【摘要】目的对一颗粒状角膜营養不良怎么改善(GCD)家系进行BIGH3基因突变筛查,以确定其致病基因方法收集一常染色体显性遗传的GCD家系,提取该家系患者及正常者的DNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增BIGH3基因的目的片段,纯化后直接测序,用DNAStar软件分析测序结果,检测其BIGH3基因突变的类型。结果该家系患者均检测出第4外显子的R124H突变(CGC>CAC),而家系Φ的正常者及50例正常对照者的BIGH3基因中均未发现该突变家系成员都检测出第11、12外显子的同义单核苷酸多态性(SNP)。通过基因检测,确定该家系角膜营养不良怎么改善的分型,即为GCDⅡ型,又称Avellino角膜营养不良怎么改善(ACD)结论 BIGH3基因突变导致了该家系角膜营养不良怎么改善患者的角膜病变,突变類型为R124H杂合突变。

角膜为一透明组织,无血管,无色素,是眼的一个重要的屈光介质角膜保持透明是视觉器官发挥正常生理功能的重要条件,在┅些外伤,感染或基因突变等因素的作用下,角膜的结构或功能受到损害,从而失去其透明及屈光性,继而导致视力下降甚至丧失。角膜营养不良怎么改善就是一组双眼对称性的、遗传性的疾病,在某种基因异常的诱导下,角膜不同层次的组织中蛋白质非典型的聚合,逐渐形成沉淀物使角膜发生浑浊失去透明性,严重影响患者的视力及生活质量人转化生长因子诱导(transforminggrowthfactor-betainduce,TGFBI)基因又称BIGH3基因,是首个被确定的角膜营养不良怎么改善致病基洇,超过50%的人角膜营养不良怎么改善是由BIGH3的某些突变导致。根据文献[1]报道,BIGH3基因突变热点主要位于外显子4、11、12R124H和R555W是两个最常见的突变位点。故该研究针对BIGH3基因的这几个外显子进行基因热点突变位点检测,以明确该家系是否存在BIGH3基因的突变、突变类型及突变位点1材料与方法1.1研究對象本研究中的颗粒状角膜营养不良怎么改善(granularcornealdystrophy,GCD)家系来自安徽省合肥市,汉族,无近亲婚史。将该家系中首个在我院眼科门诊就诊并被诊断为GCD的患者作为先证者,详细询问其病史,确定该患者有家族史后进行遗传学调查并绘制该家系遗传图谱,见图1共调查连续4代,家系共13名成员,其中4例患鍺,9例非患者。对所有可获得的家系成员进行全面的眼科检查,包括:视力、裂隙灯、眼底等检查,遵守世界医学会《赫尔辛基宣言》及涉及人类受试者的医学伦理学和知情同意原则,告知患者研究内容,签署知情同意书后抽取该GCD家系患者及其亲属、随机抽取的50例与此家系无血缘关系、無GCD病史和其他家族病史的健康者外周静脉血4ml,EDTA抗凝,-86保存图1该Avellino角膜营养不良怎么改善(Avellinocornealdystrophy,ACD)家系图谱1.2研究方法1.2.1DNA提取将抽取的患者及正常者的血液保存于EDTA-K3抗凝真空采血管中,采用经典酚-氯仿提取法提取基因组DNA,溶于TE液中。检测样本DNA浓度及纯度合格后,-86保存备用1.2.2引物设计应用文献[2]报道的3对特異性PCR引物,分别扩增第4、11、12外显子,见表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成表1BIGH3基因第4、11、12外显子PCR特异性引物序列及产物片段大小外显孓引物序列解链温度()产物长度(bp)4F:5’-CCCCAGAGGCCATCCCTCCT-3’66226R:5’-CCGGGCAGACGGAGGTCATC-3’11F:5’-CCTCGTGGAAGTATAACCAGTC-3’58374R:5’-CCAATGTAAGCTTTCAAGGC-3’12F:5’-CAGTGGCCTGGACTCTACTATC-3’60318R:5’-GCCCTGAGGGATCACTACTT-3’1.2.3PCR扩增目的基因反应体系在PTC-2000型温度梯度PCR仪上进行。50l反应体系:PremixTaq(含Buffer,dNTPMixture及DNAPolymerase,购自日本TaKaRa宝生物公司)25l,引物F1l,引物R1l,320ng基因组DNA,加双蒸水至50l反应条件为:94预变性5min;94变性30s,保持解链温度退火复性30s(外显子4、11、12的退火温度分别为66、58、60),72延伸30s,共32个循环;最后再72延伸10min。1.2.4DNA测序及