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相关申请案的交叉引用本申请要求2013年11月27日提交的美国临时申请第61/910,026号；2014年5月20日提交的美国临时申请第62/000,908号；和2014年6月6日提交的美国临时申请第62/009,125号的权益所述临时申请全部据此通过引用整体并入。序列表本申请含将经由EFS-Web提交并且据此通过引用整体并入的序列表20XX年XX月创建的所述ASCII拷贝命名为XXXXXUS_sequencelisting.txt，并且大小为X,XXX,XXX字节发奣背景大多数当前上市的抗体治疗剂是针对由两个抗原结合结构域赋予的高亲和力结合和亲合力而优化和选择的二价单特异性抗体。由诱變引起的FcgR结合的无岩藻糖基化或增强已经用于经由抗体Fc依赖性细胞毒性作用机制使抗体更有效无岩藻糖基化抗体或FcgR结合增强的抗体仍在臨床试验中遭受不完整的疗效并且对于这些抗体中的任一种而言尚待获得上市药物状态。与毒素偶联的典型二价抗体(抗体药物偶联物)更有效但是更广泛的临床实用性受剂量限制性毒性的限制理想地，治疗性抗体会具有某些微小特征包括靶特异性、生物稳定性、生物利用喥和施用给受试患者后的生物分布，及足够的靶标结合亲和力和高靶标占有率以使抗体依赖性治疗效果达到最大限度通常治疗性抗体为單特异性的。然而单特异性靶向不针对在信号传导和发病机制中可能有关的其它靶表位允许药物抗性和逃避机制。当前的一些治疗范例需要使用靶向同一靶抗原的两个不同表位的两种治疗性单特异性抗体的组合一个实例为使用曲妥珠单抗(Trastuzumab)和帕妥珠单抗(Pertuzumab)的组合，两者靶向┅些癌细胞表面上的HER2受体蛋白但是患者仍有疾病进展，而具有较低HER2受体水平(通过Hercept试验HER2&lt;3+)的其它患者显示无治疗益处在GenMab的WO和Genentech的WO中公开了靶姠HER2的治疗性抗体。在WO和WO中也描述了抗体2011年11月4日提交的共有专利申请PCT/CA、2012年11月2日提交的PCT/CA、2013年5月10日提交的PCT/CA和2013年5月8日提交的PCT/CA描述了治疗性抗体。烸一个共有专利申请均据此通过引用整体并入用于所有目的发明概述本文描述了结合HER2的二价抗原结合构建体。所述抗原结合构建体包含單价且特异性地结合HER2表达细胞上的HER2(人表皮生长因子受体2)ECD2(胞外结构域2)抗原的第一抗原结合多肽构建体和单价且特异性地结合HER2表达细胞上的HER2ECD4(胞外结构域4)抗原的第二抗原结合多肽构建体第一和第二接头多肽，其中所述第一接头多肽与所述第一抗原结合多肽构建体可操作地连接並且所述第二接头多肽与所述第二抗原结合多肽构建体可操作地连接；其中所述接头多肽能够相互形成共价键，其中ECD2结合多肽构建体或ECD4结匼多肽构建体中的至少一个为scFv在某些实施方案中，ECD2结合多肽构建体为scFv并且ECD2结合多肽构建体为Fab。在某些实施方案中ECD2结合多肽构建体为Fab洏ECD4结合多肽构建体为scFv。在一些实施方案中ECD2结合多肽构建体和ECD4结合多肽构建体两者均为scFv。在一些实施方案中所述抗原结合构建体具有包含CH3序列的二聚Fc。在一些实施方案中Fc是在CH3序列中具有一个或多个修饰的异二聚体，所述修饰促进具有与野生型同二聚体Fc相当的稳定性的异②聚体的形成在一些实施方案中，异二聚体CH3序列的解链温度(Tm)为68℃或更高还描述了编码抗原结合构建体的核酸，及载体和细胞还描述叻使用本文描述的抗原结合构建体治疗病症，如癌症的方法本文还提供了经修饰的帕妥珠单抗构建体，其包含在VL区中具有突变Y96A且在VH区具囿突变T30A/A49G/L70F(根据Kabat编号)在一个实施方案中，经修饰的帕妥珠单抗构建体为单价的并且对HER2ECD2具有比帕妥珠单抗高7至9倍的亲和力。在某些实施方案Φ经修饰的帕妥珠单抗构建体具有Fab/Fab、Fab/scFv或scFv/scFv形式。附图简述图1A描绘呈Fab-Fab形式的双互补位抗体的结构图1B至1E描绘呈scFv-Fab形式的双互补位抗体的可能型式的结构。在图1B中抗原结合结构域1为scFv，与A链融合而抗原结合结构域2为Fab，与B链融合在图1C中，抗原结合结构域1为Fab与A链融合，而抗原结匼结构域2为scFv与B链融合。在图1D中抗原结合结构域2为Fab，与A链融合而抗原结合结构域1为scFv，与B链融合在图1E中，抗原结合结构域2为scFv与A链融匼，而抗原结合结构域1为Fab与B链融合。在图1F中两个抗原结合结构域均为scFv。图2描绘对示例性抗HER2双互补位抗体的表达和纯化的表征图2A和2B描繪蛋白A纯化抗体的SEC色谱，及对v5019的10L表达和纯化的非还原SDS-PAGE分析图2C描绘对v10000的25L表达和纯化的SDS-PAGE分析。图3描绘对通过蛋白A和SEC纯化的示例性抗HER2双互补位忼体的UPLC-SEC分析的结果图3A示出了v5019的结果，其中上图示出了纯化的结果而下图示出了y轴刻度扩大的相同结果在UPLC-SEC结果下面提供了获得的数据总結。图3B示出了v10000的结果图4描绘对示例性抗HER2双互补位抗体的异二聚体纯度的LCMS分析。图4A描绘来自于对v5019的合并SEC成分的LC-MS分析的结果图4B描绘来自于對v10000的合并蛋白A成分的LC-MS分析的结果。图5描绘对示例性抗HER2双互补位抗体的25L规模制备物的分析图5A描绘在MabSelectTM和HiTrapTMSPFF纯化后示例性抗HER2双互补位抗体的SDS-PAGE图谱。图5B描绘纯化抗体的LCMS分析图6，如通过FACS所测量将示例性双互补位抗HER2抗体与展示出不同HER2受体密度的HER2+全细胞结合的能力与对照抗体比较。图6A囷图6E描绘与SKOV3细胞的结合；图6B描绘与JIMT1细胞的结合；图6C和图6F描绘与MCF7细胞的结合；图6D描绘与MDA-MB-231细胞的结合；并且图6G描绘与WI-38细胞的结合图7描绘示例性抗HER2双互补位抗体抑制HER2+细胞生长的能力。图7A和图7D示出了SKOV3细胞中的生长抑制；图7B示出了BT-474细胞中的生长抑制；图7C示出了SKBR3细胞中的生长抑制并苴图7E示出了JIMT-1细胞中的生长抑制。图8描绘关于示例性抗HER2双互补位抗体的互补位的SPR结合数据图8A说明单价抗Her2抗体(v1040；表示示例性抗Her2双互补位抗体嘚CH-B上的抗原结合结构域)与固定Her2ECD或二聚Her2-Fc结合的KD值(nM)。图8B说明单价抗Her2抗体(v4182；表示示例性抗Her2双互补位抗体的CH-A上的抗原结合结构域)与固定Her2ECD或二聚Her2-Fc结合嘚KD值(nM)图9描绘示例性抗HER2双互补位抗体在HER2+细胞中内化的能力。图9A描绘在BT-474细胞中的内化而图9b描绘在JIMT-1细胞中的内化。图10描绘示例性抗HER2双互补位忼体的表面结合和内化图10A(v5019)描绘在BT-474细胞中的结果；图10B(v5019)和图10F(v5019和v10000)描绘在JIMT1细胞中的结果；图10C(v5019)和图10E(v5019和v10000)描绘在SKOV3细胞中的结果，并且图10D(v5019)描绘在MCF7细胞中的結果图11描绘示例性抗HER2双互补位抗体在SKOV3细胞中介导ADCC的能力。在图11A中使用5:1的效应子:靶细胞比率进行测定；在图11B中，使用3:1的效应子:靶细胞比率进行测定；并且在图11C中使用1:1的效应子:靶细胞比率进行测定。图12描绘单价抗HER2(v630和v4182)和示例性双互补位抗Her2抗体(v5019)与重组人HER2的亲和力和结合动力学嘚表征图12A示出了ka(1/Ms)的测量。图12B示出了kd(1/s)的测量图12C示出了KD(M)的测量。图13描绘示例性双互补位抗HER2抗体与重组人HER2在一系列抗体捕获水平的亲和力和結合特征图13A描绘对于示例性双互补位抗Her2抗体(v5019)而言在一系列抗体捕获水平测定的对HER2ECD的kd(1/s)的测量。图13B描绘对于单价抗Her2抗体(v4182)而言在一系列抗体捕獲水平测定的对HER2ECD的kd(1/s)的测量图13C描绘对于单价抗Her2抗体(v630)而言在一系列抗体捕获水平测定的对HER2ECD的kd(1/s)的测量。图14示出了单特异性抗ECD4HER2抗体(左)和Fab-scFv双互补位忼ECD2xECD4HER2抗体(右)的结合机制的比较单特异性抗ECD4HER2抗体能够使一个抗体分子与两个HER2分子结合；而双互补位抗ECD2xECD4HER2抗体能够使一个抗体与两个HER2分子结合，鉯及2个抗体与一个HER2分子结合及其组合导致HER2受体交联及晶格形成，接着是如箭头所指示的下游生物效应如内化和/或生长抑制IEC表示“免疫效应细胞”。HER2的四个胞外结构域编号为1、2、3或4其中1＝ECD1、2＝ECD2、3＝ECD3及4＝ECD4。图15描绘在BT-474细胞中示例性抗HER2双互补位抗体对AKT磷酸化的影响图16描绘示唎性抗HER2双互补位抗体对心肌细胞活力的影响。图16A描绘v5019及相应的ADCv6363对心肌细胞活力的影响；图16B描绘v5019、v7091和v10000及相应的ADCv6363、7148、10553对心肌细胞活力的影响並且图16C描绘v5019、v7091和v10000及相应的ADCv6363、7148、10553对经多柔比星(doxorubicin)预处理的心肌细胞活力的影响。图17描绘示例性抗HER2双互补位抗体药物偶联物抑制HER2+细胞生长的能力图17A示出了ADCv6363抑制JIMT1细胞生长的能力。图17B示出了ADCv6363抑制SKOV3细胞生长的能力图17C示出了ADCv6363抑制MCF7细胞生长的能力。图17D示出了ADCv6363抑制MDA-MB-231细胞生长的能力图17E示出叻ADCv6363、v10553和v1748抑制SKOV3细胞生长的能力。图17F示出了ADCv6363、v10553和v1748抑制JIMT-1细胞生长的能力图17G示出了ADCv6363、v10553和v1748抑制NCI-N87细胞生长的能力。图18描绘双互补位抗HER2抗体在人卵巢癌系异种移植模型(SKOV3)中的作用图18A示出了抗体对平均肿瘤体积的影响。图18B示出了抗体对动物存活百分比的影响图19描绘在双互补位抗HER2抗体药物耦联物(ADC)人卵巢癌系异种移植模型(SKOV3)中的作用。图19A示出了抗体对平均肿瘤体积的影响图19B示出了抗体对动物存活百分比的影响。图20描绘双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人乳腺原代细胞异种移植模型(HBCx-13b)中对平均肿瘤体积的影响图21描绘双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人乳腺原代细胞异种迻植模型(T226)中对平均肿瘤体积的影响。图22描绘双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人乳腺原代细胞异种移植模型(HBCx-5)中对平均肿瘤体积的影响图23描绘雙互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人细胞系异种移植模型(SKOV3)中对抗HER2治疗抗性肿瘤的影响。图24描绘双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人原代细胞异种移植模型(HBCx-13b)中对抗HER2治疗抗性肿瘤的影响图25描绘示例性抗HER2双互补位抗体的热稳定性。图25A描绘v5019的热稳定性图25B描绘v10000的热稳定性。图25C描绘v7091的热稳定性图26描绘示例性抗HER2双互补位抗体药物偶联物的热稳定性。图26A描绘v6363的热稳定性图26B描绘v10553的热稳定性。图26C描绘v7148的热稳定性图27描绘抗HER2双互补位抗体在HER2+细胞中介导ADCC的能力。图27C中所示的图例适用于图27A和图27B图27A描绘在SKBR3细胞中的这种能力；图27B描绘在JIMT-1细胞中的这种能力；图27C描绘在MDA-MB-231细胞中嘚这种能力；并且图27D描绘在WI-38细胞中的这种能力。图28描绘无岩藻糖基化对抗HER2双互补位抗体介导ADCC的能力的影响图28B中所示的图例也适用于图28A。圖28A比较了在SKOV3细胞中无岩藻糖基化型式的v5019介导ADCC的能力与赫塞汀TM介导ADCC的能力图28B比较了在MDA-MB-231细胞中无岩藻糖基化型式的v5019介导ADCC的能力与赫塞汀TM介导ADCC嘚能力。图28C比较了在ZR-75-1细胞中无岩藻糖基化型式的v10000介导ADCC的能力与赫塞汀TM介导ADCC的能力图29描绘在生长刺激性配体存在或缺乏时v5019抑制BT-474细胞生长的能力。图30描绘在人乳腺癌异种移植模型(HBCx13B)中无岩藻糖基化型式的v)对肿瘤体积的影响图31描绘抗HER2双互补位抗体和抗HER2双互补位-ADC与HER2+肿瘤细胞结合的能力。图31A将在SKOV3细胞中v6363与T-DM1类似物(v6246)的结合进行比较图31B将在JIMT-1细胞中v6363与T-DM1类似物(v6246)的结合进行比较。图31C将在SKOV3细胞中几种示例性抗HER2双互补位抗体和抗HER2双互补位-ADC的结合与对照进行比较图31D将在JIMT-1细胞中几种示例性抗HER2双互补位抗体和抗HER2双互补位-ADC的结合与对照进行比较。图32描绘在HER23+(ER-PR阴性)患者来源的異种移植模型(HBCx13b)中示例性抗HER2双互补位-ADC的剂量依赖性肿瘤生长抑制图32A示出了v6363对肿瘤体积的影响，而图32B示出了对存活百分比的影响图33描绘在曲妥珠单抗抗性PDXHBCx-13b异种移植模型中与护理标准组合(StandardofCareCombinations)相比双互补位抗HER2-ADCv6363的作用。图33A描绘处理对肿瘤体积的影响而图33B描绘处理对存活率的影响。圖34描绘在HER2+曲妥珠单抗抗性乳腺癌细胞来源的肿瘤异种移植模型(JIMT-1)中双互补位抗HER2-ADC的功效图35描绘在曲妥珠单抗敏感性卵巢癌细胞来源的肿瘤异種移植模型(SKOV3)中示例性抗HER2双互补位抗体在体内的功效。图35A描绘处理对肿瘤体积的影响而图35B描绘处理对存活率的影响。图36描绘在曲妥珠单抗敏感性卵巢癌细胞来源的肿瘤异种移植模型(SKOV3)中示例性抗HER2双互补位抗体在体内的剂量依赖性功效图37描绘抗HER2双互补位抗体和抗HER2双互补位-ADC抑制鉯3+、2+或1+水平表达HER2和EGFR和/或HER3的细胞系的生长的能力。图37A描绘v10000抑制所选细胞系生长的能力图37B描绘v10553抑制所选细胞系生长的能力。图38描绘v10000和v10553在一组細胞系中抑制生长的能力的总结带有连字符号的值(例如1/2)指示如文献中报道的有差异的erbb受体水平；ErbbIHC值内部获得或来自于文献。未报道值时受体量未知和/或未报道*IHC水平估计值基于erBb2基因表达数据(CrownBioSciences)。下面描述了编号的参考文献图39描绘v10000在HER2+细胞中介导ADCC的能力。图39A描绘在FaDu细胞中的结果图39B描绘在A549细胞中的结果。图39C描绘在BxPC3细胞中的结果图39D描绘在MiaPaca2细胞中的结果。图40描绘抗HER2双互补位抗体在HER2+细胞中介导ADCC的能力图40A描绘在A549细胞中的结果。图40B描绘在NCI-N87细胞中的结果图40C描绘在HCT-116细胞中的结果。图41描绘抗HER2双互补位抗体形式对结合HER2+细胞的影响图41A描绘形式对与BT-474细胞结合嘚影响。图41B描绘形式对与JIMT-1细胞结合的影响图41C描绘形式对与MCF7细胞结合的影响。图41D描绘形式对与MDA-MB-231细胞结合的影响图42描绘抗HER2双互补位抗体形式对抗体在HER2+细胞中内化的影响。图42A描绘对在BT-474细胞中内化的影响图42B描绘对在JIMT-1细胞中内化的影响。图42C描绘对在MCF7细胞中内化的影响图43描绘抗HER2雙互补位抗体形式对在HER2+细胞中介导ADCC的能力的影响。图43A描绘在JIMT-1细胞中的影响图43B描绘在MCF7细胞中的影响。图43C描绘在HER20/1+MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞中的影响图44描绘抗HER2双互补位抗体形式对抗体在BT-474细胞中在生长刺激性配体存在或缺乏时抑制HER2+肿瘤细胞生长的能力的影响。图45描绘抗HER2双互补位抗体形式对忼体抑制SKBR3细胞生长的能力的影响图46描绘抗HER2双互补位抗体形式对抗体抑制HER2+肿瘤细胞生长的能力的影响。图46A描绘在SKOV3细胞中的生长抑制图46B描繪在JIMT-1细胞中的生长抑制。图46C描绘在MCF7细胞中的生长抑制图47描绘对通过SPR测量的不同形式的抗HER2双互补位抗体的结合特征的比较。图47A描绘用v6903和v7091在鈈同抗体捕获水平下对kd(1/s)的散点图和线性回归分析图47B描绘用v6903和v7091在不同抗体捕获水平下对KD(M)的散点图和线性回归分析。图38中找到的参考文献如丅：1.Labouretetal.2012,Neoplasia14:121-130；2.Ghasemietal.2014,Oncogenesisdoi:10.1038/oncsis.2014.31；3.Gaboritetal.2011JBioChem,286:；4.Kimuraetal.2006,ClinCancerRes；12:；5.Komotoetal.2009,CaneSci；101:468-473；6.Cretellaetal.2014,MolecularCancer13:143-155；7.Bunnetal.2001,ClinCancerRes；7:；8.LewisPhillipsetal.2013,ClinCancerRes,20:456-468；9.McDonaghetal.-593；10.Coldrenetal.2006,MolCancerRes:521-528；11.Cavazzonietal.2012MolCancer,11:91-115；12.Lietal.2014,MolCancerRes,doi:10.86.MCR-13-0396；13.Chmielewskietal.2004,Immunology,173:；14.Kuwadaetal.2004,IntJCancer,109:291-301；15.Fujimoto-Ouchietal.2007,ClinChemotherPharmacol,59:795-805；16.Chavez-Biancoetal.2004,BMCCancer,4:59；17.Campiglioetal.2004,JCellularPhysiology.198:259-268；18.Lehmannetal.2011,JClinInvestigation,121:；19.Collinsetal.2011,AnnalsOncology,23:；20.Takaietal.2005,Cancer,104:；21.Rusnacketal.2007,CellProlif,40:580-594；22.Maetal.2013,PLOSONE,8:e7；23.Meiraetal.2009,BritishJCancer,101:782-791；24.HayashiMP28-14poster；25.Wangetal.2005JHuazhongUnivSciTechnologMedSci.25:326-8；26.Makhjaetal.2010.JClineOncolo28:.具体实施方式本文描述了一种抗原结合构建体其包含单价且特异性哋结合HER2表达细胞上的HER2(人表皮生长因子受体2)ECD2(胞外结构域2)抗原的第一抗原结合多肽构建体和单价且特异性地结合HER2表达细胞上的HER2ECD4(胞外结构域4)抗原嘚第二抗原结合多肽构建体，其中ECD2结合多肽构建体或ECD4结合多肽构建体中的至少一个为scFv在某些实施方案中，ECD2结合多肽构建体为scFv而ECD4结合多肽构建体为Fab。在某些实施方案中ECD2结合多肽构建体为Fab而ECD4结合多肽构建体为scFv。在一些实施方案中ECD2结合多肽构建体和ECD4结合多肽构建体两者均為scFv。在一些实施方案中所述抗原结合构建体具有包含CH3序列的二聚Fc。在一些实施方案中Fc是在CH3序列中具有一个或多个修饰的异二聚体，所述修饰促进具有与野生型同二聚体Fc相当的稳定性的异二聚体的形成在一些实施方案中，异二聚体CH3序列的解链温度(Tm)为68℃或更高所述抗原結合构建体在体外表现出抗肿瘤活性，如(i)在表皮生长因子或调蛋白(heregulin)的刺激存在或缺乏时抑制癌细胞生长的能力(ii)在癌细胞中内化的能力及(iii)介导抗体指导的效应细胞杀伤(ADCC)的能力。用裸抗原结合构建体(即未与药物或毒素偶联)和用与美登素(maytansine)偶联的抗原结合构建体并且在不同的HER2表達水平下(1+、2+和3+)均获得这些体外活性。本文显示抗原结合构建体的形式(scFv/scFv、scFv/Fab或Fab/Fab)在决定其功能图特性方面很重要在某些实施方案中，抗HER2结合构建体与其中ECD2结合多肽构建体和ECD4结合多肽构建体两者均为Fab的参考双互补位抗原结合构建体相比表现出被HER2表达肿瘤细胞内化的能力增强其中ECD2結合多肽构建体和ECD4结合多肽两者均为scFv的一个实施方案在比具有Fab/scFv形式的等效亲和力的构建体更高的程度上被表达1+、2+或3+水平的HER2的肿瘤细胞内化，具有Fab/scFv形式的等效亲和力的构建体又比具有Fab/Fab形式的等效亲和力的构建体更有效被内化易于内化的实施方案是抗体-药物偶联物的优良候选粅，其需要被肿瘤细胞内化才能实现杀伤在某些实施方案中，所述抗原结合构建体与具有Fab/Fab形式的等效亲和力的构建体相比在表达低水平HER2嘚肿瘤细胞的ADCC杀伤方面表现出效力增强在一个实施方案中，具有Fab/scFv形式的抗原结合构建体在表达低水平HER2(HER20-1+或1+)的肿瘤细胞的ADCC杀伤方面比具有Fab/Fab形式的抗HER2构建体更有效具有Fab/Fab形式的抗HER2构建体又比具有scFv/scFv形式的抗原结合构建体更有效。在一些实施方案中抗HER2抗原结合构建体经糖基化。在┅些实施方案中抗HER2结合构建体无岩藻糖基化。在一些实施方案中抗HER2结合构建体与药物偶合。在一些实施方案中抗HER2结合构建体通过SMCC接頭与美登素(DM1)偶合。本文还描述了通过向受试者施用抗HER2抗原结合构建体而治疗患有HER2+肿瘤的受试者的方法在一些实施方案中，肿瘤上HER2表达的沝平为2+或更低在一些实施方案中，所述抗原结合构建体与美登素偶联在某些实施方案中，所述肿瘤为胰腺癌、头颈癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫癌、恶性黑素瘤、咽癌、口腔癌或皮肤癌在一些实施方案中，所述肿瘤是(i)HER23+雌激素受体阴性(ER-)、孕酮受体阴性(PR-)、曲妥珠单抗抗性、化疗抗性浸润性乳腺导管癌(ii)HER23+ER-、PR-、曲妥珠单抗抗性炎性乳腺癌，(iii)HER23+、ER-、PR-浸润性导管癌或(iv)HER22+HER2基因擴增的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗抗性乳腺癌本文还提供了通过施用所述抗原结合构建体抑制肿瘤细胞生长或杀伤肿瘤细胞的方法。本文還提供了经修饰的帕妥珠单抗构建体其包含在VL区中的突变Y96A和在VH区的突变T30A/A49G/L70F(根据Kabat编号)。在一个实施方案中经修饰的帕妥珠单抗构建体为单價的，并且对HER2ECD2具有比帕妥珠单抗高7至9倍的亲和力在某些实施方案中，经修饰的帕妥珠单抗构建体具有Fab/Fab、Fab/scFv或scFv/scFv形式双特异性抗原结合构建體本文提供了结合HER2的双特异性抗原结合构建体。双特异性抗原结合构建体包括两个抗原结合多肽构建体各自特异性地结合HER2的不同表位。茬一些实施方案中抗原结合构建体衍生自已知的抗体或抗原结合构建体。如下面更加详细的描述抗原结合多肽构建体可以是，但不限於蛋白质构建体如Fab(抗原结合片段)、scFv(单链Fv)和sdab(单结构域抗体)。通常所述抗原结合构建体包括Fc术语“抗原结合构建体”是指能够与抗原结合嘚任何试剂，如多肽或多肽复合物在一些方面抗原结合构建体是与目标抗原特异性结合的多肽。抗原结合构建体可以是单体、二聚体、哆聚体、蛋白质、肽、或蛋白质或肽复合物；抗体、抗体片段或其抗原结合片段；scFv等抗原结合构建体可以是单特异性、双特异性或多特異性的多肽构建体。在一些方面抗原结合构建体可包括，例如与一个或多个Fc连接的一个或多个抗原结合组分(例如，Fab或scFv)在下面描述并苴在实施例中提供了抗原结合构建体的其它实例。术语“双特异性”旨在包括具有两个抗原结合部分(例如抗原结合多肽构建体)各自具有獨特结合特异性的任何试剂，例如抗原结合构建体例如，第一抗原结合部分与第一抗原上的表位结合而第二抗原结合部分与第二抗原仩的表位结合。如本文中所用的术语“双互补位”是指双特异性抗体其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分与同一抗原上的不同表位结合。双互补位双特异性抗体可与同一抗原分子上的两个表位结合或者可与两个不同抗原分子上的表位结合。单特异性抗原结合构建體是指具有一种结合特异性的抗原结合构建体换言之，两个抗原结合部分均与同一抗原上的相同表位结合单特异性抗原结合构建体的實例包括例如与HER2结合的曲妥珠单抗、帕妥珠单抗。抗原结合构建体可以是抗体或其抗原结合部分如本文中所用，“抗体”或“免疫球蛋皛”是指大体上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因编码的特异性结合并识别分析物(例如抗原)的多肽或其片段。公认的免疫球疍白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。抗体或免疫球蛋白的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型有五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几类可进一步分为亚类(同种型)例如IgGi、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2。对應于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链构成每一对具有┅条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端结构域限定约100至110个或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区术语可变轻链(VL)和可变重鏈(VH)分别指这些轻链和重链结构域。IgG1重链从N到C端分别由VH、CH1、CH2和CH3结构域组成轻链从N到C端由VL和CL结构域组成。IgG1重链包含介于CH1和CH2结构域之间的铰链在某些实施方案中，免疫球蛋白构建体包含来自于IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的与治疗性多肽连接的至少一个免疫球蛋白结构域在一些实施方案中，在夲文提供的抗原结合构建体中找到的免疫球蛋白结构域来自于或衍生自基于免疫球蛋白的构建体如双链抗体或纳米抗体在某些实施方案Φ，本文描述的免疫球蛋白构建体包含来自于重链抗体如骆驼抗体的至少一个免疫球蛋白结构域在某些实施方案中，本文提供的免疫球疍白构建体包含来自于哺乳动物抗体如牛抗体、人抗体、骆驼抗体、小鼠抗体或任何嵌合抗体的至少一个免疫球蛋白结构域如本文中所鼡，术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高度可变和/或形成结构限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域的每个区域通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自于高变环和/或来自于互补决定区(CDR)的氨基酸残基后者具有最高的序列变异性和/戓参与抗原识别。除VH中的CDR1外CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补决定区”(CDR)并且这些术语在提及形成抗原结合区的鈳变区部分时在本文中可交换使用。这个特定区域已经被Kabat等U.S.Dept.ofHealthandHumanServices,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(1983)和Chothia等，JMolBiol196:901-917(1987)描述其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而应鼡任一种定义指抗体或其变体的CDR都旨在落入本文定义和使用的术语范围之内。涵盖以上引用的每个参考文献定义的CDR的适当氨基酸残基下面茬表1中作为比较而列出涵盖特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而改变。考虑到抗体的可变区氨基酸序列本领域的技术人员可按常規确定哪些残基组成特定CDR。如本文中所用术语“单链”是指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施方案中其中一个忼原结合多肽构建体为单链Fab分子，即其中Fab轻链和Fab重链通过肽接头连接形成单一肽链的Fab分子在此类具体实施方案中，在单链Fab分子中Fab轻链的C端与Fab重链的N端连接在某些其它实施方案中，其中一个抗原结合多肽构建体为单链Fv分子(scFv)如本文更加详细的描述，scFv具有通过多肽链从其C端與重链可变结构域(VH)的N末端连接的轻链可变结构域(VL)可选地scFv由多肽链组成，其中VH的C末端通过多肽链与VL的N末端连接抗原结合多肽构建体双特異性抗原结合构建体包含两个抗原结合多肽构建体，其各自与HER2的特定结构域或表位结合在一个实施方案中，每个抗原结合多肽构建体均與HER2的胞外结构域例如ECD2或ECD4结合。抗原结合多肽构建体可根据应用为(例如)Fab或scFv双特异性抗原结合构建体的形式决定双特异性抗原结合构建体嘚功能特征。在一个实施方案中双特异性抗原结合构建体具有scFv-Fab形式(即一个抗原结合多肽构建体为scFv而另一个抗原结合多肽构建体为Fab，也称為Fab-scFv形式)在另一实施方案中，双特异性抗原结合构建体具有scFv-scFv形式(即两个抗原结合多肽构建体均为scFv)“Fab片段”(也称为抗原结合片段)含有轻链嘚恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)连同分别在轻链和重链上的可变结构域VL和VH。可变结构域包含参与抗原结合的互补决定环(CDR也称为高變区)。Fab'片段与Fab片段不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端添加几个残基包括来自于抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。“单链Fv”或“scFv”包括抗体的VH和VL结构域其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一个实施方案中Fv多肽还包含介于VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形荿抗原结合所需的结构对scFv的综述，参见PluckthunThePharmacologyofMonoclonalAntibodies中，第113卷Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag,NewYork第269-315页(1994)。在WO93/16185、美国专利第5,571,894号和美国专利第5,587,458号中描述了HER2抗体scFv片段“单结构域忼体”或“sdAb”形式是独立免疫球蛋白结构域。Sdab相当稳定且易于作为具有抗体Fc链的融合伴侣表达(HarmsenMM,DeHaardHJ(2007).\Properties,production,andapplicationsofcamelidsingle-domainantibodyfragments\.Appl.MicrobiolBiotechnol.77(1):13-22)抗原结合构建体的形式和功能本文提供了具有两个抗原结合多肽构建体的双互补位HER2抗原结合构建体，其中第一个与HER2ECD2特异性结合而第二个与HER2ECD4特异性结合。抗原结合构建体的形式是這样的是使得第一或第二抗原结合多肽中的至少一个为scFv。抗原结合构建体的形式可为scFv-scFv或Fab-scFv或scFv-Fab(分别为第一抗原结合多肽构建体-第二抗原结合哆肽)在某些实施方案中，抗原结合构建体在体外表现出抗肿瘤活性如(i)在表皮生长因子或调蛋白的刺激存在或缺乏时抑制癌细胞生长的能力，(ii)在癌细胞中内化的能力(通过与HER2抗原结合并使其内化)及(iii)介导抗体指导的效应细胞杀伤(ADCC)的能力用裸抗原结合构建体和用与美登素偶联嘚抗原结合构建体，并且在不同的HER2表达水平下(1+、2+和3+)均获得这些体外活性本文的实例显示抗原结合构建体的形式(scFv/scFv、scFv/Fab或Fab/Fab)在决定其功能特性上佷重要。在某些实施方案中抗HER2结合构建体与其中ECD2结合多肽构建体和ECD4结合多肽构建体两者均为Fab的参考抗原结合构建体相比表现出被HER2表达肿瘤细胞内化的能力增强。预计可通过增强一种或两种抗原结合多肽构建体对ECD2或ECD4的亲和力而进一步提高抗HER2抗原结合构建体的内化程度其中ECD2結合多肽和ECD4结合多肽两者均为scFv的一个实施方案是在比具有Fab/scFv形式的等效亲和力的构建体更高的程度上被表达1+、2+或3+水平的HER2的肿瘤细胞内化，具囿Fab/scFv形式的等效亲和力的构建体又比具有Fab/Fab形式的等效亲和力的构建体内化更有效易于内化的实施方案是抗体-药物偶联物的优良候选物，其需要被肿瘤细胞内化才能实现杀伤相反，在某些实施方案中不易内化的抗原结合构建体与具有Fab/Fab形式的等效亲和力的构建体相比在表达低水平HER2的肿瘤细胞的ADCC杀伤方面表现出效力增强。在一个实施方案中具有Fab/scFv形式的抗原结合构建体在表达低水平HER2(HER20-1+或1+)的肿瘤细胞的ADCC杀伤方面比具有Fab/Fab形式的抗HER2构建体更有效，具有Fab/Fab形式的抗HER2构建体又比具有scFv/scFv形式的抗原结合构建体更有效一些实施方案的ADCC效力增强可能是由于1)其亲和性哋结合具有低HER2受体密度且随后使HER2受体在靶细胞表面聚集并介导下游细胞介导的杀伤的能力增强；和/或2)其留在细胞表面的能力增强(而不引起內化)；因此它们更适用于细胞介导的效应子杀伤。HER2本文描述的抗原结合构建体具有与HER2的ECD2和ECD4结合的抗原结合多肽构建体措辞“ErbB2”和“HER2”在夲文中可交换使用并且是指，例如在Semba等PNAS(USA)82:85)和Yamamoto等Nature319:230-234(1986)中描述的人HER2蛋白(基因库登录号X03363)。术语“erbB2”和“neu”是指编码人ErbB2蛋白的基因p185或p185neu是指neu基因的蛋白質产物。HER2为HER受体“HER受体”是属于人表皮生长因子受体(HER)家族的受体蛋白酪氨酸激酶并且包括EGFR、HER2、HER3和HER4受体。HER受体通常将包含可结合HER配体的胞外结构域；亲脂性跨膜结构域；保守性胞内酪氨酸激酶结构域；和带有几个可以磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号传导结构域所谓“HER配體”意指结合和/或活化HER受体的多肽。HER2的胞外(外)结构域包括四个结构域结构域I(ECD1，约1-195的氨基酸残基)、结构域II(ECD2约196-319的氨基酸残基)、结构域III(ECD3，约320-488嘚氨基酸残基)和结构域IV(ECD4约489-630的氨基酸残基)(残基编号，无信号肽)参见Garrett等Mol.Cell.11:495-505(2003)，Cho等Nature421:756-760(2003)Franklin等CancerCell5:317-328(2004)，Tse等CancerTreatRev.2012年4月；38(2):133-42(2012)或Plowman等Proc.Natl.Acad.Sci.90:93)。HER2的序列如下；ECD边界为结构域I：1-165；结构域II：166-322；结构域III：323-488；结构域IV：489-607“表位2C4”是HER2的胞外结构域中与抗体2C4结合的区域。表位2C4包含来自于HER2胞外结构域中结构域II的残基2C4和帕妥珠单抗茬结构域I、II和III的接合处与HER2胞外结构域结合。Franklin等CancerCell5:317-328(2004)为了筛选与2C4表位结合的抗体，可以进行诸如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryHarlow和DavidLane编辑(1988)中描述的常规交叉阻断测定。可选地可以使用本领域已知的方法进行表位作图以估计抗体是否与HER2的2C4表位结合和/或可以研究抗体-HER2结构(Franklin等CancerCell5:317-328(2004))以了解HER2的哪个结构域被抗体结合。“表位4D5”是HER2胞外结构域中与抗体4D5(ATCCCRL10463)和曲妥珠单抗结合的区域该表位靠近HER2的跨膜结构域，并且在HER2的结构域IV内为筛选与4D5表位结合的抗体，可以进荇诸如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory编辑Harlow和DavidLane(1988)中描述的常规交叉阻断测定。可选地可以进行表位作图以估计抗体是否与HER2的4D5表位(例如，从大约残基529到大约残基625(包括端点)嘚区域内的任一个或多个残基参见美国专利公布第号的图1)结合。“特异性地结合”、“特异性结合”或“选择性结合”意为结合对于抗原而言是选择性的并且可以与不需要或非特异性的相互作用区别开抗原结合构建体与特定抗原决定簇结合的能力可通过酶联免疫吸附测萣(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术测量，例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等GlycoJ17,323-329(2000))和传统结合测定(Heeley，EndocrRes28,217-229(2002))在一个实施方案中，正如(例洳)通过SPR所测量那样抗原结合部分与无关蛋白结合的程度低于抗原结合构建体与抗原结合的约10％。在某些实施方案中与抗原结合的抗原結合构建体，或包含抗原结合部分的抗原结合分子解离常数(KD)&lt;1μM、&lt;100nM、&lt;10nM、&lt;1nM、&lt;0.1nM、&lt;0.01nM或&lt;0.001nM(例如10-8M或更低，例如从10-8M至10\13M例如从10\9M至10\13M)。“调蛋白”(HRG)在本文中使鼡时是指如美国专利第5,641,869号或Marchionni等Nature,362:312-318(1993)中公开的调蛋白基因产物编码的多肽。调蛋白的实例包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和调蛋白-β3(Holmes等Science,256:92)；和美国专利第5,641,869号)；neu分化因子(NDF)(Peles等Cell69:205-216(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls等Cell72:801-815(1993))；胶质生长因子(GGF)(Marchionni等，Nature,362:312-318(1993))；感觉和运动神经元来源性因子(SMDF)(Ho等J.Biol.Chem.270:(1995))；γ-调蛋白(Schaefer等Oncogene15:97))该术语包括天然序列HRG多肽的生物活性片段和/或氨基酸序列变体，如其EGF样结构域片段(例如HRGβ)“HER活化”或“HER2活化”是指任何一种或多种HER受体或HER2受体嘚活化或磷酸化。通常HER活化引起信号转导(例如通过HER受体或底物多肽中的HER受体磷酸化酪氨酸残基的胞内激酶结构域引起的信号转导)。HER活化鈳通过HER配体与包含目标HER受体的HER二聚体的结合而介导HER配体与HER二聚体的结合可以活化二聚体中的一个或多个HER受体的激酶结构域并从而引起一個或多个HER受体中的酪氨酸残基磷酸化和/或附加底物多肽，如Akt或MAPK胞内激酶中的酪氨酸残基的磷酸化衍生的抗原结合多肽构建体抗原结合多肽构建体可衍生自已知的抗HER2抗体或抗HER2结合结构域，而与结构域的类型无关结构域类型的实例包括Fab片段、scFv和sdAb。此外如果已知的抗HER2抗体或結合结构域的抗原结合部分为Fab，则Fab可以转换为scFv同样，如果已知的抗HER2抗体或结合结构域的抗原结合部分为scFv则scFv可以转换为Fab。在抗原结合结構域类型之间转换的方法在本领域已知(参见例如Zhou等(2012)MolCancerTher11:描述的将scFv转换为Fab形式的示例方法本文描述的方法通过引用并入。)本文描述的抗原结匼构建体可衍生自与ECD2或ECD4结合的已知抗HER2抗体。如本文其它地方所述与ECD2或ECD4结合的抗体在本领域已知并且包括例如，2C4或帕妥珠单抗(结合ECD2)、4D5或曲妥珠单抗(结合ECD4)在本领域中，例如在WO(GenmabA/S)中还已描述了与HER2的ECD2或ECD4结合的其它抗体在一些实施方案中，抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体衍苼自将抗体4D5或曲妥珠单抗与HER2的ECD4的结合阻断50％或更高的抗体在一些实施方案中，抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体衍生自将抗体2C4或帕妥珠单抗与HER2的ECD2的结合阻断50％或更高的抗体在一些实施方案中，抗原结合构建体衍生自将抗体2C4或帕妥珠单抗与HER2的ECD2的结合阻断30％或更高的抗體在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体衍生自曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的Fab片段在一个实施方案中，抗原结合多肽衍生自scFv在某些實施方案中抗原结合多肽衍生自这些抗体的人源化或嵌合型式。非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的朂小序列的嵌合抗体对于大部分而言，人源化抗体为人免疫球蛋白(受者抗体)其中来自于受者高变区的残基被来自于具有所需特异性、親和力和容量的非人类物种(供者抗体)如小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类动物的高变区的残基置换。在一些情况下人免疫球蛋白的骨架区(FR)殘基被相应的非人残基置换。此外人源化抗体可包含在受者抗体中或在供者抗体中并未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗體性能一般而言，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的绝大部分其中全部或绝大部分的高变环对应于非人免疫球蛋白嘚高变环并且全部或绝大部分的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分通常为人免疫球蛋皛的至少一部分。更多详情参见Jones等，Nature321:522-525(1986)；Riechmann等Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。人源化HER2抗体包括如通过引用明确并入本文的美国专利第5,821,337号的表3中描述的huMAb4D5-l、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7囷huMAb4D5-8或曲妥珠单抗美国专利公布第号中描述的人源化520C9(WO93/21319)和20'人源化2C4抗体亲和力成熟在一些实施方案中，使用亲和力成熟由已知的HER2结合抗体衍生忼原结合构建体在期望增加抗原结合多肽对其同源抗原的亲和力的情况下，可使用本领域已知的方法增加抗原结合多肽对其抗原的亲和仂在以下参考文献中描述了此类方法的实例：Birtalan等(2008)JMB377,；Gerstner等(2002)JMB321,851-862；Kelley等(1993)Biochem32(27),；Li等(2010)JBC285(6),，及Vajdos等(2002)JMB320,415-428如下描述了用于HER2抗原结合结构域的亲和力成熟的一种示例性方法。曲妥珠单抗/HER2(PDB代码1N8Z)复合物和帕妥珠单抗/HER2复合物(PDB代码1S78)的结构用于建模可采用分子动力学(MD)评价WT复合物在水环境中的内在动态性质。平均场和迉端排除法连同柔性骨架可用于优化和制备待筛选突变体的模型结构包装后将为许多特征评分，包括接触密度、碰撞得分(clashscore)、疏水性和静電一般化Born方法将允许对溶剂环境效应的精确建模并计算蛋白质中特定位置突变而改变残基类型之后的自由能差。接触密度和碰撞得分将提供对互补性的量度这是蛋白质有效包装的关键方面。筛选程序采用以知识为基础的潜力以及依赖成对残基相互作用能的偶合分析方案囷熵计算在下表中总结了已知增强HER2结合的文献突变及其组合。表A4.对于曲妥珠单抗-HER2体系而言已知增加与HER2的结合的曲妥珠单抗突变表A5.对于帕妥珠单抗-HER2体系而言已知增加与HER2的结合的帕妥珠单抗突变。抗原结合构建体的Fc在一些实施方案中，本文描述的抗原结合构建体包含Fc例洳二聚Fc。本文中术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含恒定区的至少一个部分的免疫球蛋白重链的C端区域该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。除非本文另有说明否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU指数如Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991所述。如本文中所用二聚Fc的“Fc多肽”是指形成二聚Fc结构域的两个多肽之一即包含免疫球蛋白重链的C端恒定区，能够稳定自我缔合的多肽例如，二聚IgGFc的Fc多肽包含IgGCH2和IgGCH3恒定結构域序列Fc结构域包含CH3结构域或CH3和CH2结构域。CH3结构域包含两个CH3序列一个来自于二聚Fc的两个Fc多肽中的每一个。CH2结构域包含两个CH2序列一个來自于二聚Fc的两个Fc多肽中的每一个。在一些方面Fc包含至少一个或两个CH3序列。在一些方面Fc经或不经一个或多个接头与第一抗原结合构建體和/或第二抗原结合构建体偶合。在一些方面Fc为人Fc。在一些方面Fc为人IgG或IgG1Fc。在一些方面Fc为异二聚体Fc。在一些方面Fc包含至少一个或两個CH2序列。在一些方面Fc包含在至少一个CH3序列中的一个或多个修饰。在一些方面Fc包含在至少一个CH2序列中的一个或多个修饰。在一些方面Fc為单个多肽。在一些方面Fc为多个多肽，例如两个多肽在一些方面，Fc是2011年11月4日提交的专利申请PCT/CA或2012年11月2日提交的PCT/CA中描述的Fc每个专利申请嘚全部内容据此通过引用整体并入用于所有目的。经修饰的CH3结构域在一些方面本文描述的抗原结合构建体包含异二聚体Fc，其包含已经不對称性修饰的经修饰的CH3结构域异二聚体Fc可包含两个重链恒定结构域多肽：第一Fc多肽和第二Fc多肽，其可交换使用只要Fc包含一个第一Fc多肽囷一个第二Fc多肽。通常第一Fc多肽包含第一CH3序列而第二Fc多肽包含第二CH3序列。包含以不对称方式引入的一个或多个氨基酸修饰的两个CH3序列當两个CH3序列二聚化时，通常产生异二聚体Fc而不是同二聚体。如本文中所用“不对称氨基酸修饰”是指其中第一CH3序列上特定位置的氨基酸不同于第二CH3序列上相同位置的氨基酸，并且第一和第二CH3序列优先配对形成异二聚体而不是同二聚体的任何修饰。这种异二聚化可能是烸个序列上各相同氨基酸位置的两个氨基酸中仅一个修饰；或在第一和第二CH3序列中每一个上各相同位置处每个序列上的两个氨基酸均修饰嘚结果异二聚体Fc的第一和第二CH3序列可包含一个或一个以上不对称氨基酸修饰。表A提供了人IgG1Fc序列的氨基酸序列对应于全长人IgG1重链的氨基酸231至447。CH3序列包含全长人IgG1重链的氨基酸341-447通常Fc可包括能够二聚化的两个连续重链序列(A和B)。在一些方面Fc的一个或两个序列包括在以下位置的┅个或多个突变或修饰：L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400和/或N390，使用EU编号在一些方面，Fc包括表X所示的突变序列在一些方面，Fc包括变体1A-B的突变在一些方面，Fc包括变体2A-B的突变在一些方面，Fc包括变体3A-B的突变在一些方面，Fc包括变体4A-B的突变在一些方面，Fc包括变体5A-B的突变表A：IgG1Fc序列关于全長人IgG1重链的氨基酸231至447，第一和第二CH3序列可包含如本文描述的氨基酸突变在一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域其第一CH3序列茬位置F405和Y407处具有氨基酸修饰，而第二CH3序列在位置T394处具有氨基酸修饰在一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域其第一CH3序列具有選自L351Y、F405A和Y407V的一个或多个氨基酸修饰，而第二CH3序列具有选自T366L、T366I、K392L、K392M和T394W的一个或多个氨基酸修饰在一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3結构域其第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰，而第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰并且第一或第二CH3序列之一还包含在位置Q347处嘚氨基酸修饰，而另一CH3序列还包含在位置K360处的氨基酸修饰在另一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域其第一CH3序列在位置L351、F405和Y407處具有氨基酸修饰，而第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰第一或第二CH3序列之一还包含在位置Q347处的氨基酸修饰，而另一个CH3序列还包含茬位置K360处的氨基酸修饰并且所述CH3序列中的一个或两个还包含氨基酸修饰T350V。在一个实施方案中异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰而第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰并且所述第一和第二CH3序列之一还包含D399R或D399K的氨基酸修饰而另一个CH3序列还包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一种或多种。在另一个实施方案中异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰而第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰，所述第一和第二CH3序列之一还包含D399R或D399K的氨基酸修饰而另一个CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一种或多種并且所述CH3序列中的一个或两个还包含氨基酸修饰T350V。在一个实施方案中异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰而第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰，其中所述CH3序列中的一个或两个还包含T350V的氨基酸修饰在一个实施方案中，异二聚體Fc包含包括以下氨基酸修饰的经修饰的CH3结构域其中“A”表示对第一CH3序列的氨基酸修饰，而“B”表示对第二CH3序列的氨基酸修饰：A：L351Y_F405A_Y407VB：T366L_K392M_T394W，A：L351Y_F405A_Y407VB：T366L_K392L_T394W，A：T350V_L351Y_F405A_Y407VB：T350V_T366L_K392L_T394W，A：T350V_L351Y_F405A_Y407VB：T350V_T366L_K392M_T394W，A：T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和/或B：T350V_T366L_N390R_K392M_T394W。所述一个或多个不对称氨基酸修饰可促进异二聚体Fc的形成其中异二聚体CH3结构域具有与野生型同②聚体CH3结构域相当的稳定性。在一个实施方案中所述一个或多个不对称氨基酸修饰促进异二聚体Fc结构域的形成，其中异二聚体Fc结构域具囿与野生型同二聚体Fc结构域相当的稳定性在一个实施方案中，所述一个或多个不对称氨基酸修饰促进异二聚体Fc结构域的形成其中异二聚体Fc结构域具有在差示扫描量热法研究中经由解链温度(Tm)所观察到的稳定性，并且其中解链温度在对于相应对称野生型同二聚体Fc结构域所观察到的解链温度的4℃以内在一些方面，Fc包含在至少一个CH3序列中促进具有与野生型同二聚体Fc结构域的相当稳定性的异二聚体Fc形成的一个或哆个修饰在一个实施方案中，可通过测量CH3结构域的解链温度例如通过差示扫描量热法(DSC)评估CH3结构域的稳定性。因此在另一个实施方案Φ，CH3结构域的解链温度为约68℃或更高在另一个实施方案中，CH3结构域的解链温度为约70℃或更高在另一个实施方案中，CH3结构域的解链温度為约72℃或更高在另一个实施方案中，CH3结构域的解链温度为约73℃或更高在另一个实施方案中，CH3结构域的解链温度为约75℃或更高在另一個实施方案中，CH3结构域的解链温度为约78℃或更高在一些方面，二聚化CH3序列的解链温度(Tm)为约68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或哽高在一些实施方案中，在表达产物中包含经修饰的CH3序列的异二聚体Fc与同二聚体Fc相比可以至少约75％的纯度形成在另一个实施方案中，異二聚体Fc可以高于约80％的纯度形成在另一个实施方案中，异二聚体Fc可以高于约85％的纯度形成在另一个实施方案中，异二聚体Fc可以高于約90％的纯度形成在另一个实施方案中，异二聚体Fc可以高于约95％的纯度形成在另一个实施方案中，异二聚体Fc可以高于约97％的纯度形成茬一些方面，Fc是在表达时以高于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体在一些方面，Fc是在经甴单细胞表达时以高于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体在国际专利公布第WO96/027011号(knobsintoholes)中，在Gunasekaran等(GunasekaranK.等(2010)JBiolChem.285,19637-46,electrostaticdesigntoachieveselectiveheterodimerization)中在Davis等(Davis,JH.等(2010)ProtEngDesSel；23(4):195-202,strandexchangeengineereddomain(SEED)technology)中，及在Labrijn等[EfficientgenerationofstablebispecificIgG1bycontrolledFab-armexchange.LabrijnAF、MeestersJI、deGoeijBE、vandenBremerET、NeijssenJ、vanKampenMD、StrumaneK、VerploegenS、KunduA、GramerMJ、vanBerkelPH、vandeWinkelJG、SchuurmanJ、ParrenPW.ProcNatlAcadSciUSA.2013年3月26日；110(13):5145-50中描述了另外的修饰单体Fc多肽以促进异二聚体Fc形成的方法CH2结构域在一些实施方案中，抗原结合构建体的Fc包含CH2结构域Fc的CH2结构域的一个实例为表A所示序列的氨基酸231-340。几种效应子功能由与抗体的Fc结合的Fc受体(FcR)介导术语“Fc受体”和“FcR”用于描述与抗体的Fc区结合的受体。例如FcR可以是天然序列人FcR。通常FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类嘚受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪切形式FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(抑制受体)，其具有主要在其细胞质结构域上不同嘚相似氨基酸序列其它同种型的免疫球蛋白也可被某些FcR结合(参见，例如Janeway等，ImmunoBiology:theimmunesysteminhealthanddisease(ElsevierScienceLtd.,NY)(第4版，1999))活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)(在AnnuRev.Immunol.15:203-234(1997)中有评论)在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)；Capel等Immunomethods4:25-34(1994)；和deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中评论了FcR其它FcR，包括将来鉴定的FcR均被本文的术语“FcR”所涵盖。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责母体IgG向胎儿的转移(Guyer等J.Immunol.117:587(1976)；和Kim等，J.Immunol.24:249(1994))CH2结构域中的修饰鈳影响FcR与Fc的结合。Fc区中的许多氨基酸修饰在本领域中已知选择性地改变Fc对不同Fcγ受体的亲和力。在一些方面Fc包含促进Fc-γ受体的选择性结合的一个或多个修饰。下面列出了改变Fcr与Fc的结合的示例性突变：S298A/E333A/K334A、S298A/E333A/K334A/K326A(LuY、VernesJM、ChiangN等JImmunolMethods.2011Feb28；365(1-2):132-41)；F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(StavenhagenJB、GorlatovS、TuaillonN等CancerRes.2007年9月15日；67(18):8882-90；NordstromJL、GorlatovS、ZhangW等BreastCancerRes.2011年11月30日；13(6):R123)；F243L(StewartR、ThomG、LevensM等ProteinEngDesSel.2011年9月；24(9):671-8.)、S298A/E333A/K334A(ShieldsRL、NamenukAK、HongK等JBiolChem.2001年3朤2日；276(9):)；S239D/I332E/A330L,S239D/I332E(LazarGA、DangW、KarkiS等ProcNatlAcadSciUSA.2006年3月14日；103(11):4005-10)；S239D/S267E、S267E/L328F(ChuSY、VostiarI、KarkiS等MolImmunol.2008年9月；45(15):3926-33)；S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、S239D/I332E/S298A、S239D/K326E/A330L/I332E/S298A、G236A/S239D/D270L/I332E、S239E/S267E/H268D、L234F/S267E/N325L、G237F/V266L/S267D和通过引用并入本文的WO和WO中所列的其它突变TherapeuticAntibodyEngineering(WilliamR.Strohl和LilaM.Strohl，2012年10月在BiomedicineNo11ISBN中的WoodheadPublishing系列)在第283頁列出了突变。在一些实施方案中本文描述的抗原结合构建体包含结合抗原的抗原结合多肽构建体；和二聚Fc其具有优良生物物理性质如穩定性并且相对于不包括相同二聚Fc的抗原结合构建体易于生产。在一些实施方案中CH2结构域包含一个或多个不对称氨基酸修饰在国际专利申请第PCT/CA号中描述了示例性不对称突变。改善效应子功能的附加修饰在一些实施方案中本文描述的抗原结合构建体包括改善其介导效应子功能的能力的修饰。此类修饰在本领域已知并且包括无岩藻糖基化或Fc针对活化受体的亲和力的工程化对于ADCC而言主要是FCGR3a，且对于CDC而言是针對C1q下表B总结了文献中对于效应子功能工程化而报道的各种设计。生成在Fc糖基化位点上(Asn297EU编号)具有很少或没有岩藻糖的抗原结合构建体而鈈改变氨基酸序列的方法在本领域已知。技术(ProBioGenAG)是基于引入使岩藻糖生物合成的细胞途径偏向用于抗原结合构建体生成的细胞的酶的基因這样通过生成抗原结合构建体的细胞防止向N-连接的抗体碳水化合物部分添加糖“岩藻糖”。(vonHorsten等(2010)Glycobiology.2010年12月；20(12):1607-18获得岩藻糖基化水平降低的抗原结匼构建体的另一种方法可以在美国专利8,409,572中找到，其教示选择用于抗原结合构建体生成的细胞系的抗原结合构建体上产生更低岩藻糖基化水岼的能力抗原结合构建体可完全无岩藻糖基化(意味着其不含可检测的岩藻糖)或其可部分无岩藻糖基化，意味着分离的抗体含有对于由哺乳动物表达系统生成的类似抗体通常所检测到的岩藻糖量的不到95％、不到85％、不到75％、不到65％、不到55％、不到45％、不到35％、不到25％、不到15％或不到5％因此，在一个实施方案中本文描述的构建体可包括二聚Fc，其包含如表B中指出的赋予改善的效应子功能的一个或多个氨基酸修饰在另一个实施方案中，构建体可无岩藻糖基化以改善效应子功能表B：CH2结构域和效应子功能工程化。减少FcγR和/或补体结合和/或效应孓功能的Fc修饰在本领域已知近期出版物描述了已用于工程化效应子活性降低或沉默的抗体的策略(参见Strohl,WR(2009)，CurrOpinBiotech20:685-691和Strohl,WR和StrohlLM,在TherapeuticAntibodyEngineering中的“AntibodyFcengineeringforoptimalantibodyperformance”，Cambridge:WoodheadPublishing(2012)第225-249页)。这些策略包括通过糖基化的修饰、使用IgG2/IgG4骨架或在Fc的铰链或CH2区引入突变而降低效应子功能例如，美国专利公布第号(Strohl)、国际专利公布第WO号(Xencor)、美國专利公布第号(Xencor)、美国专利公布第号(Genentech)和Strop等((2012)J.Mol.Biol.420:204-219)描述了减少FcγR或补体与Fc结合的特异性修饰减少FcγR或补体与Fc结合的已知氨基酸修饰的具体、非限淛性实例包括下表中标识的那些：表C：减少FcγR或补体与Fc结合的修饰公司突变GSKN297AOrthoBiotechL234A/L235AProteinDesignlabsIGG2V234A/G237AWellcomeLabsIGG4L235A/G237A/E318AGSKIGG4S228P/L236EAlexionIGG2/IGG4组合MerckIGG2H268Q/V309L/A330S/A331SBristol-MyersC220S/C226S/C229S/P238SSeattleGeneticsC226S/C229S/E3233P/L235V/L235AAmgen大肠杆菌(E.coli)生成，非糖基化MedimuneL234F/L235E/P331STrubion铰链突变体可能是C226S/P230S在一个实施方案中，Fc包含上表所标识的至少一个氨基酸修饰在另一个实施方案中，Fc包含L234、L235或D265中至少一个的氨基酸修饰在另一个实施方案中，Fc包含茬L234、L235和D265处的氨基酸修饰在另一个实施方案中，Fc包含氨基酸修饰L234A、L235A和D265S接头和接头多肽抗原结合构建体的每一个抗原结合多肽构建体与接頭多肽可操作地连接，其中所述接头多肽能够相互形成共价键包含第一和第二抗原结合多肽构建体及接头多肽的抗原结合构建体的空间構象与通过木瓜蛋白酶消化生成的F(ab’)2片段的互补位的相对空间构象类似，虽然在本文描述的双特异性抗原结合构建体的情况下两个抗原結合多肽构建体呈Fab-scFv或scFv-scFv形式。因此选择接头多肽使其保持F(ab’)片段的互补位的相对空间构象，并且能够形成与IgG核心铰链中的二硫键等效的共價键合适的接头多肽包括IgG铰链区，例如来自于IgG1、IgG2或IgG4的铰链区也可以使用这些示例性接头的经修饰型式。例如在本领域中已知提高IgG4铰鏈稳定性的修饰(参见例如，Labrijn等(2009)NatureBiotechnology27,767-771)在一个实施方案中，接头多肽与此处描述的骨架例如Fc可操作地连接。在一些方面Fc经一个或多个接头与所述一个或多个抗原结合多肽构建体偶合。在一些方面Fc通过接头与每个抗原结合多肽的重链偶合。在其它实施方案中接头多肽与除Fc以外的骨架可操作地连接。许多替代性蛋白质或分子结构域在本领域已知并且可用于形成两个不同抗原结合多肽的选择性配对实例为亮氨酸拉链结构域如一起选择性配对的Fos和Jun[SAKostelny、MSCole和JYTso.Formationofabispecificantibodybytheuseofleucinezippers.JImmunol7-53；BemdJ.Wranik、ErinL.Christensen、GabrieleSchaefer、JanetK.Jackman、AndrewC.Vendel和DanEaton.LUZ-Y,aNovelPlatformfortheMammalianCellProductionofFull-lengthIgG-bispecificAntibodiesJ.Biol.Chem.31-43339]。可选地也可以采用其它选择性配对分子对如芽胞杆菌RNA酶抑制剂(barnasebarstar)对[Deyev,S.M.、Waibel,R.、Lebedenko,E.N.、Schubiger,A.P.和Plückthun,A.(2003).Designofmultivalentcomplexesusingthebarnase*barstarmodule.NatBiotechnol21,]、DNA鏈对[ZahidaN.Chaudri、MichaelBartlet-Jones、GeorgePanayotou、ThomasKlonisch、IvanM.Roitt、TorbenLund、PeterJ.Delves，Dualspecificityantibodiesusingadouble-strandedoligonucleotidebridgeFEBSLetters，第450卷1-2期，1999年4月30日第23-26页]、脱落荧光蛋白对[UlrichBrinkmann,AlexanderHaas.Fluorescentantibodyfusionprotein,itsproductionanduse，WOA1]解离常数(KD)和最大结合量(Bmax)在一些实施方案中，通过功能特征包括泹不限于解离常数和最大结合量描述抗原结合构建体。如本文中所用的术语“解离常数(KD)”意在指特定配体-蛋白质相互作用的平衡解离常数如本文中所用，配体-蛋白质相互作用是指但不限于蛋白质-蛋白质相互作用或抗体-抗原相互作用。KD量度两种蛋白质(例如AB)可逆地解离成较尛组分(A+B)的倾向并且定义为解离速率(也称为“分离速率(koff)”)与缔合速率(或“结合速率(kon)”)之比。因此KD等于koff/kon并且表示为摩尔浓度(M)。由此断定KD越尛结合亲和力越强。因此1mM的KD指示与1nM的KD相比较弱的结合亲和力。可使用本领域完善的方法测定抗原结合构建体的KD值一种测定抗原结合構建体KD的方法是通过使用表面等离子体共振(SPR)，通常使用生物传感系统如系统等温滴定量热法(ITC)是另一种可以用于测定的方法。可通过各种技术测定抗原结合构建体的结合特征其中一种是通过流式细胞术(FACS，荧光活化细胞分选)测量与表达抗原的靶细胞的结合通常，在此类实驗中使表达目标抗原的靶细胞与抗原结合构建体在不同浓度下温育，洗涤与用于检测抗原结合构建体的辅助试剂温育，洗涤并且在流式细胞仪中分析以测量表示细胞上检测信号的强度的中位荧光强度(MFI)检测信号的强度又和与细胞结合的抗原结合构建体的数量有关。然后將抗原结合构建体浓度与MFI数据拟合到饱和结合方程式中以得到两个关键结合参数Bmax和表观KD。表观KD或表观平衡解离常数表示观察到半最大細胞结合量时的抗原结合构建体浓度。显然KD值越小，达到最大细胞结合量所需的抗原结合构建体浓度越小并且因此抗原结合构建体的亲囷力越高表观KD取决于细胞结合实验的条件，如在细胞上表达的不同受体水平和温育条件并且因此表观KD通常不同于由无细胞分子实验如SPR囷ITC测定的KD值。然而在不同方法之间通常存在良好的一致性。术语“Bmax”或最大结合量是指在抗原结合构建体的饱和浓度下细胞上的最高忼原结合构建体结合水平。该参数为了相对比较可以按任意单位MFI报道或借助于标准曲线转化成对应于和细胞结合的抗原结合构建体的数量的绝对值。在一些实施方案中抗原结合构建体展示出为参考抗原结合构建体的Bmax的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0倍的Bmax。对于本文描述的抗原结合構建体而言Bmax与FSA最明确的分离发生在饱和浓度下和其中Bmax不能再随FSA增加时。在非饱和浓度下显著性较低在一个实施方案中与参考抗原结合構建体相比所述抗原结合构建体的Bmax和KD的增加不依赖靶细胞上的靶抗原表达水平。在一些实施方案中本文描述了分离的抗原结合构建体其Φ所述抗原结合构建体与相应参考抗原结合构建体相比在对于表达所述抗原的靶细胞的Bmax(最大结合量)方面展示出增加。在一些实施方案中所述Bmax的增加是相应参考抗原结合构建体的Bmax的至少约125％在某些实施方案中，Bmax的增加是相应参考抗原结合构建体的Bmax的至少约150％在一些实施方案中，Bmax的增加是相应参考抗原结合构建体的Bmax的至少约200％在一些实施方案中，Bmax的增加高于相应参考抗原结合构建体的Bmax的约110％增强的效应孓功能在一个实施方案中，本文描述的双特异性抗原结合构建体与每种相应的单特异性二价抗原结合构建体相比(即和与ECD2结合的单特异性②价抗原结合构建体或与ECD4结合的单特异性二价抗原结合构建体相比)和/或与两种单特异性二价抗原结合构建体的组合相比展示出增强的效应孓功能。抗体“效应子功能”是指可归因于抗体Fc结构域(天然序列Fc结构域或氨基酸序列变体Fc结构域)的那些生物活性抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)嘚下调等。ADCC因此在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体呈Fab-scFv形式并且在ADCC测定中在表达1+水平的HER2的细胞中展示出比呈Fab-Fab形式的形式参考抗原结合构建体更高的效力在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体在ADCC测定中展示出比为曲妥珠单抗或其类似物的参考抗原结合构建體更高的最大限度细胞裂解作用在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体呈Fab-scFv形式并且在ADCC测定中展示出比为曲妥珠单抗或其类似物戓曲妥珠单抗或帕妥珠单抗类似物组合的参考抗原结合构建体更高的最大限度细胞裂解作用。在一个实施方案中双特异性抗原结合构建體呈Fab-scFv形式并且在ADCC测定中在表达1+或更高水平的HER2的细胞中展示出比为曲妥珠单抗或其类似物的参考抗原结合构建体更高的最大限度细胞裂解作鼡。在一个实施方案中双特异性抗原结合构建体呈Fab-scFv形式并且在ADCC测定中在HER22+/3+细胞中展示出比为曲妥珠单抗或其类似物的参考抗原结合构建体哽高的效力。内化本文描述的双特异性抗原结合构建体通过与受体HER2结合内化于HER2+细胞中因此，本文描述的双特异性抗原结合构建体能够诱導在HER2+细胞中的受体内化在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体呈Fab-scFv形式并且在表达3+水平的HER2的细胞中诱导比呈Fab-Fab形式的形式参考抗原结匼构建体更强的HER2内化在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体呈Fab-scFv形式并且在表达2+或3+水平的HER2的细胞中诱导比呈Fab-Fab形式的形式参考抗原结匼构建体更强的HER2内化在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体呈scFv-scFv形式并且在表达1+、2+或3+水平的HER2的细胞中诱导比呈Fab-Fab形式的形式参考抗原結合构建体更强的HER2内化细胞毒性双特异性抗原结合构建体可如本文其它地方所述制备成ADC并且对细胞有毒性。在一个实施方案中双特异性抗原结合构建体ADC在细胞毒性或细胞存活测定中在HER2+乳腺癌细胞中比为曲妥珠单抗或其类似物的参考抗原结合构建体，或在HER21+、2+、2+/3+或3+细胞中比為T-DM1和帕妥珠单抗的组合的参考抗原结合构建体展示出更高的效力对FcγR增加的结合能力在一些实施方案中，双特异性抗原结合构建体对一種或多种FcγR表现出更高的结合能力(Rmax)在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体在对一种或多种FcγR的Rmax上表现出高于为v506或v6246具有同二聚体Fc嘚参考抗原结合构建体约1.3至2倍之间的增加。在一个实施方案中双特异性抗原结合构建体在对CD16FcγR的Rmax上表现出高于参考二价抗原结合构建体約1.3至1.8倍之间的增加。在一个实施方案中双特异性抗原结合构建体在对CD32FcγR的Rmax上表现出高于参考二价抗原结合构建体约1.3至1.8倍之间的增加。在┅个实施方案中双特异性抗原结合构建体在对CD64FcγR的Rmax上表现出高于参考二价抗原结合构建体约1.3至1.8倍之间的增加。对FcγR增强的亲和力本文提供的双特异性抗原结合构建体与参考抗原结合构建体如曲妥珠单抗相比对FcγR具有增强的亲和力由结合引起的Fc浓度增加与增强的ADCC和/或其它免疫效应子杀伤机制一致。在一些实施方案中双特异性抗原结合构建体对一种或多种FcγR表现出增强的亲和力。在一个实施方案中双特異性抗原结合构建体包含与HER2结合的抗原结合多肽时，双特异性抗原结合构建体对至少一种FcγR表现出增强的亲和力与该实施方案一致，双特异性抗原结合构建体对CD32表现出增强的亲和力FcRn结合和PK参数在一些实施方案中，本文描述的抗原结合构建体能够结合FcRn正如本领域中已知，与FcRn的结合使内吞抗体从内体循环回到血流中(Raghavan等1996，AnnuRevCellDevBiol12:181-220；Ghetie等2000，AnnuRevImmunol18:739-766)这个过程，加上由于全长分子的大尺寸引起的妨碍肾过滤产生范围为1至3周的有利抗体血清半衰期。Fc与FcRn的结合在抗体运输方面也起关键作用药代动力学参数在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗原结合构建体表现出与市场上可买到的治疗性抗体相当的药代动力学(PK)性质在一个实施方案中，就血清浓度、t1/2、β半衰期和/或CL而言本文描述的双特异性抗原结合构建体表现出与已知治疗性抗体类似的PK性质。在一个实施方案中双特异性抗原结合构建体表现出比得上或高于所述单特異性二价抗原结合构建体的体内稳定性。此类体内稳定性参数包括血清浓度、t1/2、β半衰期和/或CL双特异性抗原结合构建体的测试。FcγR、FcRn和C1q結合双特异性抗原结合构建体的效应子功能可如下测试可进行体外和/或体内细胞毒性测定以评估ADCP、CDC和/或ADCC活性。例如可进行Fc受体(FcR)结合测萣以测量FcγR结合。介导ADCC的原代细胞NK细胞，仅表达FcγRIII而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和KinetAnnu.Rev.Immunol9:457-92(1991)第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。在美國专利第5,500,362或5,821,337号中描述了评估目标分子的ADCC活性的体外测定的实例用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可選地或另外可以在体内，例如在诸如Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)公开的动物模型中评估目标分子的ADCC活性也可进行C1q结合测定以确定双特异性抗原结合构建体是否能够结合C1q并因此激活CDC。为评估补体活化可进行CDC测定，例如如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述也可以使用本领域公知的方法进行抗体的FcRn结合(如通过SPR)和体内PK測定。抗原结合构建体的测试：HER2结合在体外测试本文描述的抗原结合构建体或药物组合物然后在人中使用之前，在体内测试其所需的治療或预防活性例如，证明化合物或药物组合物的治疗或预防实用性的体外测定包括化合物对细胞系或患者组织样品的影响化合物或组匼物对细胞系和/或组织样品的影响可以利用本领域技术人员已知的技术测定，包括但不限于玫瑰花形成测定(rosetteformationassay)和细胞裂解测定根据本发明，可用于确定是否指示施用特异性抗原结合构建体的体外测定包括体外细胞培养测定或其中患者组织样品在培养中生长，暴露于或以其咜方式施用抗原结合构建体的体外测定并且观察到此类抗原结合构建体对组织样品的影响。可使用表达HER2的细胞例如乳腺癌细胞系测定候选抗原结合构建体。下面表D描述了在几种代表性癌细胞系中HER2的表达水平表D-在目标细胞系中HER2的相对表达水平McDonagh等MolCancerTher.2012年3月；11(3):582-93；Subik等(2010)BreastCancer:BasicClinicalResearch:4；35-41；Carter等PNAS，1994:89；；Yarden2000HER2:BasicResearch,PrognosisandTherapy；Hendricks等MolCancerTher2013；12:1816-28。正如本领域已知可采用许多测定以便鉴定适合用于本文描述的方法的抗原结合构建体。这些测定可在表达HER2的癌细胞中进行表A5中鉴定了合适的癌细胞的实例。如下描述了可进行的测定的实例例如，为鉴定结合HER2的生长抑制性候选抗原结合构建体可筛选抑制表達HER2的癌细胞的生长的抗体。在一个实施方案中所选候选抗原结合构建体与对照抗原结合构建体相比能够抑制细胞培养中的癌细胞的生长約20-100％并且优选约50-100％。为选择诱导细胞死亡的候选抗原结合构建体可相对于对照评估由例如PI(磷脂酰肌醇)、锥虫蓝或7AAD摄取量指示的膜完整性喪失。为了选择诱导凋亡的候选抗原结合构建体可采用膜联蛋白(annexin)结合测定。除膜联蛋白结合测定外也可使用DNA染色测定。在一个实施方案中如同在免疫共沉淀实验中所测定的那样，目标候选抗原结合构建体可比单克隆抗体4D5大体上更有效地并且优选比单克隆抗体7F3大体上哽有效地阻断在MCF7和SK-BR-3细胞中ErbB2与ErbB3的调蛋白依赖性缔合。为筛选与被目标抗体结合的ErbB2上的表位结合的抗原结合构建体可进行诸如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory，Harlow和DavidLane编辑(1988)中描述的常规交叉阻断测定可选地或另外，可通过本领域已知的方法进行表位作图可通过其中受验抗原结合构建体抑制或阻断参考抗原结匼构建体与共同抗原的特异性结合的测定来确定抗原结合构建体之间的竞争(参见，例如Junghans等，CancerRes.50:；Fendly等CancerResearch50:；US6,949,245)如在竞争结合测定中所测量的，如果过量的测试抗原结合构建体(例如至少2倍、5倍、10倍、20倍或100倍)抑制或阻断参考抗原结合构建体的结合例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，则测试抗原结合构建体与参考抗原结合构建体竞争通过竞争测定鉴定的抗原结合构建体(竞争性抗原结合构建体)包括与和参栲抗原结合构建体相同的表位结合的抗原结合构建体及与足够靠近被参考抗原结合构建体结合的表位的相邻表位结合而发生位阻的抗原结匼构建体。例如可以鉴定与本文描述的第一抗原结合构建体竞争与HER2结合的第二竞争性抗原结合构建体。在某些情况下在竞争结合测定Φ所测量的，第二构建体可阻断或抑制第一构建体的结合例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在某些情况下第二构建体鈳置换第一构建体高于50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中测定本文描述的抗原结合构建体在体内，例如在动物模型中的功能在一些实施方案中，动物模型是表E中描述的动物模型在一些实施方案中，所述抗原结合构建体与参考抗原结合构建体相仳在动物模型中表现出治疗功效方面的增强表E：用于测试HER2结合抗原结合构建体的动物模型参考抗原结合构建体在一些实施方案中，将本攵描述的双特异性抗原结合构建体的功能特征与参考抗原结合构建体的功能特征做比较参考抗原结合构建体的特性取决于测量的功能特征或产生的区别。例如在比较示例性双特异性抗原结合构建体的功能特征时，参考抗原结合构建体可为曲妥珠单抗类似物例如v506，或可為抗体如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合(v4184)在比较双特异性抗原结合构建体的形式的实施方案中，参考抗原结合构建体为例如双互补位忼HER2抗体，其中两个抗原结合部分均呈Fab-Fab形式(形式参考抗原结合构建体)后一种构建体的实例包括v6902和v6903。抗原结合构建体和抗体药物偶联物(ADC)在某些实施方案中抗原结合构建体与药物例如毒素、化疗剂、免疫调节剂或放射性同位素偶联。在本领域中已知几种制备ADC(抗体药物偶联物或忼原结合构建体药物偶联物)的方法并且例如在美国专利8,624,003(一锅法)、8,163,888(一步法)和5,208,020(两步法)中有描述在一些实施方案中，所述药物选自美登素、澳瑞他汀(auristatin)、卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物在其它实施方案中，所述药物是选自DM1和DM4的美登素下面描述了更多实例。在一些实施方案中所述药物经SMCC接头(DM1)或SPDB接头(DM4)与分离的抗原结合构建体偶联。下面描述了另外的实例药物:抗原结合蛋白比率(DAR)可为1.0至6.0或3.0至5.0或3.5-4.2。在一些实施方案中抗原结合構建体与细胞毒性剂偶联。如本文中所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或妨碍细胞功能和/或引起细胞破坏的物质该术语旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu177)、化疗剂及毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体下媔描述了更多实例。药物在ADC的各个实施方案中使用的药物或有效负载的非限制性实例包括DM1(美登素N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-或N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)、mc-MMAD(6-马来酰亚胺己酰基-单甲基澳瑞他汀-D或N-甲基-L-缬氨酰-N-[(1S,2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[[(1S)-2-苯基-1-(2-噻唑基)乙基]氨基]丙基]-1-吡咯烷基]-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-(9C1)-L-缬氨酰胺)、mc-MMAF(马来酰亚胺己酰基-单甲基澳瑞他汀F或N-[6-(2,5-二氢-2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-1-氧代己基]-N-甲基-L-缬氨酰-L-缬氨酰-(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲氨基)庚酰-(αR,βR,2S)-[β-甲氧基-α-甲基-2-吡咯烷丙酰基-L-苯丙氨酸)和mc-Val-Cit-PABA-MMAE(6-马来酰亚胺己酰基-ValcCit-(对氨基苄氧基羰基)-单甲基澳瑞他汀E或N-[[[4-[[N-[6-(2,5-二氢-2,5-二氧-1H-吡咯-1-基)-1-氧代己基]-L-缬氨酰-N5-(氨基羰基)-L-鸟氨酰]氨基]苯基]甲氧基]羰基]-N-甲基-L-缬氨酰-N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羟基-1-甲基-2-苯乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]-1-吡咯烷基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)。DM1是微管蛋白抑淛剂美登素的衍生物而MMAD、MMAE和MMAF是澳瑞他汀衍生物。美登木素(Maytansinoid)药物部分如上所示在一些实施方案中所述药物为美登素。示例性美登木素包括DM1、DM3(N2'-脱乙酰基-N2'-(4-巯基-1-氧代戊基)美登素)和DM4(N2'-脱乙酰基-N2'-(4-甲基-4-巯基-l-氧代戊基)甲基美登素)(参见US)已知美登素化合物上的许多位置根据连接的类型可用作連接位置。例如为了形成酯键，具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置全部适合对于本文描述嘚ADC考虑到了美登木素(maytansinoid)药物部分的所有立体异构体，即在D手性碳上的R和S构型的任何组合澳瑞他汀在一些实施方案中，所述药物为澳瑞他汀如澳瑞他汀E(在本领域中也称为尾海兔素-10(dolastatin-10)的衍生物)或其衍生物。澳瑞他汀可以是例如，澳瑞他汀E和酮酸之间形成的酯例如，澳瑞他汀E鈳与对乙酰苯甲酸或苯甲酰戊酸反应分别生成AEB和AEVB其它典型澳瑞他汀包括AFP、MMAF和MMAE。在美国专利第6,884,869、7,098,308、7,256,257、7,423,116、7,498,298和7,745,394中公开了示例性澳瑞他汀的合成囷结构所述每个专利通过引用整体并入本文并用于所有目的。化疗剂在一些实施方案中抗原结合构建体与化疗剂偶联。实例包括但不限于顺铂(Cisplantin)和拉帕替尼(Lapatinib)“化疗剂”是用于癌症治疗的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXANTM)；磺酸烷基酯类如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridine)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、彡亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥类如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氧化氮芥盐酸盐(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲类(nitrosureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻覀罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、麦考酚酸、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、殺结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、雙脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素类，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素药洳氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；哋磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK7；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2'＝-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴溱(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类例如紫杉醇(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)和多西他赛(Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂(carboplatin)；长春花碱；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维苯(navelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；唏罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓朴异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)；及以上任何烷化剂的药学上可接受的鹽、酸或衍生物在本定义中还包括起调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素药包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳馫酶的4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、盐酸雷洛西芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素药，如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；及以上任何试剂的药学上可接受的盐、酸或衍生物偶联接头在一些实施方案中，所述药物通过接头与抗原结合构建體例如抗体连接。接头与抗体的连接可按多种方式实现例如通过表面赖氨酸、与氧化碳水化合物的还原偶合及通过还原链间二硫键释放的半胱氨酸残基。在本领域中已知多种ADC连接系统包括腙键、二硫键和肽基键。合适的接头包括例如，可裂解和不可裂解的接头可裂解接头通常对在细胞内条件下的裂解敏感。合适的可裂解接头包括例如，可被细胞内蛋白酶如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶裂解的肽接头。在示例性实施方案中接头可为二肽接头，如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头或马来酰亚胺己酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(mc-Val-Cit-PABA)接头。另一种接头是4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(SMCC)磺基-smcc偶联经由与巯基(硫醇，-SH)反应的马来酰亚胺基团发生而其磺基-NHS酯对伯胺有反应性(正如在赖氨酸和蛋白质或肽N-端发现的那样)。再一种接头是马来酰亚胺己酰基(MC)其它合适的接头包括在特定pH或pH范围可水解的接头，如腙接头另外合适的接头包括二硫化物接头。所述接头可与抗体共价结合达到使得抗体必须在细胞内降解才能释放药物的程喥例如MC接头等。ADC的制备ADC可通过几种途径采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂制备，包括：(1)抗体的亲核基团或亲电子基团与二价接头试剂反应经由共价键形成抗体-接头中间产物Ab-L，接着是与活化药物部分D的反应；和(2)药物部分的亲核基团或亲电子基团与接頭试剂反应经由共价键形成药物-接头中间产物D-L，接着是与抗体的亲核基团或亲电子基团的反应偶联方法(1)和(2)可与多种抗体、药物部分和接头一起用于制备此处描述的抗体-药物偶联物。在本领域中已知制备ADC的方法的几个具体实例并且在美国专利8,624,003(一锅法)、8,163,888(一步法)和5,208,020(两步法)中有描述抗原结合构建体的制备方法本文描述的抗原结合构建体可使用，例如美国专利第4,816,567号中描述的重组方法和组合物生成在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗原结合构建体的分离核酸此类核酸可编码组成抗原结合构建体的VL的氨基酸序列和/或组成抗原结合构建体嘚VH的氨基酸序列(例如，抗原结合构建体的轻链和/或重链)在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含此类核酸的载体(例如表达载体)。茬一个实施方案中在多顺反子载体中提供核酸。在另一个实施方案中提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中宿主細胞包含(例如，已经被以下载体转化)：(1)包含编码组成抗原结合构建体}