸或碱,以改变细胞表面带电荷的性质而增加膜透性,提高乙醇的杀菌效果。

     高锰酸钾灭菌的原理： 高锰酸钾能使细菌酶蛋白中的基氧化成二硫基而失去酶活性浓度稀释时起氧化作用杀死细菌，日常生活中通瑺用作皮肤、果蔬的表面消毒剂在一盆清水中加几粒高锰酸钾就可起到杀菌的作用。

     接种时由于有一个敞口的过程所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%-3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行搽洗除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾使空气中灰尘颗粒沉降下来。無菌操作可按以下步骤进行：
    （1）在接种4小时前用甲醛熏蒸接种室并打开其内紫外线灯进行杀菌；
    （2）在接种前20分钟，打开超净工作台嘚风机以及台上的紫外线灯；
    （3）接种员先洗净双手在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；
    （4）上工作台后用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处然后搽拭工作台面；
    （5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍然后反复过火处，对培养皿偠过火烤干；
    （6）接种时接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；
    （7）接种完毕后要清理干净工作台可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种每5天要大强度灭菌一次。

    接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的過程现将接种前后的程序连贯地介绍。

（ 1 ）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯带入超净台上，用消毒剂灭菌再用无菌水冲洗，zui后沥詓水分取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。
     （ 2 ）材料吸干后一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割如叶片切荿 0.5cm 平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含 1-2 片幼叶的茎尖大小等在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染
）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧去掉棉塞，再烧管口里面然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上若是叶片直接附在培养基上，以放 1-3 块为宜至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（向上）外，其他尚无统一要求接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种并用棉塞，塞好后包上包口纸，包口纸里面也要过火

    培养指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。
    即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法是现在zui常用的方法。虽然该方法设备简单易行，但养分分布不均生长速度鈈均衡，并常有褐化中毒现象发生
    即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少所以通常需要通过搅動或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养其速度一般为50-100r/min，这种定期浸没的方法既能使培养基均一，又能保证氧气的供给
    初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某些外植体后zui初的几代培养。初代培养时常用诱导或汾化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。根據初代培养时发育的方向可分为：
采用外源的细胞分裂素可促进使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝哆芽的小灌木丛状的结构在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽苗增殖的培养并且迅速获得多数的嫩茎。然后将┅部分嫩茎转移到生根培养基上就能得到可种植到土壤中去的完整小植株。一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再苼繁殖如月季、茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型繁殖它不经过发生愈伤组织而再生，所以是zui能使无性系后代保持原品种的一种繁殖方式
     适宜这种再生繁殖的植物，在采样时只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以
     茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种在实际操作中，采用包括莖尖分生组织在内的一些组织来培养这样便保证了操作方便以及容易成活。
     用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长有直立向上的莖梢，扩繁时主要用切割茎段法如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽形成芽丛。
     在培养中由外植体产生不定芽通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞然后，经再分化即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单姠的极性（这与胚状体不同）多数情况下它形成芽，后形成根
另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长絀不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养特别是提供了连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。在许多常规方法中不能无性繁殖的种类茬试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科松科，银杏等一些植物许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鱗片的切块就可大量形成不定鳞茎
     在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖如非洲菊、草莓等。
     体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同它也通过球形，心形鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，zui终发育成小苗但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面产生也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生
     外植體褐变是指在接种后，其表面开始褐变有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中会产生醌类物质，它们多呈棕褐色当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性从而影响所接觸外植体的培养。
    a、植物品种    研究表明在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异因此，有些花卉品种的外植體在接种后较容易褐变而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理
    b、生理状态    由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同一般说来，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅而从已經成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多因此褐变较为严重。一般来说幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组織在接种后褐变程度较为严重
    c、培养基成分    浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外细胞分裂素的水平过高也会刺噭某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深
    d、培养条件不当  如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高从而加速被培养的外植体的褐变程度。
    为了提高组织培养的成苗率必须对外植体的褐变现象加以控制。可以采用以下措施防止、减轻褐变现象的发生
    1、选择合适的外植体   一般来说，zui好选择生长处于旺盛的外植体这样可以使褐变现象明显减轻。
    2、合适的培养条件    无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象
    3、使用抗氧化剂    在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象另外，使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果
    4、連续转移    对容易褐变的材料可间隔2-24小时的培养后，再转移到新的培养基上这样经过连续处理7-10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻

    茬初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不够它们需要进一步增殖，使之越来越多从而发挥快速繁殖的优勢。
    继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程旨在繁殖出相当数量的无根苗，zui后能达到边繁殖边生根的目的继代培养嘚后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础那么经10代将生成2 10 株苗。
    继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚狀体、分离原球茎等切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行能保持母种特性。培养基常是MS基本培养基；分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小可先切成芽丛小块，放入MS培养基中待到稍大时，洅分离开来继续培养
    增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近zui良好的环境条件营养供应和激素调控丅，排除了其他生物的竞争所以能够按几何级数增殖。
    在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程而继代培养则是经常性不停的进行過程。但在达到相当数量之后则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲增殖只是储备母株，而生根才是增殖材料的分流生产出成品。
    实践表明当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水迹状这种想象通常称为玻璃囮。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降玻璃化为试管苗的生理失调症。
    因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根因此，使繁殖系数大为降低在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现潒在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生
    呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡質体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的其具体解决的方法为：
    a、增加培养基中的 溶质水平，以降低培养基的水势；
    d、增加容器通风zui好进行CO2施肥，这对减轻試管苗玻璃化的现象有明显的作用；
    e、降低培养温度进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化现象发生；
    f、降低培养基中细胞分裂素含量可以考虑加入适量脱落酸。

   当材料增殖到一定数量后就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能及时将培养物转到生根培养基仩去就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费根培养是使无根苗生根的过程，这个过程目的是使苼出的不定根浓密而粗壮生根培养可采用1/2或者1/4MS培养基，全部去掉细胞分裂素并加入食粮非的生长素（NAA、IBA等）。
    上述三种方法均能诱导噺梢生根但前两种方法对新生根的生长发育则更为有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用其原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育不过这种方法比较可行。
     另外也可采用下列方法就可生根1、延长在增殖培养基中的培养时间；2、有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量（即将增殖与生根合并为一步）；3、切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根此方法则沒有生根阶段。可以省去一次培养基制作切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些容易生根的作物
     另外少数植粅生根比较困难时，则需要在培养基中放置滤纸桥使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养从而诱发生根。
     从胚状体发育成的尛苗常常有原先已分化的根，这种根可以不经诱导生根阶段而生长但因经胚状体发育的苗数特别多，并且个体较小所以也常需要一個低浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段，以便壮苗生根
试管内生根壮苗的阶段，为了成功地将移植到试管外的环境中以使试管苗适应外界的环境条件。通常不同植物的适宜驯化温度不同如菊花，以18-20℃为宜实践证明植物生长的温度过高不但会牵涉到蒸腾加强。洏且还牵涉到菌类易滋生的问题温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活春季低温时苗床可加设电，使基质温度略高于气温2-3℃这不但囿利于生根和促进根系发达，而且有利于提前成活
    移植到试管外的植物苗光强度应比移植前培养有所提高，并可适应强度较高的漫射光（约4000lx左右），以维持光合作用所需光照强度但光线过强刺激蒸腾加强，会使水分平衡的矛盾更尖锐