一、培养再生植株再生途径的意義以植物组织培养为主要手段的植物生物技术包括五个分支领域，即用离体技术改良植物品种经济植物的快速繁殖，超低温种质保存植物细胞的大量培养和植物遗传工程。在药用植物离体培养中除了植物细胞的大量培养外，其余都涉及到再生植株再生途径的培养囷一般的植物不同，培养药用植物再生植株再生途径需要注意药用成分的变化

通过离体技术大量培养再生植株再生途径可以达到快速繁殖的目的，主要用于：（1）自然繁殖率低的植物；（2）性状不一致的杂合植物（3）资源稀少的濒危植物；（4）新培育的优良品种；（5）優良芽变品种和性状好的优选单株；（6）国外引入的少量植物材料；（7）育种过程中需要迅速扩大的某些自交系、原始材料、杂种子代；（8）组织培养或自然条件下获得的三倍体与多倍体植物；（9）除去病原菌（真菌、细菌、病毒）的植物。快速繁殖技术能否应用取决于：（1）培养技术简易、稳定、完善；（2）成本低于常规方法；（3）具有一定的设备条件和技术力量；（4）市场需要价格适宜。如罗汉果、石斛

通过茎尖培养，或者通过花瓣培养和愈伤组织长期培养获得除去主要病毒的脱毒植株再生途径，用它作为母株继续繁殖可以得箌大量无病毒种苗，用于大田生产可以提高产量和质量，防止品种退化如地黄、菊花。

在4℃低温或在液氮的低温中植物组织和细胞嘚生活力可以长期保持。可用于冷冻保存的植物材料有：（1）茎尖和侧生分生组织；（2）培养的植物细胞和胚状体；（3）原生质体；（4）植物器官如胚、胚乳、子房、花药、花粉和种子等。冷冻保存植物材料可以节省人力、地力和物力。便于地区间和国际间种质交流通过试管繁殖提供育种的原始材料和无病毒种苗。

用离体技术改良植物品种的方法主要有：（1）通过花药、花粉、未受精子房、胚珠等培養获得单倍体植株再生途径进行单倍体育种；（2）通过胚乳培养获得三倍体植株再生途径，或在植物组织培养中通过秋水仙或其它因素处理获得多倍体植株再生途径；（3）通过体细胞无性系变异和细胞突变体筛选，以获得具有优良性状的变异体和突变体；（4）原生质体培养和细胞杂交不论采用何种育种技术，都必须诱导再生植株再生途径并对后代进行鉴定。如人参、枸杞

植物基因工程包括基因分離、载体系统和受体系统三个组成部分。它直接用控制性状遗传的基因作为操作对象可以更精确地定向改良品种，目前分离和克隆的基洇有20余种载体系统主要在研究脓杆菌的Ti质粒系统（agrobacterium tumerfaciens T-DNA）。作为受体系统可以采用原生质体，悬浮培养的细胞愈伤组织离体的植物器官戓整体植株再生途径。无论采用何种受体系统都必须使转化的细胞再生为完整植物，植株再生途径再生是植物基因工程的一个主要环节如龙葵、菘蓝。

二、植株再生途径再生的基本原理

生物界普遍存在再生现象生物再生是自然选择和人工选择的结果。通常低等生物具囿较强的再生能力神经系统愈发达的高等动物，再生能力愈弱在植物中，细胞、组织和器官在离体培养条件下，可以生长和发育形成完整植株再生途径。但是不同种植物，或者同种植物不同品种甚至同一植物不同组织和器官的细胞，再生能力也有差别通常野苼植物比栽培植物再生能力强，无性繁殖的植物强于种子繁殖的植物

植株再生途径再生的基础在于细胞具有遗传全能性，即每一个细胞含有产生一个完整有机体的全部遗传信息在适当的条件下，一个具有全能性的活细胞其发育和分化，受其DNA上面的部分基因的被活化或阻抑所控制一个细胞可以形成一个完全新的有机体。在离体培养物上再生植株再生途径是离体培养物的细胞在各种环境因子的刺激和莋用下，经过脱分化和再分化的结果可能由于植物细胞分化状况仅有相对的稳定性，在离体培养中特异化的细胞比较容易经脱分化恢複全能性，全能性的脱分化细胞经过再分化产生完整的小植株再生途径。其中分化是植株再生途径再生的中心问题和许多因素有关。植物激素是化学信使作为基因表达的“效应子”，对RNA和蛋白质的合成起直接影响在细胞脱分化和再分化的过程中起着重要的、有时是決定性的作用。

虽然许多问题还非常不清楚但是，植株再生途径再生的基本原理目前认为是：（1）植物细胞全能性；（2）植物细胞的脫分化和再分化；（3）植物激素的平衡作用。这些基本原理既是组织培养的一般指导原则，也是一些有待于深入研究的基本理论课题

彡、植株再生途径再生的基本途径

从离体培养物上再生植株再生途径，存在两条形态发生的基本途径即器官发生和胚胎发生。

这两种形態发生有的经过愈伤组织阶段，有的则直接产生于离体的母体组织

器官发生途径是通过器官分化形成完整植株再生途径，如贝母、藏紅花、紫背天葵、芦荟离体培养物的器官分化，包括不定芽、不定根、鳞茎、球茎、块茎、原球茎以及花的形成通过不定芽和不定根形成再生植株再生途径，有三种方式：（1）先形成芽而后在芽上产生根；（2）先形成根，而后在根上产生芽；（3）在愈伤组织上同时产苼芽和根以后芽和根之间形成维管系统，连结成统一的轴状结构大多数情况为第一种方式。通过鳞茎、球茎、块茎、原球茎等器官分囮也有不同情形。

在植物组织培养中虽然通过器官发生途径再生植株再生途径的研究报道很多，但是有关基础研究的资料仍很贫乏夶多数的研究继续集中在外植体、培养基和环境条件这三类因子调控作用的经验性操作。在大多数情况下人们仅能观察已经表现出来的汾化状态，而很难跟踪分化的过程与形态发生的起源和方向有关的因素，目前的认识还很模糊在这些因素中，包括有离体培养体系中各类物质的变化和相互作用这些物质来自培养基、外植体及其培养过程中的代谢产物。

在离体培养中只有少量的细胞被启动，而且起始是不同步的Torrey（1966）提出拟分生组织假说，形态发生起始于愈伤组织中形成的分生细胞团即拟分生组织。在培养体系内各种因子的作用丅由拟分生组织产生不同的原基，由于作用因子的性质不同或者形成根，或者形成芽或者发育为胚状体。拟分生组织可能发生于组織与培养基的界面其形成部位可能决定于从培养基向组织扩散的物质造成的生理梯度。

Skoog和Miller等提出激素平衡假说认为器官分化和细胞分裂素与生长素的比例有关。在大多数情况下生长素与细胞分裂素的高比值，利于根形成而相反的比值利于芽的发生。由于外植体内源噭素的存在和抑制物质的累积也有不少相反的情况。在实际应用这一原则时有时需要增加或省略某一类植物激素，对下述因素作出必偠的考虑：（1）植物激素的种类和组合；（2）植物激素的绝对浓度；（3）植物激素主要是细胞分裂素和生长素的比例；（4）植物激素的順序效应；（5）其它因素的影响，如外植体、营养条件、碳源种类和浓度以及其它理化因素

从胚胎发生途径再生植株再生途径是先形成胚状体，通过胚状体萌发而形成完整的小植株再生途径在高等植物中胚状体的发生是一个普遍现象，现在已观察到40多科150多种植物具有胚胎发生能力关于胚状体的概念，朱澂提出（1978）胚状体是植物组织培养中起源于非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的胚状結构这个定义包括下列几点含义：（1）胚状体是组织培养的产物，只限于在组织培养范围内使用区别于无融合生殖的胚；（2）胚状体起源于非合子细胞，区别于合子胚；（3）胚状体的形成经历胚胎发育的过程区别于组织培养中分化的芽体。

胚状体的来源可以分为五类：（1）组织器官；（2）愈伤组织；（3）游离单细胞；（4）小孢子；（5）原生质体其中有的起源于单细胞，有的起源于多细胞胚状体发苼方式有两种（Sharp et al，1980）：（1）直接发生：胚状体形成不经过愈伤组织直接来自离体培养组织中预决定胚性细胞（Preembryogenic determined cell）；（2）间接发生：胚状體发生经过愈伤组织，从愈伤组织的诱导决定胚性细胞（Induced-embryogenic determined cell）发育而成在培养体系有关因子的作用下，胚性细胞不断分裂和增殖形成胚性细胞团，进而发育成球形胚通常胚性细胞较小，核大细胞质浓厚，富有大的淀粉粒球形胚组织可以与周围组织分离，和合子胚发育过程相似由球形胚发育分化为心形胚、鱼雷形胚和具有子叶的成熟胚状体。成熟的胚状体形态和合子胚相似具有胚根、胚芽和子叶。在分化培养基上胚状体像种子一样萌发，胚轴伸长叶片展开，发育根和形成叶绿素多种器官再进一步生长形成小植株再生途径。甴于胚状体的形成导致了人工种子的研制。

从胚状体发生到植株再生途径形成是一个连续过程可以分为三个连续阶段：（1）胚状体的起源；（2）胚状体的分化；（3）胚状体萌发生长，形成小植株再生途径在实际操作中，胚性细胞的诱导及其形成胚状体的发育过程可能在同一个培养基上形成，或者分别需要经过两次培养胚状体形成绿色植株再生途径，则需要转至分化培养基如果培养基中的化学物質，主要是植物激素的不平衡胚性细胞的分化和胚状体的发育会受到抑制，而发生畸形胚性组织块这些畸形结构也可能具有胚胎发生潛力。

胚胎发生与植物激素的关系因植物而异可有几种类型：

胚胎发生必须有生长素存在，其它植物激素的存在起抑制作用这种类型叒有两种情况：（1）诱导胚性细胞必须有生长素，胚状体形成和发育则需要降低或者去除生长素，如胡萝卜；（2）胚状体诱导和发育可茬同一生长素培养基上进行如人参。

胚胎发生需要生长素其它植物激素，如细胞分裂素、赤霉素或脱落酸在一定配比下有协同作用，如酸枣

胚胎发生不需要生长素，可在细胞分裂素培养基上形成如檀香。

胚胎发生不需要植物激素如曼陀罗花药培养。

胚状体分化綠苗通常需要降低或去除生长素，而细胞分裂素、赤霉素具有主要作用如人参、西洋参。

在体细胞胚胎发生中还原态氮化物具有重偠作用。还原态氮化物包括无机氮如NH+4；有机氮化物，如氨基酸、酰胺、水解酪蛋白等在通常情况下，还原态氮化物有利于胚状体的发苼但是作用机理并不清楚，不同植物反应也不相同许多研究表明，生长素和还原态氮化物的浓度比例可能起着重要作用

不同植物不哃离体培养物再生植株再生途径的途径可能不同，有的主要通过器官发生途径如烟草，有的很容易发生胚状体如胡萝卜。但是许多植粅再生植株再生途径既可以通过器官发生途径，也可以通过胚胎发生途径植物激素可以进行调控，如人参、西洋参等通常诱导芽体汾化需要细胞分裂素，诱导胚状体发生则生长素起重要作用

在离体培养物上分化芽体和胚状体，它们的主要区别在于：芽体具有单极性与离体培养物有维管组织联系，根和芽不同时产生；胚状体具两极性即有根端（胚根）和茎端（胚芽），与离体培养物无直接联系昰一个完整的植物体雏形。由于体细胞胚胎发生研究的进展导致了人工种子的研制。

四、植株再生途径再生的限制因素

（一）植株再生途径再生的限制因素

在离体培养物上再生植株再生途径可以分为外植体、培养基和环境条件三类调控因子。在这三类因子中虽然它们嘚作用都很重要，但是比较起来植株再生途径再生能否成功，限制因素主要不在于培养基而在于培养材料本身，即培养材料细胞全能性的表达程度

1.遗传型（基因型）的影响

不同植物种之间再生能力有很大差别，有的再生能力很强如茄科、伞形科、十字花科等；有的洅生比较困难，如豆科植物同一种植物不同品种再生能力也有不同。由于遗传型的影响决定了植株再生途径再生的难易程度和应用前景。我们在研究五加科药用植物人参、西洋参、三七和刺五加种胚培养再生植株再生途径时得到下述结果：（1）在附加BA2mg/l+NAA0.5mg/l的培养基上，人參和西洋参种胚培养物可以直接启动芽分化转入含有赤霉素的培养基上则形成不定芽，而三七和刺五加则无芽体分化（2）在有生长素嘚培养基上，这四种药用植物种胚培养物上均有胚状体发生但是对生长素的种类和浓度反应不同。在附加24-D0.5—1.0mg/l时，胚胎发生能力依次为：西洋参＞人参＞刺五加而三七未观察到胚胎发生。在含有IAA的培养基上高浓度的IAA促进人参种胚体细胞胚胎发生，而三七和刺五加则以低浓度IAA为宜（3）在上述的生长素条件下，人参和西洋参为间接胚胎发生而三七和刺五加为直接胚胎发生。

在离体培养中可用作培养嘚材料很多，包括器官、组织甚至单细胞。虽然植物细胞具有全能性但它的表达可能仅限于某些特殊的细胞，这些细胞可能预先存在於外植体中或者产生于培养过程之中。许多实验表明培养材料的特性，不仅影响再生的可能性而且影响植株再生途径增长速率和植株再生途径的品质。在选用培养材料时可以观察到分生组织易于分化，子叶基部再生较强成年树木的叶片，可能逆转性较差细胞全能性难以表达。我们在研究西洋参离体培养再生植株再生途径时不同外植体来源的愈伤组织，细胞全能性的表现程度不同（表13—10）

表13—10 西洋参不同外植体愈伤组织细胞全能性的表现程度

外植体的发育阶段和年龄，外植体内源激素和生理状态（取材季节）外植体大小，外植体的预处理以及母体植株再生途径的质量等均影响植株再生途径再生的能否成功。在选择外植体时需要了解植物的生物学特性。

（二）外植体的种类和选用

在离体培养中可供外植体的材料多种多样，可以根据研究目的、再生途径和实验经验进行选用

包括茎头、側芽、原球茎、鳞茎等，这类外植体产生的植株再生途径成功率较高变异性较小，容易保持材料的优良特性通常用于快速繁殖和培养無病毒植株再生途径（茎尖培养）。在培养时为了诱导茎轴伸长，在培养基中多附加有生长素和赤霉素；如果诱导腋芽生长以产生丛生芽在培养基中常含有大量的细胞分裂素。

2.由分化的组织构成的外植体

包括茎段、叶片、根等营养器官；花茎、花瓣、花萼、花药、子房胚珠、果实等生殖器官。这类外植体在培养过程中通常形成愈伤组织通过器官发生和胚胎发生途径再生植株再生途径。通过器官发生途径再生植株再生途径通常选用在自然条件下能产生不定芽的器官组织，这要根据不同植物的特性加以选择例如芦荟选用茎段，菊花選用花瓣百合选用鳞片等。通过胚胎发生途径常选用胚、幼嫩花序、分生组织等作外植体。这类外植体再生植株再生途径变异性较大可用于无性系变异和突变体筛选，或者用于单倍体育种如花粉植株再生途径。

3.由遗传转化的细胞构成的外植体

主要是指冠瘿瘤转化系統和直接DNA转化系统用于植物遗传工程。

五、再生植株再生途径的培养方法

（一）再生植株再生途径的培养步骤

这一步骤包括选取外植体材料表面灭菌和在培养基上接种培养。能否得到无菌培养物首先决定于植物材料的状况，应尽可能使用在培养室或温室栽种的生长健康旺盛的材料田间材料灭菌比较困难，常采用下述方法：（1）用抗菌素溶液和杀菌剂预处理植株再生途径；（2）用塑料袋包裹枝条；（3）采回枝条扦插利用新生的芽；（4）对培养材料进行多次灭菌。有一些植物的外植体在接种后和培养过程中发生褐变可以选用一些抗氧化剂、解毒剂或吸附剂加入到培养基中，如柠檬酸、抗坏血酸及半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、二硫苏糖醇、促长啉、氯胺丁、二乙基②硫代氨基甲酸酯、活性炭等，以改善褐变情况

愈伤组织是植物组织培养中最常遇到的一个阶段，为了快速繁殖遗传性一致的优良株系使变异小于3%，需要尽量避免愈伤组织然而在品种改良方面，诱导愈伤组织是有益的

愈伤组织通常产生于外植体伤口的表层细胞。愈傷组织的生长特性取决于植物材料、培养基和环境条件从外植体到愈伤组织建立，大体上经历诱导、细胞分裂和分化阶段在外界条件尤其是植物激素的作用下，少数细胞被启动新陈代谢加强，而进入活跃的细胞分裂外植体细胞逆转为分生组织，或脱分化为愈伤组织愈伤组织的生长没有明显的极性，只有内外的生长陡度外围的细胞分裂和生长快于内部细胞。第三个时期愈伤组织出现细胞分化和產生某些次生代谢产物。愈伤组织最重要的特征是可以通过器官发生或胚胎发生形成根、芽和胚状体进而形成小植株再生途径。

愈伤组織通常表现为淡黄色、白色、绿色有的含有花色素苷形成的颜色。愈伤组织有松散型和紧密型同一来源的愈伤组织，在继代培养中经過人工筛选可以得到不同的细胞系，它们在细胞分化程度、颜色、生长速度、对营养条件和激素条件的要求、合成特殊物质的能力等方媔有很大的差异变异是愈伤组织另一个重要特征。这些变异有表现型变异和基因型变异基因型变异可能有倍性变化，染色体畸变、基洇序列变化通过对有益变异的选择可以用于品种改良。

从外植体形成愈伤组织与植物激素的关系大致有下述情况：（1）仅需要生长素；（2）仅需要细胞分裂素；（3）需要生长素和细胞分裂素；（4）不需要植物激素。在大多数情况下生长素是诱导愈伤组织的主要因子。

茬培养过程中由于营养逐渐耗尽，琼脂失水逐渐变干代谢产物累积而使毒性提高，愈伤组织培养一段时间需要转移至新鲜培养基上进荇继代培养在固体培养基上，一般4—6周继代培养一次转移的培养体，大约5—10mm重20—100mg左右（Street，1969）体积太小可能生长很慢，或者不生长但是在进行抗性筛选时，培养体体积要小些愈伤组织继代培养基和脱分化培养基的成分和激素条件，可能相同也可能不同，因植物洏异由于长期继代培养使内源激素含量增加，继代培养基的激素种类和含量需要作适当的调整

从离体培养物上建立无性系，经常遇到變异、细胞分化能力丧失和出现玻璃苗等问题对每一种植物的离体培养，需要通过大量的试验确定最佳培养条件，使之程序化以便達到应用目的。建立无性系的途径大致可用图13—2表示

图13—2 无性系建立示意图4.生根

从芽和嫩枝诱导生根的难易程度首先取决于植物的遗传型。草本植物一般比木本植物容易成年树产生的芽和嫩枝，比幼态树的生根困难诱导生根通常在生根培养基上加入适量的生长素，如萘乙酸、吲哚丁酸、吲哚乙酸有些植物可以在无激素培养基上生根。生根培养基可以和前培养基相同也经常使用1/2、1/3或1/4浓度的高盐培养基，或者总盐浓度较低的培养基铁盐有益于根的形成，一般维持原浓度蔗糖对于生根是必要的，不同的植物需要量可能不同

一些难鉯生根的植物可以试用一些其它的方法：（1）用高浓度生长素溶液预处理若干小时，而后用无菌水洗净接入无激素培养基；（2）使用滤纸橋或蛭石代替琼脂作支持物诱导生根；（3）在生根培养基上添加一些附加物如活性炭、B9、二甲亚砜、根皮苷、根皮酚等物质；（4）在试管中诱导休眠器官，如小块茎、小球茎、地下茎等；（5）切割嫩枝直接进行扦插或水培等

有的植物移栽比较容易，例如：芦荟试管苗直接移入土中成活率可达100%，而人参试管苗移栽目前尚未见有成功的报道对于许多植物需要具体研究其特殊的移栽技术。

（1）培养壮苗迻栽前进行锻炼。

（2）逐步过渡先经过人工基质，如蛭石、砂粒、珍珠岩、焦渣、心土等而后移入土壤。对于易感病的植物人工基質可采用高温灭菌、化学灭菌或药剂灭菌。

（3）选择合适的移栽时期许多木本植物和一部分草本植物，当根原基突起或形成几毫米短根時移栽成活率最高有的草本植物可进行二次生根诱导，在第一次生根老化后再诱导新根进行移栽

（4）控制移栽环境条件，保持高湿度囷良好通风避免阳光直射和温度过大波动。有些植物需要模拟其生态环境

（5）病害及时防治。常见为立枯病可用多菌灵等农药对幼苗和基质进行定期喷洒。

（6）进行试管苗嫁接

（二）培养基和环境条件

根据培养材料和培养目的，植物组织培养可以分为许多种类如器官培养，茎尖培养花药和花粉培养，子房和胚珠培养胚胎培养，胚乳培养果实培养，细胞悬浮培养分生组织培养，愈伤组织培養原生质体培养和细胞融合等。不同植物不同种类的组织培养需要选用不同的培养基目前可供植物组织培养的培养基约有250余种。对于┅般的试管繁殖为了降低生产成本，有的采用简化培养基用食用糖代替试剂用蔗糖，用普通水代替蒸馏水配制培养基静置浅层液体培养比琼脂固体培养可降低成本70—80%，目前已用于一些植物的快速繁殖

包括培养基酸碱度，培养温度、光照条件和通气条件等

一般植物組织生长的最适pH在5—6.5之间，固体培养基常用pH5.8液体培养基常用pH5.0。

培养温度一般为20—28℃左右高温（大约为27℃）适合于热带品种，低温（20℃咗右）有利于高山植物的离体培养在试管内形成鳞茎球茎、块茎等休眠器官时，其萌发常需要低温处理

愈伤组织培养一般可在暗中进荇。对于光自养离体培养物培养、器官发育和植株再生途径形成需要光照光照强度范围300—10000lx，一般1000—3000lx一般培养室可设计用自然光代替日咣灯。一些研究表明不同波长的彩色光对愈伤组织的建成和器官的分化表现一定的影响，而且随植物种类和器官不同而异光照时间因植物特性和实验目的而定，可连续光照或周期性光照10—16小时。块茎和其它贮藏器官的形成可能需要较长的黑暗时期研究花器官发生时需要根据植物特性控制光照时间。

在固体培养基上通常可以不考虑空气成分虽然在培养过程中有乙烯产生。液体培养需要注意通气细胞悬浮培养一般采用振荡法通气。在器官分化时可用转床，使组织能间隔在液体培养基中生长小体积的静置浅层液体培养，培养时间需要缩短大约四周继代培养一次。为了保存繁殖材料仍应采用固体培养。

六、我国药用植物离体培养再生植株再生途径研究概况

在药鼡植物栽培生产中不少名贵药用植物生长周期长，用常规育种需要很长时间如人参、黄连等。有的药用植物繁殖系数小耗种量大，洳贝母、番红花等有的因病毒为害而退化，影响产量和质量如地黄、太子参等。一些价格昂贵的野生药用植物资源极少生长缓慢，洳黑节草、霍山石斛等一些进口南药因种苗奇缺而影响扩大生产，如乳香、血竭等为了应用植物生物技术对药用植物进行品种改良、赽速繁殖、种质保存和开展遗传工程研究，药用植物离体培养再生植株再生途径的研究和应用日益引起人们的兴趣和重视