无菌制剂成品密封系统 完好性验證——微生物侵入试验 黑龙江省食品药品监督管理局 药品安全监管处 谭宏宇 主要内容 定义和目的 适用范围 试验方法 结果评价 贮存稳定性 恶劣条件下的成品密封性验证 生产中的在线检漏 一、概述 微生物侵入试验是对最终灭菌容器的密封件系统 完好性的挑战性试验目的是考察並确认容器密 封系统的完好性。 二、适用范围 本验证适用于无菌制剂生产中使用的输液瓶、西林瓶等需用多组件完成密封的容器完好性测試 三、试验方法 在验证试验中，取输液瓶或西林瓶灌入培养基，在正常生产线上压塞、压盖灭菌此后，将容器密封面浸入高浓度运動性菌液中取出、培养并检查是否有微生物侵入。 （一）试验样品的制备 1.在生产线上取足够量的容器灌装SCDM/2（大豆 胰蛋白胨肉汤）培养基，使用自动压塞和压盖设 备将容器密封； 2.将灌装后的容器经最长灭菌程序灭菌121℃、 30′； 3.取出、放冷，将每一试样倒转使培养基与瓶ロ充分接触，在30～35℃下倒置培养14天; 4.选50个试样小心去除铝盖,注意不要破坏其密封口将去铝盖时不慎损坏窗口密封性的所有试样剔除。按上述3中要求培养样品在培养期内，当试验中发现任何带盖试样长菌时,则试验无效,须弃去全部试样重新从头开始试验。 （二）确认培养基促菌生长能力—营养性试验 1.接种 所有试样培养14天均不长菌时随机取20个带盖试样每个试样内接种0.1ml的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 9027,菌液浓度10～100CFU/0.1ml。 试验菌選择原则： （1）所选菌种的体积大小越小越好。 （2）运动能力强 （3）适宜的培养基。 2.培养 在30～35℃下培养7天或培养至所有试样 都呈阳性结果。 3.判定 若7天内所有接种铜绿假单胞菌的试样中，微生物生长良好则容器内培养基的促菌生长能力可判为合格。 使用革兰染色和紫外灯下肉汤呈蓝绿色荧光的性质来鉴定并确认试样容器内生长的菌为接入的铜绿假单胞菌。 （三）挑战菌悬浮液的制备 1.从铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 9027的新鲜斜面上取一整环培养物分别接入 含lOml 无菌培养基的试管中，在30～35℃下 培养16～18h 2.将每管的培养物分别转入含1000ml 相同培养 基(SCDM／2)的容器内，于30～35℃下培养 22～24h在培养结束时，能明显见容器内培 养基出现浑浊 3.培养结束后的菌悬液即可用来作容器／密封系 统完好性试验。 （四）微生物侵入试验操作步骤 本试验须在生物安全柜内或其他不影响生产环境的地方进行 1.将新鲜的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 9027 的菌悬液倒入合适的盆中，用金属丝架固定试样容器使试倒置在菌悬液中。 2.将50个经最长灭菌程序灭菌的试样倒置并浸入菌悬液中。该组试样为A 组 试样容器内嘚无菌培养基应充分接触封口内表面，样品的颈部及封口的外表面应完全浸泡在菌悬液中见图4－54。 3.同时将25个去铝盖的试样容器倒置入菌懸液中 该组试样为B组。 4.实验开始时取一份菌悬液平板计数每毫升所含的活菌数。按2.3.1 确认试验用微生物是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 5.将A组和B组试样嫆器在菌悬液中持续浸泡约4h。 6.浸泡结束时再用平板计数菌悬液的浓度。 7.从菌悬液中取出试样擦干试样容器外残余的菌悬液，然后用含0.5％过乙酸的 70％异丙醇消毒容器外表面 8.取装满培养基有铝盖和去铝盖的样品各两个，作阳性对照阳性对照用样品制备方法同试样，但不經菌悬液浸泡其外表用含0.5％过乙酸的70％异丙醇消毒。此后接种入10～I00CFU铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 9027，按步骤2进行培养基的营养试验 9.将消毒后的容器放茬塑料袋中，置30～35℃培养7天操作中应特别注意不要损坏B组无铝盖试样胶塞的密封性。 10.挑战试验用菌悬液经灭菌后丢弃 11.将挑战试验用的試样培养7天，观察检查试样容器内培养基中微生物的生长情况 （1）对每一试样进行观察检查，有生长记作+无生长计作－。 （2）如果试樣容器长菌按2.3.1 方法确认生长菌是挑战微生物——铜绿假单胞菌。 （3）如果所有容器都不长菌则从浸过菌悬液的A 组取10 个试样，B 组5个试样分别按2．进行培养基的营养检查。 四、结果评价 （一） 步骤三.（二）.2、步骤三.（四）.8、