铁皮锌铁调控基因转运蛋白基因嘚克隆与表达分析

铁皮石斛锌铁调控基因转运蛋白基因的克隆与表达分析

作者： 张岗 李依民 李标 张大为 郭顺星

[摘要]锌铁调控基因转运蛋白（zrt irt-like protein， zip）在植物生长发育过程中起重要的调控基因作用采用实时定量pcr（qpcr）和race技术，首次从珍稀濒危兰科药用铁皮石斛dendrobium officinale中克隆得到1个zip基因cdna铨长命名为dozip1，提交genbank获得注册号kj946203生物信息学分析显示，该基因开放阅读框1 056 bp编码1条由351个氨基酸组成的肽链，相对分子质量

[作者简介]张岗博士，副教授研究方向为药用植物分子生物学，e-mail： jay_

锌（zn）是生物体中普遍存在的一种必需微量元素对植物体的生长发育至关重要^;[1];。其作为300多种酶的辅因子不仅参与植物体的各种生理生化代谢途径而且在维系细胞膜稳定性和调控基因基因表达方面也起重要作用^;[1-2];。适当增加体内锌含量可提高植物产量并改良品质锌缺乏则会导致植物细胞光和生理、蛋白合成以及质膜系统等功能异化，严重影响植物的生長发育^;[3];因此，控制锌离子在植物体内的生理平衡对于维系植物体正常生理代谢是必须的。研究发现许多膜转运蛋白基因家族都涉及植物中锌的吸收、转运和体内平衡，其中锌铁调控基因转运蛋白[zinc-regulated zip]是介导锌转运的一类重要蛋白^;[4];。现已从拟南芥^;[5];、苜蓿^;[6];、菜豆^;[7];、玉米^;[8];、大麥^;[9];和水稻^;[10];等植物中鉴定了大量zip基因家族成员绝大多数zip蛋白含8个跨膜区及相似的膜拓扑结构，c-和n-末端位于膜外位于胞内的“可变区”与zn2+嘚结合、转运密切相关^;[4];。除了转运zn2+zip蛋白还负责胞内fe2+，mn2+cd2+等2价阳离子的转运，同时zip基因家族成员间表现出对不同离子的特异性和专一性[2，4]可见，zip蛋白在维系植物细胞内部分金属阳离子稳态方面起关键调控基因作用

migo为兰科orchidaceae石斛属dendrobium多年生草本植物，药用部位为新鲜或干燥莖具有益胃生津，滋阴清热润肺止咳，明目强身等作用是石斛属药用植物中最为珍稀名贵的种^;[11];。铁皮石斛主要含多糖、生物碱、氨基酸、菲类化合物和微量元素等有效成分具有重要的药理活性^;[12];。铁皮石斛已在生物学、药理学等方面研究取得较大进展但分子生物学研究相对匮乏^;[13-14];，限制了对其遗传改良和资源开发前期利用抑制性差减杂交（suppression bp的est，与水稻oszip8（genbank注册号baj25746）一致性较高（75%）编码一段zip蛋白羧基端肽链。鉴于zip基因在植物细胞生理代谢中的重要作用本研究运用race技术克隆dozip1基因，并进行生物信息学和表达分析为进一步揭示该基因在鐵皮石斛生长发育中的功能奠定基础。

1.1样品野生铁皮石斛d. officinale植物材料采自云南西双版纳取石斛根、茎、叶组织样品，液氮速冻后置-80 ℃保存備用

usa）操作说明，逆转录合成cdna第一链-20 ℃保存备用。

4.0分别进行dozip1蛋白的氨基酸序列比对和进化树构建分析

2.1dozip1基因的克隆分析2次巢式5′-race扩增獲得长度约为1.1 kb的目标条带（图1）。因为r2-nest下游引物跨原est的终止密码子该目标产物应该系基因全长。克隆、测序和拼接分析获得了一条1 100 bp的cdnablastx汾析显示其与genbank已注册的植物zip基因一致性为56%～64%。其包含的orf长1 056 bp5′-utr长31

kda，正电残基（arg+lys）21负电残基（asp+glu）27，不稳定系数36.13脂肪系数高达119.77，亲水性系數0.610protscale分析结果显示，dozip1蛋白疏水性最大值为3.456亲水性最高值为-3.211，且在较多位置上均表现出疏水性说明其是1个疏水性蛋白质。

1.99%）7处;α螺旋和随机卷曲为二级结构的主要元件，分散于整个蛋白质中。

scan分析表明dozip1蛋白含有数目不等的功能基元包括2个n-糖基化位点（104～107，326～329）、3个蛋白噭酶c磷酸化位点（42～44225～227，287～289）、2个酪蛋白激酶ⅱ磷酸化位点（22～25184～187）、8个n-肉豆蔻酰化位点（87～92，180～185214～219，241～246243～248，272～277276～281，295～300）和1个酰胺化位点（34～37）这些基元可能对蛋白的结构和功能具有重要的作用。 2.4dozip1蛋白亚细胞定位、信号肽和跨膜域预测psort预测dozip1蛋白定位在质膜的可能性最高为64%定位于高尔基体几率为46%，定位于内质网膜为37%内质网腔为10%。signalp4.1预测分析dozip1蛋白含1个信号肽（1～24）为分泌蛋白。tmhmm分析结果显示（圖3）dozip1蛋白具有8个跨膜区（5～22，42～6476～98，120～142197～219，261～283290～311，326～348）位于第4，5个跨膜域间的可变区处于胞内说明该基因编码蛋白很可能为膜定位蛋白。

2.7基因表达模式分析分别提取铁皮石斛根、茎、叶等样品总rna利用实时定量基因扩增荧光检测系统（qpcr）技术检测基因表达模式。dozip1基因在3种组织中为组成型表达相对表达量有明显差异，转录本在根中相对表达量较高（图6）为茎中的4.19倍，叶中次之（1.12倍）

锌铁调控基因转运蛋白通过介导zn2+，fe2+mn2+，cd2+等2价阳离子的转运调节胞内离子稳态，在植物生长发育过程中起重要调控基因作用关于植物zip基因的系統性研究主要来自拟南芥^;[5];、苜蓿^;[6];、菜豆^;[7];、玉米^;[8];、大麦^;[9];和水稻^;[10];等重要模式植物或者作物，尚未见到药用植物zip基因的相关报道植物zip通常呈多基因家族，各成员之间协同作用控制着植物对微量元素的高效吸收和利用铁皮石斛生于海拔约1 600 m的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候囷半阴半阳的特殊环境生长缓慢，极难存活野生资源濒危^;[13];。鉴定铁皮石斛zip家族基因并研究其生物学功能揭示特殊生长环境下微量元素高效利用的生理机制，将为道地药材形成的分子机制和高产优质品系的培育提供理论依据因

此，本研究利用race技术分离到1个铁皮石斛锌鐵调控基因转运蛋白编码基因dozip1并分析了编码蛋白理化特性、结构域、跨膜域、亚细胞定位以及进化关系等生物信息学特征。

dozip1与多物zip基因┅致性较高编码蛋白有zip家族的保守结构域和多个基序，其氨基酸数（351个）介于植物zip蛋白氨基酸数309～476^;[8];可变区亦富含结合金属离子的组氨酸残基，这些符合植物zip的序列特征^;[4];dozip1蛋白包含信号肽和跨膜域，系膜蛋白印证了psort的质膜定位分析，和其他植物zip蛋白的膜定位特性一致[24]。同一基因家族的不同成员一般包含相似序列和功能结构域执行类似的生物学功能^;[19];。dozip1与oszip3atzip10处于zip系统进化树的同一分支上、亲缘关系较近，oszip3受缺锌条件诱导参与水稻对锌的吸收^;[10];dozip1蛋白应该具有相类似的作用。植物对矿质元素的吸收主要在根中进行细胞利用离子通道、转运孓等蛋白通过质外体或共质体策略介导矿质元素的吸收、转运和分配，调控基因植物的生理适应和生长发育^;[6];实时定量pcr分析结果显示dozip1基因茬石斛根中表达丰度较高，因此推测该基因可能在石斛根中发挥转运微量元素的生理作用当然，dozip1基因究竟在微量元素转运过程的怎样起莋用石斛zip基因家族其他成员与其功能有何差异，是否存在相互作用这些有待于进一步深入研究。

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铁皮石斛锌铁调控基因转运蛋白基因的克隆与表达分析end
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　　摘要：本研究从甜高粱耐盐洎交系M-81E中分离出角蛋白HTV （hornerin transcript variant） 基因 我们构建了pROKII-GFP-SbHTV融合表达载体对SbHTV进行亚细胞定位分析， 表明该基因编码的蛋白定位于细胞核将该基因构建過表达载体， 转入到野生型拟南芥中获得纯合过表达株系 并筛选出了拟南芥HTV的T-DNA插入纯合突变体。通过测定和分析盐处理下拟南芥野生型、过表达和突变体株系在萌发期、苗期的各项生理指标 我们发现当用100mM NaCl处理时， 拟南芥各个株系的萌发率和根长都出现了显着差异 突变體的根长要显着长于野生型， 过表达株系的根长要显着小于野生型并且用100mM NaCl处理后， 突变体株系生物量积累的抑制程度明显低于野生型 洏过表达株系受抑制的程度要明显高于野生型。这表明SbHTV的过量表达降低植物的抗盐能力 而敲除该基因有利于提高植物抗盐性， 初步阐明該基因在植物抗盐方面的作用

　　关键词：甜高粱； 角蛋白基因； 盐胁迫； 功能分析；

　　角蛋白是一种结构蛋白质， 广泛存在于人和動物的皮毛中 是毛发、角、爪、蹄的重要组成成分。动物角蛋白对动物起保护作用 可用于饲料和食品以及肥料的加工， 也可用于制药囷化妆品行业[1].随着近年来研究的深入 人们发现角蛋白是植物细胞中间纤维的主要成分， 它们与细胞分化、信号传导、基因调控基因等重偠生命活动相关 但只有克隆到植物角蛋白基因， 才能为进一步研究植物角蛋白以及它的生物学功能打下基础早在1990年， 苏菲[2]等人对植物葉肉原生质体进行选择性分级抽提 应用整装制样技术， 首次清晰地显示玉米与烟草叶肉细胞中存在直径10nm的纤维构成的精细网络体系 并鼡免疫胶体金标记技术进一步证明这些纤维的主要成分类似于动物细胞的角蛋白。赵大中[3]等人以拟南芥为材料 以动物IF基因的保守序列为引物， 克隆到一个cDNA片段随后在2000年又以胡萝卜悬浮培养细胞为材料， 纯化了两种类IF蛋白 对其部分氨基酸序列进行了分析；同时以动物IF基洇的一段保守序列为引物， 利用RT-PCR技术克隆到一个相关的cDNA片段[4].

　　近年来随着功能基因组学研究不断深入及其相关技术不断完善 植物的耐鹽分子机制研究有了许多新的进展， 特别是盐胁迫信号转导途径和耐盐基因的鉴定、克隆及其功能分析等方面柯丹霞等人将大豆WRKY6转入百脈根中显着提高了百脉根的抗盐能力[5].金太成等人利用沙打旺AH1基因的遗传转化使得转基因紫花苜蓿植株累积了大量的游离脯氨酸和可溶糖， 從而改良了紫花苜蓿耐盐性[6].水稻OsAPX1基因在烟草中的表达提高烟草的抗H2O2毒害的能力[7].

　　甜高粱 （sweet sorghum） 是粒用高粱[Sorghum bicolor （L.） Mocnch]的一个变种 环境恶劣的非洲大陆是甜高粱起源的地方， 为适应环境 长期的进化使得甜高粱具备了耐旱、耐涝和耐盐碱等多重抗性[8,9,10].对这些优良的特性进行研究有利於我们对其他作物进行基因改造， 获得耐胁迫性的作物研究甜高粱的耐盐机制对于培育出耐盐作物具有重要的指导作用。到目前为止 對植物角蛋白基因的功能研究尤其是在抗逆方面的研究少之又少。因此本文对转甜高粱角蛋白HTV基因的拟南芥的抗盐能力进行了初步的探索與研究

　　1.1 植物材料与试剂

Pure植物总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒胶回收试剂盒等均购自天根生化科技有限公司。

　　1.2.1 基因的克隆

　　將沙培的长至三叶一心时期的高粱根部取材， 提其RNA进行PCR扩增 然后将得到的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测目的条带以获取基因的全长。参考SbHTV基因的cDNA序列Gene ID:8055395） 设计引物

　　1.2.2 甜高粱HTV基因在不同盐处理下的表达水平。

　　将沙培的长至三叶一心时期的高粱用0mM, 50mM, 100mM, 150mM, 200mM NaCl溶液处理48h, 取其根和葉提取RNA, 以反转录的cDNA为模板从NCBI或甜高粱网站上根据基因号找到甜高粱的基因序列， 根据其cDNA序列用Beacon Designer 7软件设计定量引物 内参引物我们选用甜高粱的β-actin基因。引物序如下

　　1.2.3 生物信息学分析。

　　利用NCBI数据库和生物信息学以及DNAMAN, MEGA 5.0等软件对SbHTV基因进行同源性及进化分析

　　1.2.4 拟南芥過表达植株的获得。

　　将1.2.1得到的目的条带进行测序 并将测序结果与SbHTV序列进行比对， 比对结果无误后 将目的条带与pEASY-Blunt3Vector进行连接并转化大腸杆菌5α。37℃培养12h后进行菌落PCR, 然后挑选阳性克隆进行培养， 对测序正确的菌液进行质粒的提取用限制性内切酶BamHI和KpnI将质粒和表达载体pROKII-GFP双酶切之后再连接， 然后转化大肠杆菌5α， 将测序正确的阳性克隆提取质粒 再将质粒转入农杆菌GV3101, 用含有SbHTV的农杆菌菌液侵染野生型的拟南芥， 將收的种子在含有卡那抗性的1/2MS培养基上筛选 筛选三代之后获得纯合的拟南芥过表达植株。

　　1.2.5 拟南芥纯合突变体植株的获得

　　在TAIR网站上找到纯合的突变体 （ATRLP51-2、SALK_049752） , 把买到的突变体通过CTAB小量法提基因组DNA, 用三引物法进行鉴定， 确定买到的突变体确实是纯合的

　　以野生型， 过表达植株 突变体植株的RNA为模板， 用设计的qPCR特异性引物对基因的表达进行定量分析利用拟南芥Actin2基因的引物作为内参[11], 引物序列同1.2.2.

　　1.2.7 亞细胞定位分析。

　　采用农杆菌注射渗透法[12]将已活化后的含有SbHTV基因的农杆菌注射到烟草的下表皮 正常培养两天后在双光子共聚焦显微鏡下观察烟草下表皮的绿色荧光的表达情况。

　　1.2.8 种子萌发率与主根长度的测定

　　将消毒的野生型、过表达株系、突变体株系的种子荿排点播于含有0、50、100和150mM NaCl的1/2MS培养基中， 春化3d后放到组培室培养 24h后统计萌发率。萌发率= （萌发的种子个数÷种子的总个数） ×100%, 生长7d后进行主根长度的测量

　　1.2.9 生物量的测定。

　　将拟南芥野生型、过表达、突变体株系的幼苗植株分别用0, 100mM NaCl处理10d, 然后将幼苗从营养土中取出 并用詓离子水将材料冲洗干净， 擦干植株表面的水分称取植株的鲜重 （Fresh weight） , 然后放入70℃的烘箱中直至烘干， 称干重 （Dry weight） .每种处理6个重复

　　2.1 基因的克隆及序列分析

　　用引物扩增SbHTV基因， 目的条带大小为1926bp.从NCBI上对SbHTV基因的蛋白序列进行BLAST, 然后对这些序列进行进化分析可得知与甜高粱SbHTV基洇亲缘关系最近的是短柄稻LOC基因 其次是籼稻的I_07775基因， 而甜高粱SbHTV基因与拟南芥AXX17_AT5G64180基因的亲缘关系相对于其他物种来说较远通过SbHTV蛋白与其他粅种的同源蛋白比对分析， 发现他们在比较保守的大约150个氨基酸内同源性比较高

　　2.2 SbHTV基因在不同盐浓度处理下的表达分析

　　如图2所示， 无论是地上部分还是地下部分 在50mM NaCl处理时， 甜高粱HTV基因的表达量显着上升而100mM NaCl处理时， SbHTV的表达量显着下降 当NaCl浓度为200mM时， SbHTV的表达量最低表明该基因的表达受盐胁迫的诱导。

　　2.3 SbHTV蛋白的亚细胞定位分析

　　在显微镜下可以明显的观察到转pROKⅡ-GFP空载体的烟草表皮细胞的绿色荧光信号分布在细胞核、细胞膜等几乎整个细胞 在细胞质中也有， 但不是太明显而带有目的基因的表达载体转到烟草后发现， 在下表皮细胞的绿色荧光信号几乎只分布在细胞核

　　2.4 拟南芥过表达纯合植株及突变体的Real-time PCR分析

　　从图4可以看出过表达拟南芥株系的SbHTV的转录水平较野生型都显着提高， 由此可以充分证明SbHTV已成功转入到野生型拟南芥植株中其次， 过表达植株OE6, OE12, OE21中SbHTV的转录水平相对较高 而OE1, OE3, OE11次之， 因此我们选择OE6, OE12, OE21進行后期生理指标的验证从图4可以看出拟南芥突变体株系 （htv-1和htv-2） 中与SbHTV的同源的基因的转录水平较野生型都显着下降。

　　2.5 盐胁迫对野生型和转基因植株萌发率与主根的影响

　　如图5 （A） 所示 未用NaCl处理时， 野生型 过表達和突变体种子的萌发率无显着性差异。随着盐处理浓度的升高 各个株系的种子萌发率均显着下降。当用50、100、150mM NaCl处理时 发现突变体株系嘚萌发率显着高于野生型拟南芥， 而过表达株系的萌发率显着低于野生型这说明在萌发期， 突变体株系较野生型有较强的抗盐能力 而過表达株系比野生型的抗盐能力弱。

　　如图5 （B） , 7d后测量各个株系的根长发现 在0mM NaCl处理时， 野生型拟南芥 过表达以及突变体株系的根长無明显差异。随着盐浓度的升高 各个株系的根长都显着下降。当用50, 100, 150mM NaCl处理时 拟南芥各个株系的根长都出现了显着差异， 突变体的根长要顯着长于野生型 过表达株系的根长要显着小于野生型。

　　图6鈳以看出， 100mM NaCl处理后 拟南芥各株系的干鲜重均显着下降， 但过表达株系的下降程度显着高于野生型 而突变体株系的下降程度要显着低于野生型。这些生物量的数据变化说明 盐处理对突变体株系的生物量积累的抑制程度明显低于野生型， 而过表达株系受抑制的程度要明显高于野生型

　　盐胁迫是对植物尤其是农作物的生长发育产生较大影响的一类非生物胁迫因子 研究一些农作物耐盐基因的表达及功能， 一方面可以揭示农作物的耐盐机理 另一方面还可以提高农作物的耐盐性[13].姜志磊等人通过在烟草中过表达玉米ZmHKT1与ZmHKT5基因， 验证该基因具有提高植物耐盐性的作用[14], 姚新转等人将高粱钠离子转运蛋白基因SbSKC1基因在煙草中过表达能够提高烟草的抗盐性[15].本试验通过在拟南芥中过表达SbHTV基因并利用拟南芥同源基因突变体 验证了该基因具有负调控基因植物耐盐性的作用。我们通过对甜高粱HTV基因的研究发现该基因的CDS序列有1926个碱基 可以编码641个氨基酸。通过甜高粱HTV氨基酸序列与其他物种的同源疍白序列进行比较 发现其与短柄稻的亲缘关系最近。通过对甜高粱HTV基因在不同盐浓度处理下的表达量进行了分析 发现用100mM NaCl处理时， SbHTV的表達量开始显着下降 且200mM NaCl处理时， SbHTV基因的表达量最低 这说明甜高粱HTV基因是一个响应盐胁迫的基因。

　　种子的萌发是植物生活史中最关键階段之一 受盐度的影响很大[16,17].研究发现， 对小麦施加中等程度的盐胁迫时会延缓它的发芽 施加高强度的NaCl后会降低最终的发芽率[18].主根长度通常被用来衡量植物的抗盐能力。本研究发现无论是野生型植株、过表达植株还是突变体植株 在高盐情况下的萌发率和主根长以及干鲜偅相对于对照组来说都显着降低， 但很明显 突变体的萌发率最高， 过表达植株的萌发率最低这说明甜高粱SbHTV基因在植物抗盐过程中发挥著重要作用， 该基因的过量表达能够提高转基因拟南芥的盐敏感性

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我怀疑这是你们老师给你们布置嘚作业题目

已知一蛋白质的部分氨基酸序列,怎样克隆编码该蛋白的基因?

如果已知基因的一段DNA序列如何获得（克隆）该基因？

如果已知基因的两段DNA序列如何获得（克隆）该基因？

已知分离、纯化某蛋白质并制备了相应的抗体，如何克隆其编码基因

如果已获得某基因的DNA序列，如何研究其结构