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　　女64岁。主因“双下肢浮肿1姩余”于2004年3月20日入院。患者1年前无明显诱因出现双下肢水肿未引起重视，亦未治疗2003年5月因水肿加重，至当地医院治疗查尿蛋白++++，紅细胞3~4个/高倍视野白细胞0~1个/高倍视野，诊为“急性肾炎”予青霉素等治疗，水肿无明显缓解以后间断口服中药治疗，双下肢水肿时輕时重为明确诊断及进一步治疗，2004年3月15日至本院就诊门诊查尿蛋白++++，红细胞0~2个/高倍视野血清总蛋白50g/，白蛋白24g/24小时尿蛋白定量5.42g。血肌酐72µmmo/尿素氮5.3mmo/。诊为“肾病综合征”并收入住院入院时症见：双下肢可凹性水肿，腰酸乏力，口干口苦，纳差小便偏黄，大便正瑺既往体健，无糖尿病等病史中国中医科学院广安门医院肾病科占永立
　　查体：T36.8℃，BP150/100mmHg神清，精神可眼睑不肿，咽部淡红扁桃體无肿大，心界不大双肺呼吸音清晰，腹软肝脾未扪及，双肾区叩击痛（±），双下肢可凹性水肿，神经生理反射存在，未引出病理反射。舌质暗红，苔稍黄腻，脉细滑略数。
　　入院诊断：慢性肾小球肾炎肾病综合征，肾性高血压
　　诊疗经过：入院后予益气养陰、清热利湿中药日1剂。处方：生黄芪30g、黄精30g、生地12g、丹皮12g、山萸肉12g、茯苓12g、泽泻12g、准山药12g、知母12g、黄柏12g、车前草30g2004年3月29日在B超引导下行腎活检术。光镜：肾穿刺组织可见24个肾小球1个球性硬化，其余肾小球基底膜弥漫增厚节段性钉突形成，上皮下嗜复红蛋白沉积肾小管上皮细胞重度空泡变性，灶状崩解脱落伴再生肾间质轻度水肿，灶状淋巴和单核细胞浸小动脉壁增厚。免疫荧光：IgG+++、IgA-、IgM+、C3++、C1q-、FRA+、Ab-電镜：GBM间断性钉突状增厚，钉突间可见电子致密物沉积上皮细胞足突广泛融合。结合光镜、电镜及免疫荧光检查肾脏病理诊断为Ⅱ期膜性肾病。根据临床与病理结果为决定下一步治疗方案于2004年4月2日进行病例讨论。

　　2、病历讨论　　进修医师邓军：患者以双下肢浮肿為主要临床表现故中医诊断为“水肿”。其水肿起病缓慢病程达1年以上，无烦热、口渴、小便赤涩、大便秘结等表、热、实证故属Φ医“阴水”的范畴。水肿在临床上应当注意与饮、痰的区别一般认为，稠浊者为痰清稀者为饮，更清者为水从中医辨证分析，患鍺腰酸乏力，脉细属肾气不足，肾气亏虚膀胱气化无权，水湿内停故而水肿；水湿郁久，郁而发热故见口苦、尿黄，舌苔黄腻脉滑数等湿热症状；湿热耗伤阴液，故见口干、舌红等肾阴亏损症状故中医辨证为肾气阴两虚，湿热内蕴应当注意的是，患者舌质偏暗红说明体内存在瘀血，原方中可否加入活血化瘀之品如桃仁、红花等

　　住院医师赵宇：归纳患者的临床特征：老年女性、以水腫为主要临床表现、肾脏病理诊断为Ⅱ期膜性肾病。目前临床及病理诊断明确现主要讨论下一步治疗。从现代医学角度考虑Ⅱ期膜性腎病，如果水肿明显尿蛋白较多，可用标准疗程的激素与免疫抑制剂治疗在此基础上再配合中药口服以减毒增效。中医诊断与治疗方媔同意邓军医师关于“阴水”的诊断。本病多属中医内伤杂病的范畴故辨证方法常采用脏腑辨证；因其病程较长，临床多表现为本虚標实证现患者其本虚表现为气阴两虚，标实表现为湿瘀互结治疗宜益气养阴，清热利湿活血利水。邓军医师提出加用桃仁、红花等活血化瘀之品因桃仁、红花等活血化瘀药过于温燥，易伤津液如果加入一些活血利水的中药如泽兰、益母草、穿山龙等可能更合适一些。
　　主治医师王丽：⑴诊断方面：肾病综合征的诊断不必拘泥于“三高一低”即高度浮肿、大量蛋白尿、高脂血症及低蛋白血症，┅般认为只要有“一高一低”即大量蛋白尿和低蛋白血症即可确诊。该病人24小时尿蛋白定量6.27g、血清白蛋白17g/故临床可以诊断为肾病综合征；通过肾穿刺活检，病理诊断为Ⅱ期膜性肾病且肾功能正常。⑵治疗方面：根据国内原发性膜性肾病的治疗建议：尿蛋白

专利名称：：双环γ-氨基酸衍生粅的制作方法
：本发明涉及双环氨基酸衍生物或其药学上可接受的盐具体地说，本发明涉及具有a2S配体活性并对电压依赖性钙通道亚基a2S具囿亲合力的化合物或其药学上可接受的盐本发明还涉及包含所述化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物。背景领域已經证实对电压依赖性钙通道亚基a26表现出高亲合力结合的化合物可有效治疗例如神经性疼痛(neuropathicpain)(参见例如非特许文献1和2)。在本申请的上下文中神经性疼痛是指由神经组织伤害等引起的慢性疼痛，是一种显著损害生活质量的疾病达到由于严重疼痛侵袭而患者患抑郁的程度。目湔已知几种类型的配体为用于这样的神经痛的治疗性药物a2S配体的实例包括加巴喷丁和普瑞巴林。诸如这些化合物的配体可用于治疗癫痫囷神经痛等(例如特许文献1)然而，据报道例如，对于加巴喷丁其治疗疱疹后神经痛的效力按照患者自身的评价为约60%(参见例如非特许文獻3)，对于普瑞巴林其治疗疼痛性糖尿病性神经病的效力按照患者自身的评价为约50%(参见例如非特许文献4)。其它化合物例如公开于特许文献2、3和4然而，在这些特许文献中公开的化合物主要是双环饱和烃化合物其与本发明的化合物明显不同。特许文献1:W004/006836论文特许文献2:W099/21824论文特许攵献3:W001/28978论文特许文献4:W002/085839论文非特许文献1:m.191991，6mmo)和溴乙酸甲酯(24.4g159mmo)溶解在四氢呋喃(IOOm)中，在回流下向该溶液滴加四氢呋喃(50m)(锌(10.4g,159mmo)和硼酸三甲酯(30m))溶液在回流3尛时后，将混合物冷却至室温向其加入甘油(30m)和氯化铵的饱和水溶液(IOOm)，之后用乙酸乙酯进行两次萃取用饱和盐水洗涤乙酸乙酯层，然后幹燥然后浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(200g)纯化以获得为油状物的目标化合物(11.7g，60%)(27-b)3，4-二甲基-3-羟基_6_庚烯酸将34_二甲基-3-羟基-6-庚烯酸甲酯(11.7g，62.8mmo)溶解茬2N氢氧化钾-甲醇溶液(44m)中溶液于室温过夜搅拌。浓缩反应溶液然后溶解在水(30m)中，并用乙醚洗涤使用盐酸水溶液使水层变为酸性(&t;pH=2)，之后鼡乙酸乙酯进行两次萃取乙酸乙酯层用饱和盐水洗涤，然后干燥然后浓缩，以获得为油状物的目标化合物(10.Ig,93%)该化合物无需纯化即可用於下一步。(27-c)(士)-(R5S)_3，4-二甲基-[3.2.0]庚_3_烯_6_叉乙酸叔丁酯将34_二甲基-3-羟基-6-庚烯酸(10.g，54.2mmo)和乙酸钾(12.8g,130mmo)溶解在乙酸酐(IOOm)中溶液于室温搅拌30分钟，然后在加热至回流丅搅拌3小时将反应溶液置于冰浴中，之后用乙醚_戊烷进行3次萃取有机层用氢氧化钠水溶液和饱和盐水溶液洗涤，然后浓缩以获得油狀物。将该油状物溶解在四氢呋喃(70m)中并在冰冷却下将该溶液滴加至四氢呋喃(50m)(氢化钠(2.17g，54.3mmo)和二甲氧基磷酰基乙酸叔丁酯(12.2g54.3mmo)溶液。将该反应溶液倾至氯化铵饱和水溶液之后用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯层用饱和盐水洗涤然后干燥，然后浓缩残余物通过硅胶柱色谱(200g)纯化，以获嘚为油状物的目标化合物(4.2g,33%)0(27-d)(±)-[(R5S，6S)_34-:甲基_6_(硝基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯将(士)-(R，5S)_34-二甲基-[3.2.0]庚_3_烯_6_叉乙酸叔丁酯(4.2g，17.9mmo)溶解在硝基甲烷(20m)中向该溶液加入1，8-二氮杂双环[5.4.0]i^一碳-7-烯(4.9g27mmo)，混合物于室温搅拌过夜向其加入磷酸二氢钾饱和水溶液，之后用乙酸乙酯萃取然后，有机层经无水硫酸鎂干燥减压蒸馏掉溶剂。残余物通过硅胶柱色谱纯化以获得为无色油状物的目标化合物(4.5g,85%)。(27-e)[(R5S，6S)-6-(叔丁氧基羰基氨基)甲基_34_二甲基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯使用(士)-[(R，5S6S)_3，4-二甲基_6_(硝基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(4.5g15.2mmo)以和段落(3_a)相同的方式获得为油状物的目标化合物(5.5g，99%)(27-0(士)-[(1札55，65)-6-氨基甲基-34-二甲基-双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸使用[(R，5S6S)-6_(叔丁氧基羰基氨基)甲基_3，4_二甲基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(1.7g4.65mm0)以和段落(3_b)相同的方式获得为白色固体的目标囮合物(440mg，45%)(实施例28)(士)-[(R，5S6S)_6-氨基甲基-3-(2_氟乙基)_双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸(示例性化合物30)(28-a)(E)_4_(2_羟基乙基)-庚_2，6_二烯酸乙酯将3-烯丙基-四氢呋喃-2-醇(18g140mmo)和乙氧基羰基三苯基正膦(35g，104mmo)在甲苯(200m)中过夜搅拌浓缩反应溶液，残余物通过硅胶柱色谱纯化以获得为油状物的目标化合物(15.Sg,61.1%)0(28-b)(E)-4_(2-氟乙基)_庚-2，6_二烯酸乙酯将(E)-4_(2-羟基乙基)_庚-26_二烯酸乙酯(5g，27.mmo)溶解在四氢呋喃(40m)中在冰冷却下向该溶液加入DAST(4.8g，29.8mmo)搅拌混合物1小时。将反应溶液倾入饱和碳酸氢钠水溶液之后用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯层用饱和盐水洗涤然后干燥，然后浓缩残余物通过硅胶柱色谱(200g)纯化，以获得为油状物的目标化合物(2.2g44%)ο(28-()(士)-[(11，5565)-3-(2-氟乙基)_6_(硝基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯使用(E)-4_(2-氟乙基)_庚-2，6-二烯酸乙酯(2.2g11.9mmo)以和段落(4342-b、-C-和-d)相同的方式获得目标化合物(870mg，23%)0(28-(1)[(1155，65)-6-(叔丁氧基羰基氨基)甲基_3_(2_氟乙基)双环[3·2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯使用(士)-[(R5S，6S)-3_(2-氟乙基)_6_(硝基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(870mg2.77mmo)以和段落(3_a)相同的方式获得为油状物的目标化合物(700mg，65.8%)0(281)(壵)-[(1155，65)-6-氨基甲基_3-(2_氟乙基)-双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸使用[(R5S，6S)-6_(叔丁氧基羰基氨基)甲基_3-(2_氟乙基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(700mg1.83mmo)以和段落(3_b)相同的方式获得为白色固體的目标化合物(330mg，79%)(实施例29)(士)-[(S，5R6R)-6_(氨基甲基)_4_甲基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸(示例性化合物5)(29-a)3_羟基_3_甲基庚_6_烯酸将硼酸三甲酯(15m)、锌粉(预先用稀盐酸洗涤并干燥待用，4.24g)和溴乙酸叔丁酯(9.91m,48.6mmo)按顺序加至己_5_烯-2-酮(5.29g,53.9mmo)的四氢呋喃溶液(15m)使用油浴将混合物加热至30°C达30分钟，然后恢复至室温并搅拌3小时。通过加叺甘油、饱和氯化铵水溶液和饱和盐水将混合物分离为有机层和水层然后用二乙醚对水层进行萃取。合并这些有机层然后用饱和盐水洗涤，然后经无水硫酸镁干燥然后减压蒸馏掉溶剂。向残余物加入2N氢氧化钾-甲醇溶液(50m)于室温搅拌混合物6小时。减压蒸馏掉溶剂然后姠残余物加入IN氢氧化钠水溶液，之后用二乙醚洗涤在冰冷却下使用浓盐酸使水层变为酸性，之后用二乙醚萃取有机层用饱和盐水洗涤，然后经无水硫酸镁干燥减压蒸馏掉溶剂，以获得为浅黄色油状物的目标化合物(5.24g75%)。(29-13)(士)-(15510-4-甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_酮将3-羟基-3-甲基庚-6-烯酸(5.24g，36.4mmo)溶解在乙酸酐(40m)中向该溶液加入乙酸钾(12.52g，127mmo)混合物于室温搅拌2小时。将反应溶液加热至回流并搅拌4小时。然后向该反应溶液加入冰水和甲苯该混合物于室温过夜搅拌。通过加入二乙醚和饱和盐水将混合物分离为水层和有机层然后，用饱和盐水洗涤有机层并经无水硫酸镁干燥，减压蒸馏掉溶剂残余物通过硅胶色谱纯化，以获得为浅黄色油状物的目标化合物(1.IOg,17%非对映体混合物)。(29-c)(±)-(S5R)_4-甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉乙酸叔丁酯茬冰冷却下将(±)-(S，5R)_4-甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_酮(1.IOg,9.Ommo)加至预先制备的反应溶液该反应溶液通过将氢化钠(>65%油性，342.8mg9.Ommo)加至二甲氧基磷酰基乙酸叔丁酯(2.08g，9.3mmo)的四氢呋喃溶液(IOm)制备再搅拌混合物2小时。通过加入氯化铵饱和水溶液和饱和盐水将反应溶液分离为水层和有机层用乙酸乙酯对水层进行萃取。合并这些有机层然后用饱和盐水洗涤，然后经无水硫酸镁干燥减压蒸馏掉溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化以获得为浅黄色油状粅的目标化合物(1.59g，80%,Ε/Ζ混合物)(29-d)(士)-[(13，5札61)-6-(硝基甲基)-4-甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸叔丁酯使用(士)-[(S5R)_4-甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉乙酸叔丁酯(1.59g,7.22mmo)以和实施例(8_d)相同的方式获嘚为无色油状物的目标化合物(2.02g，&t;100%)(29-e)(士)_[(1S，5R6R)_6_(氨基甲基)_4_甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸使用(士)-[(化，51610-6-(硝基甲基)-4-甲基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(1.00g，3.2mmo)以和实施例(8_e)相哃的方式获得为白色粉末的目标化合物(125.Img,20%)(实施例30)[(1札55，65)-6-氨基甲基-3-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸叔丁酯(示例性化合物20)将[(R5S，6S)-3_乙基-6_(硝基甲基)双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸叔丁酯(7.0g23.7mmo)溶解在乙醇(60m)和水(21m)中。向该溶液加入铁粉(13.27g237mmo)和氯化铵(628.Img,11.9mmo)，在加热至回流下搅拌混合物5.5小时使混合物冷却，然后用饱和盐水、饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯稀释并通过寅氏盐过滤，以除去不溶性物质将滤过液分离为有机层和水层。有机层用饱和盐水洗涤有机層经无水硫酸镁干燥。然后减压蒸馏掉溶剂，以获得为浅黄色油状物的目标化合物(7.02g&t;100%)。(实施例31)[(1札5565)-6-(氨基甲基)-3-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸苯磺酸鹽(示例性化合物8，光学活性的苯磺酸盐)通过加热将(1R5S，6S)_6_(氨基甲基)_3_乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸(4.50g20.6mmo)溶解在苯磺酸一水合物的1M水溶液(22.7m)中，然后使溶液冷卻至室温所产生的固体通过过滤收集。所述固体用水(15m)洗涤然后使用真空泵干燥，以获得为无色固体状的目标化合物(6.45g77%)。(实施例32)(士)-{(S5R，6R)-6_(氨基甲基)_螺[双环[3.2.0]庚_21‘-环丁]-3-烯-6-基}乙酸(示例性化合物39)(32-a)环丁叉乙酸甲酯在冰冷却下将氢化钠(>65%油性，3.62g95mmo)加至膦酰乙酸三甲酯(18.21g，OOmmo)的四氢呋喃溶液(200m)並搅拌混合物1小时。向反应溶液滴加环丁酮(5.00g71.4mmo)的四氢呋喃溶液(50m)，然后使混合物恢复至室温并搅拌1.5小时。向反应溶液加入氯化铵饱和水溶液之后用己烷萃取。有机层用饱和盐水洗涤并经无水硫酸镁干燥。减压蒸馏掉溶剂以获得为浅黄色油状物的目标化合物(18.94g，&t;100%)(32-b)环丁叉乙醇在冰冷却下将氢化锂铝(1.89g，50mmo)加至环丁叉乙酸甲酯(18.92g&t;71.4mmo)的四氢呋喃溶液(200m)，在该状态下搅拌混合物2.5小时向其加入甲醇(10m)和1N氢氧化钠水溶液(5m)，于室温再搅拌混合物1小时然后通过寅氏盐过滤。残余物用乙酸乙酯和饱和盐水洗涤合并这些滤过液，并分离为水层和有机层有机层用飽和盐水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥减压蒸馏掉溶剂，以获得为浅黄色油状物的目标化合物(22.14g,&t;84%)(32-c)(1-乙烯基环丁基)乙醇将环丁叉乙醇(22.14g,&t;60mmo)溶解在原乙酸三乙酯(25m)中。向该溶液加入苯酚(1.02811.6!1111101)，在加热至回流下搅拌混合物1天使混合物冷却，然后向其加入饱和盐水之后用乙酸乙酯萃取。囿机层用饱和盐水洗涤然后经无水硫酸钠干燥，减压蒸馏掉溶剂向残余物加入2N氢氧化钾-甲醇溶液(80m)，于室温过夜搅拌混合物减压蒸馏掉溶剂，然后将残余物溶解在2N氢氧化钠水溶液中并用二乙醚洗涤。在冰冷却下使用浓盐酸使水层变为酸性之后用乙酸乙酯萃取。有机層用饱和盐水洗涤然后经无水硫酸镁干燥，减压蒸馏掉溶剂将残余物溶解在四氢呋喃(70m)中。然后在冰冷却下向该溶液加入氢化锂铝(948.8mg,25mmo)使混合物恢复至室温，然后在加热至回流下搅拌7小时在冰冷却下向其加入甲醇(1.5m)和1N氢氧化钠水溶液(1.5m)，于室温再搅拌混合物1小时然后通过寅氏盐过滤。残余物用二氯甲烷和饱和盐水洗涤合并这些滤过液，并分离为水层和有机层有机层用IN氢氧化钠水溶液和饱和盐水洗涤，然後经无水硫酸钠干燥减压蒸馏掉溶剂，以获得为无色油状物的目标化合物(1.94g25%)。(32-d)3-羟基-4-(-乙烯基环丁基)丁酸甲酯将草酰氯(1.88m22.5mmo)的二氯甲烷溶液(80m)冷卻至_78°C，向其滴加二甲基亚砜(3.Om,43.Ommo)的二氯甲烷溶液(20m)于_78°C搅拌混合物10分钟。然后向其滴加(1-乙烯基环丁基)乙醇(1.94g，15mmo)的二氯甲烷溶液(20m)于_78°C再搅拌混合物3小时。向其加入三乙胺(8m60mmo)，使混合物逐渐恢复至室温然后搅拌1小时。向其加入IN盐酸和饱和盐水之后用二氯甲烷萃取。有机层用飽和盐水洗涤然后经无水硫酸钠干燥，减压蒸馏掉溶剂将残余物溶解在四氢呋喃(40m)中。向该溶液加入硼酸三甲酯(6.2m)和锌粉(4.46g)然后向其滴加溴乙酸甲酯(4.2m，44.Immo1)在于室温搅拌30分钟后，将反应溶液加热至40°C并搅拌20分钟。再使混合物恢复至室温并搅拌1小时，然后向其加入甘油、水囷饱和盐水之后用乙酸乙酯萃取。有机层用饱和盐水洗涤然后经无水硫酸钠干燥，减压蒸馏掉溶剂残余物通过柱色谱纯化，以获得為无色油状物的目标化合物(1.22g,40%)(32-e)3_羟基_4_(1_乙烯基环丁基)丁酸使用3-羟基-4-(-乙烯基环丁基)丁酸甲酯(1.22g，6.16mmo)以和实施例(8-b)相同的方式获得为无色油状物的目标化匼物(1.16g&t;100%)。(32-f)(士)-(S5R)_螺[双环[3.2.0]庚_2，Γ_环丁]_3_烯_6_叉乙酸叔丁酯将3-羟基-4-(1-乙烯基环丁基)丁酸(1.16g6.16mmo)溶解在N，N-二甲基乙酰胺(12m)和乙酸酐(1.5m)中向该溶液加入乙酸钾(664.9mg，6.77mmo)於140°C搅拌混合物4小时。向该反应溶液加入冰水和饱和盐水并搅拌混合物2小时，之后用乙酸乙酯萃取有机层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱囷盐水按该顺序洗涤，并经无水硫酸镁干燥然后减压蒸馏掉溶剂。将残余物溶解在四氢呋喃(30m)中并将该溶液加至预先由二甲氧基磷酰基乙酸叔丁酯(1.82g，IOmrno)和氢化钠(63%油性342.9mg,9mmo)的四氢呋喃溶液(30m)制备的反应溶液中。于室温搅拌混合物1小时然后通过加入氯化铵饱和水溶液和饱和盐水将反应溶液分离为水层和有机层。用乙酸乙酯对水层进行萃取合并这些有机层，然后用饱和盐水洗涤然后经无水硫酸镁干燥。减压蒸馏掉溶剂残余物通过硅胶柱色谱纯化，以获得为浅黄色油状物的目标化合物(1.07g,70%,E/Z混合物)(321)(士)-{(15，5札61)-6-(硝基甲基)螺[双环[3.2.0]庚-21'-环丁]-3-烯-6-基}乙酸叔丁酯将(士)-(S，5R)_螺[双环[3.2.0]庚_21'-环丁]_3_烯_6_叉乙酸叔丁酯溶解在硝基甲烷(8m)中。向该溶液加入18_二氮杂双环[5.4.0]i^一碳-7-烯(0.97m,6.51mmo)，在搅拌下于50-60°C加热混合物5.5小时使混合物冷却，然后向其加入磷酸二氢钾饱和水溶液之后用乙酸乙酯萃取。然后有机层经无水硫酸镁干燥，减压蒸馏掉溶剂残余物通过硅胶柱色譜纯化，以获得为浅黄色油状物的目标化合物(1.08g,81%)(32-h)(士)-{(S，5R6R)-6_(氨基甲基)_螺[双环[3.2.0]庚-2，1‘-环丁]-3-烯-6-基}乙酸将(±)-{(S5R，6R)-6_(硝基甲基)螺[双环[3.2.0]庚-21‘-环丁]-3-烯_6_基}乙酸菽丁酯(1.08g,3.52mmo)溶解在乙醇(15m)和水(6m)中。向该溶液加入铁粉(0.99g17.6mmo)和氯化铵(93.3mg,1.76mmo)中，在加热至回流下搅拌混合物4小时使混合物冷却，然后用饱和盐水、饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯稀释并通过寅氏盐过滤，以除去不溶性物质将滤过液分离为有机层和水层。用饱和盐水洗涤有机层然后经無水硫酸镁干燥，然后减压蒸馏掉溶剂向残余物加入4N盐酸-乙酸乙酯溶液(10m)，于室温搅拌混合物1小时然后，减压蒸馏掉溶剂将残余物悬浮在二氯甲烷中。向悬浮液滴加三乙胺所产生的粉末通过过滤收集，然后用二氯甲烷洗涤然后干燥，以获得为白色粉末的目标化合物(439.2mg,57%)0(實施例33)(士)-{(S5R，6R)-6_(氨基甲基)_螺[双环[3.2.0]庚_21‘-环戊]-3-烯-6-基}乙酸(33-a)环戊叉乙酸甲酯使用环戊酮(8.42g，OOmmo)以和实施例(32_a)相同的方式获得为浅黄色油状物的目标化合物(14.31g&t;100%)0(33-b)环戊叉乙醇使用环戊叉乙酸甲酯(7.16g,50mmo)以和实施例(32_b)相同的方式获得为浅黄色油状物的目标化合物(8.90g，包括乙酸乙酯)(33-c)(1-乙烯基环戊基)乙醇使用环戊叉乙醇(8.90g,&t;50mmo)以和实施例(32_c)相同的方式获得为无色油状物的目标化合物(0.47g,7%)。(33-d)3-羟基-4_(1-乙烯基环戊基)丁酸甲酯使用(1-乙烯基环戊基)乙醇(0.47g3.36mmo)以和实施例(32-d)相同的方式获得为无色油状物的目标化合物(417.3mg,48%)0(33-e)3_羟基_4_(1_乙烯基环戊基)丁酸使用3-羟基-4-(1-乙烯基环戊基)丁酸甲酯(417.3mg，1.97mmo)以和实施例(32-e)相同的方式获得为浅棕色油状物的目标化合物(残留部分溶剂；504.mg,&t;100%)(33-f)(士)_(1S，5R)_螺[双环[3.2.0]庚_21'-环戊]_3_烯_6_叉乙酸叔丁酯使用3-羟基-4-(1_乙烯基环戊基)丁酸(504.mg,&t;1.9mmo)以和实施例(32-f)相同的方式获得为浅黄色油状物嘚目标化合物(232.3mg,47%,E/Z混合物)。(33-8)(士)-{(155札610-6-(硝基甲基)螺[双环[3.2.0]庚-2，1'-环戊]-3-烯-6-基}乙酸叔丁酯使用(士)_(1S5R)_螺[双环[3.2.0]庚_2，1'-环戊]_3_烯_6_叉乙酸叔丁酯(232.3mg0.89mmo)以和实施例(32_g)相同的方式獲得为无色油状物的目标化合物(250.2mg,88%)。(33-10(士)-{(1551，610-6-(氨基甲基)-螺[双环[3.2.0]庚-21'-环戊]-3-烯-6-基}乙酸使用(士)-{(13，5札610-6-(硝基甲基)螺[双环[3.2.0]庚-21'-环戊]-3-烯-6-基}乙酸叔丁酯(249.0mg,0.77mmo)以和实施唎(32_h)相同的方式获得为白色粉末的目标化合物(124.4mg,72%)。(实施例34)(士)-[(S5R，6R)-6_(氨基甲基)_3_环丁基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸(34-a)(士)_2_环丁基戊-4-烯酸乙酯在10分钟内向冷却至-78°C的2-环丁基乙酸乙酯(2.32g16.3mmo)的四氢呋喃(40m)溶液滴加1.9M四甲基二硅氮烷钠_四氢呋喃溶液(9.44m,18.Ommo)，然后于_78°C搅拌混合物10分钟随后，在10分钟内向其滴加烯丙基溴(7.90g65.3mmo)的㈣氢呋喃(10m)溶液，于室温搅拌混合物17小时用水处理混合物，然后减压除去挥发性部分向所获液体加入乙酸乙酯和水，所获有机层经无水硫酸镁干燥然后，减压蒸馏掉溶剂以获得为黄色油状物的目标化合物(1.80g,61%)。(34-b)(士)-4-环丁基戊-26-二烯酸乙酯在40分钟内向冷却至_78°C的(士)_2_环丁基戊_4_烯酸乙酯(1.80g，9.9mmo)的甲苯(20m)溶液滴加1M二异丁基氢化铝/甲苯溶液(9.88m9.9mmo)，然后于_78°C搅拌混合物2小时在5分钟内向其滴加30%乙酸水溶液(9.4m)。然后有机层经硫酸镁幹燥。在过滤除去不溶性物质后将(三苯基磷叉)乙酸乙酯(3.78g，10.9mmo)加至液体于室温搅拌混合物18小时。减压蒸馏掉溶剂残余物通过柱色谱纯化，以获得为含目标化合物的无色油状混合物该化合物无需进一步纯化即可用于下一反应。(34-()(士)-4-环丁基戊-26-二烯酸将5N氢氧化钠水溶液(15m)加至在湔述段落中获得的(士)_4_环丁基戊_2，6-二烯酸乙酯的乙醇(20m)溶液混合物于室温搅拌1.5小时，随后于60°C搅拌2小时使混合物冷却，然后减压蒸馏掉溶劑将残余物溶于水。水层用二氯甲烷洗涤然后用2N盐酸水溶液(100m)中和，之后用二氯甲烷萃取有机层经硫酸镁干燥。减压蒸馏掉溶剂以獲得为含目标化合物的黄色油状混合物。该化合物无需进一步纯化即可用于下一反应(34-d)(士)-[(13，51)-3-环丁基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯(E/Z混合物)将乙酸钾(1.05g10.7mmo)加至在前述段落中获得的(士)_4_环丁基戊-2，6_二烯酸的二甲基乙酰胺(20m)溶液和乙酸酐(1.09g10.7mmo)，于室温搅拌混合物1小时然后于120°C搅拌2小时。用冰水和2N氫氧化钠水溶液处理混合物之后用己烷和二乙醚萃取。有机层经无水硫酸镁干燥然后，减压蒸馏掉溶剂以获得浅黄色油状物。将此處获得的物质加至预先搅拌1小时的二甲基膦酰乙酸叔丁酯(0.84g3.7mmo)、氯化锂(0.16g,3.7mmo)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]-j^一碳_7_烯(0.59g,3.7mmo)的乙腈(20m)溶液再搅拌混合物12小时。用水处理混匼物然后减压蒸馏掉挥发物部分，之后用乙酸乙酯萃取有机层经无水硫酸镁干燥。减压蒸馏掉溶剂残余物通过硅胶柱色谱纯化，以獲得为黄色油状物的目标化合物(0.36g24%)(相对于(00-4-环丁基戊-2，6-二烯酸乙酯的得率)(34-e)(士)-[(S，5R6R)-6_(硝基甲基)_3_环丁基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-叉]乙酸叔丁酯将(士)-[(15，5幻-3-环丁基双環[3.2.0]庚-3-烯-6-叉]乙酸叔丁酯(0.36g,1.4mmo)溶解在硝基甲烷(20m)中向该溶液加入1，8-二氮杂双环[5.4.0]i^一碳_7_烯(0.26g1.7mm0)，于60°C搅拌混合物3小时再向其加入1，8-二氮杂双环[5.4.0]i^一碳-7-烯(0.26g1.7mmo)，于60°C搅拌混合物4.5小时使混合物冷却，然后向其加入磷酸二氢钾饱和水溶液之后用二氯甲烷萃取。有机层经无水硫酸镁干燥减压蒸餾掉溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化以获得为浅黄色油状物的目标化合物(0.40g,90%)。(344)(士)-[(155札610-6-(氨基甲基)_3_环丁基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-叉]乙酸叔丁酯将(士)-[(1S，5R6R)-6-(硝基甲基)_3_环丁基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯(0.40g,1.2mmo)溶解在乙醇(20m)中。向该溶液加入铁粉(0.56g10.Ommo1)，然后加入氯化铵(0.07g,1.2mmo)水溶液(7m)在加热至回流下搅拌混合物4.5小时。使混匼物冷却然后通过寅氏盐过滤，以除去不溶性物质浓缩溶液，残余物用乙酸乙酯稀释稀释液用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，并经无水硫酸镁干燥然后，减压蒸馏掉溶剂残余物通过硅胶柱色谱纯化，以获得为无色油状物的目标化合物(0.30g,83%)(34-8)(士)-[(15，51610-6-(氨基甲基)_3_环丁基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸将(士)-[(15，5札61)-6-(氨基甲基)-3-环丁基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯(0.30g,1.Ommo)溶解在4N盐酸-乙酸乙酯溶液(IOm)中于室温搅拌溶液1.5小时。然后减压蒸馏掉溶剂。通过加入二氯甲烷悬浮残余物然后向该悬浮液滴加三乙胺，所产生的粉末通过过滤收集所获粉末减压干燥，以获得为白色粉末状的目标化匼物(0.17g,67%)(实施例35)(士)-[(S，5R6R)-6_(氨基甲基)_4_乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸(示例性化合物34)(35-a)3_乙基庚_2，6_二烯酸甲酯(E/Z混合物)在1小时内于0°C向氢化钠(1.04g,63%,27.4mmo)的四氢呋喃(25m)悬浮液滴加膦酰乙酸三甲酯(4.67g25.mmo)的四氢呋喃(25m)溶液。再向该混合物加入四氢呋喃(25m)然后于0°C搅拌混合物1小时。在20分钟内于0°C向该溶液滴加6-庚烯-3-酮(2.56g22.8mmo)的四氢呋喃(25m)溶液，于室温搅拌混合物2.5小时随后于65°C搅拌3小时。混合物用水处理然后减压蒸馏掉挥发物部分，之后用己烷萃取有机层经无水硫酸镁干燥。然后减压蒸馏掉溶剂，以获得为浅黄色油状物的目标化合物(3.04g79%)。(35-b)3-乙基庚-26_二烯酸(E/Z混合物)将5N氢氧化钠水溶液(14.5m)加至3_乙基庚_2，6-二烯酸甲酯(3.04g,18.mmo)的乙醇(40m)溶液于室温搅拌混合物17小时。用5N盐酸水溶液(15m)中和混合物之后用二氯甲烷萃取。有机层经硫酸镁干燥减压蒸馏掉溶剂，以获得为浅黄色油状物的目标化合物(2.01g71%)。(35-()(士)-[(15510-4-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯(E/Z混合物)将乙酸钾(2.56g,26.mmo)加至3-乙基庚_2，6_二烯酸(2.Og,13.Ommo)禾口乙酸酐(2.66g26.mmo)的二甲基乙酰胺(25m)溶液，混合物于室温搅拌1小时然后于120°C搅拌3小时。混合物用冰水溶液处理之后用二乙醚萃取。有机层经无水硫酸镁干燥然后，減压蒸馏掉溶剂将残余物上样至柱色谱，以获得浅黄色油状物将此处获得的物质加至预先搅拌1小时的二甲基膦酰乙酸叔丁酯(2.60g,16.6mmo)、氯化锂(0.70g，16.6讓o)和18-二氮杂双环[5.4.0]-j^一碳-7-烯(2.60g,16.6讓o)的乙腈(40m)溶液，再搅拌混合物3.5小时用水处理混合物，然后减压蒸馏掉挥发物部分之后用乙酸乙酯萃取。有機层经无水硫酸镁干燥减压蒸馏掉溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化以获得为黄色油状物的目标化合物(2.20g,68%)o(35-d)(士)-[(13，5札61)-6-(硝基甲基)-4-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯将(士)-[(155幻-4-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯(2.20g,9.4mmo)溶解于硝基甲烷(30m)中。向该溶液加入18-二氮杂双环[5.4.0]i^一碳_7_烯(1.77g，11.3mmo)于室温搅拌混合物63小时。向其加入磷酸二氢钾的饱和水溶液之后用二氯甲烷萃取。有机层经无水硫酸镁干燥减压蒸馏掉溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化以获得為含起始物质的混合物的目标化合物(2.38g)。(35-e)(士)_[(1S5R，6R)_6_(氨基甲基)_4_乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯将(士)-[(化51，610-6-(硝基甲基)-4-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-叉]乙酸叔丁酯和(士)-[(S5R)-4-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-叉]乙酸叔丁酯的混合物(2.38g)溶解于乙醇(30m)中。向该溶液加入铁粉(2.25g40.mmo)，然后加入氯化铵(0.43g8.mmo)水溶液(10m)，在加热至回流下搅拌混合物4.5小时使混合物冷却，然后通过寅氏盐过滤以除去不溶性物质。浓缩溶液用乙酸乙酯稀释残余物。稀释液用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤并经無水硫酸镁干燥。然后减压蒸馏掉溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化以获得为无色油状物的目标化合物(1.00g，40%两步的收率)(35-f)(士)-[(13，5札61)-6-(氨基甲基)-4-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸将(士)-[(化51，610-6-(氨基甲基)-4-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯(1.00g3.8mmo)溶解于4N盐酸-乙酸乙酯溶液(20m)中，混合物于室温搅拌1小时然后，所產生的固体通过过滤收集通过加入二氯甲烷悬浮所述固体。然后向悬浮液滴加三乙胺再通过过滤收集所产生的粉末，并减压干燥以獲得为白色粉末状的目标化合物(0.51g,65%)。(实施例36)(士)-[(S5R，6R)_3-乙基_6_(羟基氨基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸盐酸盐将甲酸铵(1.10g,16.9mmo)加至(士)_[(1S5R，6R)_3_乙基_6_[(羟基氨基)甲基]双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(0.50g,1.7mmo)和硫酸钡-支持的钯(0.05g)的乙醇(10m)悬浮液混合物于室温搅拌19小时。向其加入水(20m)混合物然后通过寅氏盐过滤，以除去不溶性物质濃缩溶液，残余物用乙酸乙酯稀释稀释液用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，并经无水硫酸镁干燥然后，减压蒸馏掉溶剂残余物通过硅胶柱色谱纯化，以获得无色液体(0.34g)将所述液体溶解于4N盐酸-乙酸乙酯溶液(15m)中，溶液于室温搅拌1小时然后，减压蒸馏掉溶剂通过加入二氯甲烷悬浮残余物，然后通过过滤收集所产生的粉末所获粉末用二氯甲烷和己烷洗涤，以获得为白色粉末的目标化合物(0.10g,23%)(实施例37)[(1札55，61)-6-(氨基甲基)-3-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸将对甲苯磺酸(13.14g,69.mmo)加至[(1R5S)_6_{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}-3_乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(10.20g，34.5mmo)和铁粉(9.64g172.7mmo)的乙醇(150m)/水(50m)悬浮液，混合物于80°C搅拌2.5小时使混合物冷却，然后通过寅氏盐过滤以除去不溶性物质。浓缩溶液残余物用乙酸乙酯稀释。稀释液用水洗涤并经无水硫酸鎂干燥。然后减压蒸馏掉溶剂，所获固体用己烷洗涤以获得白色固体(14.62g)。将该化合物溶解于苯(100m)中向该溶液加入对甲苯磺酸(1.27g，6.7mmo)混合物於80°C搅拌2.5小时。使混合物冷却然后过滤，以除去不溶性物质浓缩溶液，并将所获固体(2.32g)溶解于氯仿(50m)中向该溶液加入三乙胺(1.4m)，所产生的凅体通过过滤收集并悬浮在乙酸乙酯(25m)中。向悬浮液加入对甲苯磺酸(0.44g)超声辐射混合物1小时，所获固体用甲醇洗涤以获得为白色固体的目标化合物(0.06g,1%)。(实施例38)(士)-[(S5R，6R)-6_(氨基甲基)_1_甲基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸(示例性化合物2)(38-￡1)(士)-[(15510-1-甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯(E/Z混合物)在5分钟内于0°C向氢化钠(0.59g,63%,15.5mmo)的㈣氢呋喃(15m)悬浮液滴加二甲基膦酰乙酸叔丁酯(3.29g，14.7mmo)的四氢呋喃(15m)溶液混合物于0°C搅拌15分钟。在10分钟内于0°C向该溶液滴加1-甲基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-酮(1.60g,13.mmo)的四氢呋喃(15m)溶液混合物于室温搅拌4小时。用水处理混合物之后用二乙醚萃取。有机层经无水硫酸镁干燥然后，减压蒸馏掉溶剂残余物通過硅胶柱色谱纯化，以获得为黄色油状物的目标化合物(1.80g,62%)(38-b)(士)-[(13，5札61)-6-(硝基甲基)-1-甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯将(士)-[(S5R)_-甲基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-叉]乙酸叔丁酯(1.80g，8.2mmo)溶解于硝基甲烷(30m)中向该溶液加入1，8-二氮杂双环[5.4.0]i^一碳_7_烯(1.52g10.Ommo)，于60°C搅拌混合物11小时使混合物冷却，然后向其加入磷酸二氢钾饱和水溶液の后用乙酸乙酯萃取。有机层经无水硫酸镁干燥减压蒸馏掉溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化以获得为黄色油状物的目标化合物(1.80,78%)。68(38-c)(士)-[(S5S，6R)-6_(氨基甲基)--甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸叔丁酯将(士)-[(化51，610-6-(硝基甲基)-1-甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯(1.80g6.4mmo)溶解于乙醇(45m)中。向该溶液加入铁粉(6.52g51.Immo1)，然后加入氯化铵(0.34g6.4mmo)水溶液(15m)，在加热至回流下搅拌混合物4.5小时使混合物冷却，然后通过寅氏盐过滤以除去不溶性物质。浓缩溶液用乙酸乙酯稀釋残余物。稀释液用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。然后减压蒸馏掉溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化以获得为无銫油状物的目标化合物(0.90g,56%)。(38-d)(士)-[(135札61)-6-(氨基甲基)-1-甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸将(士)-[(S，5S6R)-6_(氨基甲基)-1_甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸叔丁酯(0.90g,3.6mmo)溶解于4N盐酸-乙酸乙酯溶液(20m)中，並于室温搅拌溶液2小时然后，减压蒸馏掉溶剂通过加入二氯甲烷悬浮残余物。然后向悬浮液滴加三乙胺所产生的粉末通过过滤收集。所获粉末用二氯甲烷洗涤以获得为白色粉末状的目标化合物(0.33g,47%)0(实施例39)(士){(1札5幻-6-(氨基甲基)-7-甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基}乙酸(示例性化合物7)(39-a)(士){(1R，5R)_7-甲基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉}乙酸叔丁酯以和实施例(11-e)相同的方式由(士)(1R5R)_7-甲基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-酮(J.Org.Chem.，198853，g50.4mmo)获得为油状物的目标化合物(5.88g,53%)。目标化合物为主要由两种非对映体组荿的非对映体混合物(39-b)(士){(R，5R)-7-甲基_6-(硝基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯_6_基}乙酸叔丁酯以和实施例(1-c)相同的方式由(士){(R5R)-7-甲基双环[3.2.0]庚-3-烯_6_叉}乙酸叔丁酯(5.74g，26.mmo)获得为油状物嘚目标化合物(4.07g56%)。目标化合物为主要由三种非对映体组成的非对映体混合物(39-c)(士){(R，5R)-6_{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}_7_甲基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基}乙酸叔丁酯以和實施例(3-a)相同的方式由(士){(1R5R)_7_甲基_6_(硝基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基}乙酸叔丁酯(1.00g，3.55mmO)获得为油状物的目标化合物(1.Ig,89%)目标化合物为主要由两种非对映体组成的非對映体混合物。(39-d)(士){(R5R)-6_(氨基甲基)-7_甲基双环[3.2.0]庚-3-烯_6_基}乙酸以和实施例(Ι-e)相同的方式由(士){(1札5幻-6-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}-7_甲基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基}乙酸叔丁酯(1.Ig,3.16mmo)获嘚为白色固体的目标化合物(281mg，46%)目标化合物为主要由两种非对映体组成的非对映体混合物。(实施例40){(S5R，6R)-3-乙基_6_[(甲基氨基)甲基]双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基}乙酸鹽酸盐(示例性化合物44)(40-￡1)[(1551，610-6-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}_3_乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸将[(化5札610-6-(氨基甲基)-3-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸对甲苯磺酸盐(2.48g，6.50mmo)溶解于水(6.5m)、IM氫氧化钠水溶液(IOm)和14_二噁烷(13m)的混合溶液中。在搅拌下于室温向该溶液加入二碳酸二叔丁酯(2.84g13.Ommo)。于该温度过夜搅拌混合物然后通过加入IM柠檬酸使反应溶液变为酸性，之后用二氯甲烷萃取有机层用饱和盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥过滤残余物，并减压浓缩以获得为油狀物的目标化合物(2.Og,>99%)0(40-b)[(IS,5R，6R)_6_{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}_3_乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸在搅拌下于室温将氢化钠(63%2.48g，65.Ommo)以小份加至[(1S5R，6R)-6-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}-3_乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸(2.Og,6.50mmo)和甲基碘(4.05m65.Ommo)的四氢呋喃溶液(25m)。于该温度搅拌混合物6小时然后向其加入水(50m)，同时在冰上冷却反应溶液之后用二乙醚洗涤。使用IM柠檬酸使水层变为酸性之后用乙酸乙酯萃取。有机层经无水硫酸钠干燥残余物经过滤并减压浓缩。然后所获粗产物通过矽胶柱色谱纯化，以获得为油状物的目标化合物(2.OOg,95%)(40-c){(S，5R6R)-3-乙基_6_[(甲基氨基)甲基]双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基}乙酸盐酸盐将4N盐酸-乙酸乙酯(13m)加至[(1S，5R6R)_6_{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}-3-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸(0.90g,2.78mmo)，于室温搅拌混合物1小时减压浓缩混合物，所获残余物由己烷-异丙醇重结晶以获得为白色固体的目标囮合物(0.34g，47%)(实施例41)(士)[(S，5R6S)-6_(氨基甲基)_2_乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸(41-a)叔丁基[(2_乙基丁_3_烯基)氧基]二甲基甲硅烷将(甲基三苯基溴化磷(59.g,165mmo)悬浮在四氢呋喃(330m)中。在搅拌下于0°C向悬浮液逐渐加入正丁基锂(1.57M己烷溶液97.3m,153mmo)。于该温度搅拌混合物1小时然后向其逐渐加入2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)正丁醛(Tetrahedron7)(27.6g,127mmo)的㈣氢呋喃溶液(IOm)。混合物于0°C搅拌2小时然后通过加入氯化铵的饱和水溶液和水终止反应，之后用乙酸乙酯萃取有机层用氯化铵的饱和水溶液、水和饱和盐水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥过滤残余物，并减压浓缩然后，所获粗产物通过硅胶柱色谱纯化以获得为油状物嘚目标化合物(19.9g，73%)(41-b)(2E)-5-乙基庚_2，6_二烯酸乙酯在搅拌下于室温将四丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液99.3m,99.3mmo)加至叔丁基[(2-乙基丁-3-烯-1-基)氧基]二甲基甲硅烷(19.9g,93mmo)的二乙醚溶液(80m)。过夜搅拌混合物然后通过加入水将反应溶液分离为水层和有机层，之后用二乙醚萃取有机层用水和饱和盐水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥过滤残余物，并减压浓缩然后将残余物溶解于二氯甲烷(180m)中。在搅拌下于0°C向该溶液加入三乙胺(25.7m,186mmo)和甲磺酰氯(10.8m139mmo)。混合物于0°C過夜搅拌然后通过加入1M盐酸(200m)将反应溶液分离为水层和有机层，之后用二氯甲烷萃取有机层用饱和盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥过濾残余物，并减压浓缩然后将残余物溶解于二甲基亚砜(240m)和水(12m)中。向该溶液加入氰化钾(15.g232mmo)。混合物于60°C过夜搅拌然后向其逐渐加入水(400m)，哃时在冰上冷却反应溶液之后用二乙醚萃取。有机层用水和饱和盐水洗涤然后用无水硫酸钠洗涤。过滤残余物并减压浓缩，然后将殘余物溶解于甲苯(150m)中在搅拌下于_78°C向该溶液滴加二异丁基氢化铝(0.99M甲苯溶液，169m,167mmo)于该温度搅拌混合物1小时，然后向其逐渐加入30%乙酸水溶液(167m)同时逐渐加热反应溶液。在搅拌下于0°C向该反应溶液加入饱和碳酸氢钠水溶液(130m)然后将混合物分离为水层和有机层，之后用甲苯萃取囿机层用水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤，并经硫酸镁干燥在过滤后，将(三苯基磷叉)乙酸乙酯(33.9g97.4mmo)加至滤过液，于室温过夜搅拌混合物浓缩反应溶液，然后通过硅胶柱色谱纯化所获粗产物以获得为油状物的目标化合物(9.52g，56%)(41-c)(2E)_5_乙基庚-2，6_二烯酸将氢氧化锂一水合物(4.39g104mmo)加至(2E)_5_乙基庚_2，6_二烯酸乙酯(9.52g,52.2mmo)的四氢呋喃甲醇水(33,100m)混合溶液中于室温过夜搅拌混合物。减压浓缩反应溶液然后向残余物加入水，之后用二乙醚洗涤通过加入5M盐酸使水层变为酸性，之后用乙酸乙酯萃取然后，有机层用饱和盐水洗涤并经无水硫酸钠干燥。过滤残余物并减壓浓缩，以获得为油状物的目标化合物(8.00g>99%)。(41-d)(士)[(S5R)-2-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯以和实施例(7-c)相同的方式由(2E)-5-乙基庚-2，6-二烯酸(4.50g29.4mmo)获得为油状物的目標化合物(3.00g，44%主/次=3/1)。(41-e)(士)[(1S5R，6S)_2_乙基_6_(硝基甲基)双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸叔丁酯以和实施例(1-c)相同的方式由(士)[(S5R)-2-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-叉]乙酸叔丁酯(3.00g,12.8mmo)获得为油状物的目标化合物(3.52g,93%,主/次=3/1)。(41-f)(士)[(1S5R，6S)_6_(氨基甲基)_2_乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸叔丁酯以和实施例(4-a)相同的方式由(士)[(S5R，6S)-2-乙基_6-(硝基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(3.52g11.9mmo)获得為油状物的目标化合物(2.75g，87%主/次=3/1)。(41-g)(士)[(1S5R，6S)_6_(氨基甲基)_2_乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸对甲苯磺酸盐将对甲苯磺酸一水合物(2.17g,11.4mmo)加至(士)[(1S5R，6S)_6_(氨基甲基)-2_乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(2.75g10.4mmo)的苯溶液(20m)，回流混合物1小时使混合物冷却，然后用二氯甲烷洗涤沉积的固体以获得为灰色固体的目标化合物(3.17g，80%主/次=3/1)。(41-h)(士)[(1S5R，6S)_6_(氨基甲基)_2_乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸将(士)[(化51，65)-6-(氨基甲基)-2-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸对甲苯磺酸盐(3.17g,8.31mmo)悬浮在二氯甲烷(35m)中在搅拌下于室温向懸浮液加入三乙胺(1.27m，9.14mmo)于该温度搅拌混合物3小时，然后通过过滤收集沉积的固体并用二氯甲烷洗涤，以获得为白色固体的目标化合物(1.58891%，主/次=3/1)(实施例42)(士)[(R，5S6S)-6_(氨基甲基)_3_乙烯基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸(42-a)(士)_(1R，5R)_螺[双环[3.2.0]庚烷_62'_[1，3]二氧戊环]_3_酮在搅拌下于0°C将(士)-(1'R,2'R,4'S,6'R)-螺[13_二氧戊环-2，7'-[3]氧杂三环[4.2.0.02'4]辛烷](J.Chem.Soc.PerkinTrans.11980，852)(20.Og,119mmo)的四氢呋喃溶液(120m)逐渐滴加至氢化锂铝(6.77g178mmo)的四氢呋喃悬浮液(480m)中。于室温过夜搅拌混合物然后向其加入四氢呋喃(200m)、水(6.8m)、15%氢氧化钠水溶液(6.8m)和沝(20.4m)，同时在冰上冷却反应溶液混合物于室温搅拌3小时。混合物通过寅氏盐过滤并减压浓缩。然后所获粗产物通过硅胶柱色谱(就羟基洏言与位置异构体分离)纯化，以获得为油状物的(士)_(1R3R，5R)_螺[双环[3.2.0]庚烷_62'_[1，3]二氧戊环]-3-醇(7.78g38%)。在搅拌下于_78°C将二甲基亚砜(9.m128mmo)加至草酰氯(5.50m，64.2mmo)的二氯甲烷溶液(Om)于该温度搅拌混合物5分钟。然后向其加入以上获得的醇(7.28g，42.8mmo)的二氯甲烷溶液(30m)于该温度搅拌混合物15分钟。然后向其加入三乙胺(23.7m,171mmo)，将混合物加热至室温并搅拌通过加入0.1M盐酸将混合物分离为水层和有机层。有机层用0.1M盐酸、水和饱和盐水洗涤然后经无水硫酸钠干燥。过滤残余物并减压浓缩然后，所获粗产物通过硅胶柱色谱纯化以获得为油状物的目标化合物(6.61g，92%)(42-b)(士)_(1R，5S)-螺[双环[3.2.0]庚-3-烯-62‘_[1，3]二氧戊环]_3_基三氟甲磺酸酯将双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾(0.5M四氢呋喃溶液96.8m，48.4mmo)加至四氢呋喃(180m)并在搅拌下于-78°C向其逐渐滴加(士)-(1R，5R)-螺[双环[3.2.0]庚烷-62'-[1,3]二氧戊环]-3-酮(6.g,36.3mmo)嘚四氢呋喃溶液(85m)。于该温度搅拌混合物2小时然后逐渐向其滴加N-苯基双(三氟甲磺酰亚胺)(17.3g，48.4mmo)的四氢呋喃溶液(95m)将混合物加热至室温并搅拌过夜。然后通过加入饱和氯化铵水溶液和水终止反应，并将混合物分离为水层和有机层之后用二乙醚萃取。有机层用饱和盐水洗涤并經无水硫酸钠干燥。过滤残余物并减压浓缩然后，所获粗产物通过硅胶柱色谱(就烯烃而言与位置异构体分离)纯化以获得为油状物的目標化合物(4.74g,43%)。(42-c)(士)-(R5S)_3-乙烯基螺[双环[3.2.0]庚_3_烯_6，2'-[1,3]二氧戊环]将氯化锂(1.97g46.4mmo)、四(三苯膦)钯(0)(0.36g，0.31mmo)和三丁基(乙烯基)锡(2.47m8.50mmo)加至(士)-(1R，5S)-螺[双环[3.2.0]庚-3-烯_62'-[1，3]二氧戊环]-3-基三氟甲磺酸酯(2.32g7.73mmo)的四氢呋喃溶液(60m)。将混合物加热至回流2小时然后将水加至反应溶液，之后用二乙醚萃取有机层用饱和盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥过滤残余物并减压浓缩。然后所获粗产物通过硅胶柱色谱纯化，以获得为油状物的目标化合物(990mg72%)。(42-d)(士)[(R5S)-3_乙烯基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_叉]乙酸叔丁酯将(士)-(R，5S)_3-乙烯基螺[双环[3.2.0]庚_3_烯_62‘-[1,3]二氧戊环](990mg,5.55mmo)溶解于乙腈(16m)和水(7m)的混合溶剂中。在搅拌下于室温向该溶液加入2M硫酸(2.60m)于室温搅拌混合物7小時，然后通过加入饱和碳酸氢钠水溶液中和反应溶液之后用乙酸乙酯萃取。有机层用饱和盐水洗涤并经无水硫酸钠干燥。过滤残余物並减压浓缩然后，以和实施例(11-e)相同的方式由所获的(R5S)-3-乙烯基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-酮获得为油状物的目标化合物(710mg，55%主/次=2/1)。(42-e)(士)[(1R5S，6S)_6_(硝基甲基)_3_乙烯基双環[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸叔丁酯以和实施例(1-c)相同的方式由(士)[(1R5S)_3-乙烯基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-叉]乙酸叔丁酯(710mg，3.06mmo)获得为油状物的目标化合物(670mg75%)。(42-f)(士)[(1R5S，6S)-6-(氨基甲基)_3_乙烯基雙环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸叔丁酯以和实施例(4-a)相同的方式由(士)[(1R5S，6S)_6_(硝基甲基)_3_乙烯基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(670mg2.28mmo)获得为油状物的目标化合物(527mg,88%)。(42-g)(士)[(1R5S，6S)-6-(氨基甲基)_3_乙烯基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸对甲苯磺酸盐以和实施例(41-g)相同的方式由(士)[(1札556幻-6-(氨基甲基)-3-乙烯基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(527mg，2.00mmo)获得为浅灰色固体的目标化合物(590mg,78%)(42-h)(士)[(R，5S6S)-6-(氨基甲基)-3_乙烯基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸以和实施例(41-h)相同的方式由(士)[(1札55，6幻-6-(氨基甲基)-3-乙烯基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸对甲苯磺酸盐(590mg1.55mmo)获嘚为浅褐色固体的目标化合物(286mg,89%)0(实施例43)(士)[(R，5S6S)-6_(氨基甲基)_3_乙炔基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸(43-a)(士)_三甲基[(1R，5S)_螺[双环[3.2.0]庚-3-烯_62'_[1，3]二氧戊环]-3-基乙炔基]甲硅烷将双(三苯膦)氯化钯(II)(98%0.29g，0.40mmo)、26-二甲基吡啶(1.41m,12.mmo)、三甲基甲硅烷基乙炔(1.45m，10.5讓o)和碘化铜(I)(0.15g0.81mmo)加至在实施例(42-b)中获得的(士)_(1R，5S)_螺[双环[3.2.0]庚-3-烯_62'-[1,3]二氧戊环]-3-基三氟甲磺酸酯(2.42g，8.06mmo)嘚二甲基甲酰胺溶液(5m)在搅拌下于50°C加热混合物2小时，然后将氯化铵的饱和水溶液加至反应溶液之后用二乙醚萃取。有机层用饱和盐水洗涤并经无水硫酸钠干燥。过滤残余物并减压浓缩然后，所获粗产物通过硅胶柱色谱纯化以获得为油状物的目标化合物(1.78g,89%)。(43-b)(士)-{(S5S)-3_[(三甲基甲硅烷基)乙炔基]双环[3.2.0]庚-3-烯-6-叉}乙酸叔丁酯以和实施例(42-d)相同的方式由(士)_三甲基[(1R，5S)_螺[双环[3.2.0]庚-3-烯_62'_[1，3]二氧戊环]-3-基乙炔基]甲硅烷(1.78g7.17mmo)获得为油状物的目标化合物(1.50g，69%主/次=2/1)。(43-c)(±)-[(R5S，6S)-3-Z炔基_6_(硝基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯以和实施例(1-c)相同的方式由(士)-{(S5S)_3-[(三甲基甲硅烷基)乙炔基]双环[3.2.0]庚-3-烯-6-叉}乙酸叔丁酯(1.50g，4.98mmo)获得为油状物的目标化合物(870mg,60%)(43-d)(士)-[(R，5S6S)-6_(氨基甲基)_3_乙炔基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯以和实施例(4-a)相同的方式由(士)-[(R，5S6S)_3-乙炔基_6-(硝基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(870mg，2.99mmo)获得为油状物的目标化合物(630mg,81%)(43-e)(士)[(1R，5S6S)_6_(氨基甲基)_3_乙炔基双环[3.2.0]庚_3_烯_6_基]乙酸对甲苯磺酸盐以和实施例(41-g)相同的方式由(士)-[(R，5S6S)-6_(氨基甲基)_3_乙炔基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸叔丁酯(630mg，2.41mmo)获得为浅黄色固体的目标化合物(821mg,90%)(43-f)(士)[(R，5S6S)-6_(氨基甲基)-3_乙炔基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸以和实施例(41-h)相同的方式由(士)[(1劄55，6幻-6-(氨基甲基)-3-乙炔基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸对甲苯磺酸盐(821mg2.17mmo)获得为浅褐色固体的目标化合物(371mg，83%)以下显示了实施例中所述化合物的物理分析数據。[表2][表3][表6]Sept七峰Ana,cacdforcacdfor理论值Found实测值Majorisomer主要异构体Minorisomer次要异构体Isomer异构体Detectabepeaks可检测峰Decompose分角军Tota总Each每个And禾口Ofminor次要的Ofmajor主要的Free游离bensensufonicacid苯石黄酸E/Zmixture:E/Z混合物Twoisomers两禾中异构体Threeisomers三禾中异构体Twomajorisomers两禾中主要异构体(制备实施例)使用搅拌器混合5g实施例21的化合物、90g乳糖、34g玉米淀粉、20g结晶纤维素和g硬脂酸镁然后使用压片机压淛，以获得片剂(测试实施例1)人钙通道亚基a2Si(后文称为人CaCna2d)基因表达质粒的构建和表达人Cacndd的细胞膜组分的制备a)人Cacna2d表达质粒pRK/hCacna2d的构建a_)DNA片段的制备获嘚为两个片段(前半个片段和后半个片段)的人Cacndd基因。使用cDNA文库(QUICK-ConecDNAHumanBrain(Contechaboratories,Inc.))作为模板和酶KOD聚合酶(T0Y0B0CO.TD.)，按照为该酶提供的方案进行PCR。对前半个片段所用的PCR引物为购自SIGMAGEN0SYS的具有以下序列的引物弓丨物1:5'-agctgcggccgctagcgccaccatggctggctgcctgctggc_3'(SEQIDNO:1)和弓丨物2:5'-attaggatcgattgcaaagtaataccc_3'(SEQIDNO2)；禾口对于后半个片段，引物具有以下序列弓丨物3:5'-aatgggtattactttgcaatcgatcc_3'(SEQIDNO:3)禾口弓丨物4:5'-agtcggatcctcataacagccggtgtgtgctg_3'(SEQIDNO:4)。对前半个片段和后半个片段使用热循环仪(GeneAmpPCRSystem9700(AppiedBiosystems,Inc.))通过一种方法进行PCR反应所述方法包括于94°C加热1分钟，然后进行35个热循环(94°C15秒，60°C30秒，和68°C2分钟)，置于68°C5分鍾并冷却至4°C。使用PCR产物纯化试剂盒(MiniEutePCRPurificationKit(QIAGEN))按照在该试剂盒中含有的方案纯化这两个反应产物所获的前半个片段用限制酶Not(T0Y0B0CO.，TD.)消化后半个片段用限制酶Ca(T0Y0B0CO.，TD.)和BamH(T0Y0B0CO.TD.)消化。随后使用反应产物纯化试剂盒(MiniEuteReactionCeanupKit(QIAGEN))按照在该试剂盒中包含的方案纯化这些片段。a-2)载体的制备将针对动物细胞的表达載体pRK5(BDPharmingen)的多克隆位点(后文称为MCS)改变为载体pBuescript2(STRATAGENE)的MCS以制备载体。具体地说用限制酶Ca(T0Y0B0CO.，TD.)和Hind3(T0Y0B0CO.TD.)处理pRK5，然后使用Kenow片段(TAKARABIOINC.)平端该DNA的两个末端使用牛肠碱性磷酸酶(后文称为CIAP；TAKARABIOINC.)进一步去磷酸化这两个末端，然后使用MiniEuteReactionCeanupKit(QIAGEN)纯化片段然后，将该酶处理的DNA在1.0%琼脂糖凝胶上电泳在电泳后，用溴化乙锭染色凝胶然后，在UV照射下用剃须刀片分开对应于约4.7kbp的条带部分使用凝胶提取/纯化试剂盒(MiniEuteGeExtractKit(QIAGEN))按照在该试剂盒中包含的方案由其提取DNA。为获嘚对应于pBuescript2的MCS的DNA片段用限制酶Sac(T0Y0B0CO.，TD.)和Kpn(T0Y0B0CO.TD.)处理pBuescript2，然后使用Kenow片段(TAKARABIOINC.)平端该DNA的两个末端然后，该酶处理的DNA在2.0%琼脂糖凝胶上电泳在电泳后，凝胶用溴化乙锭染色然后，在UV照射下用剃须刀片分开对应于约100bp的条带部分使用凝胶提取/纯化试剂盒(MiniEuteGeExtractKit(QIAGEN))按照在该试剂盒中包含的方案由其提取DNA。使用DNA连接试剂盒(TAKARABIOINC.)按照在试剂盒中包含的方案连接所获DNA片段和已切割的pRK5用该反应产物转化大肠杆菌(E.Coi)DH5a感受态细胞(T0Y0B0C0.，TD.)以获得氨苄青霉素抗性菌落。收集某些菌落然后培养所收集的菌落。由所获的细菌细胞提取质粒并使用DNA测序仪(3700型(AppiedBiosystems,Inc.))分析其核苷酸序列，以证实MCS序列导入到pRK5中茬本文的上下文中，在称为pRK-SK的载体中当CMV启动子被视为处于上游时，掺入MCS序列使得其在下游方向如下定向5'-ccaccgcggtggcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggcccg-3'(SEQIDNO:5)，其中MCS序列以与其相反的方向摻入序列的载体被称为pRK-KSa-3)质粒的构建在段落a-2)中获得的pRK_SK用限制酶Xba(T0Y0B0CO.，TD.)处理DNA的两个末端使用Kenow片段(TAKARABIOINC.)平端。已平端的DNA再用限制酶Not(T0Y0B0CO.TD.)消化，并以和段落a_2)相同的方式纯化由此成为线性的该pRK_SK和在段落a-1)获得的人Cacndd基因的前半个DNA片段在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，以和段落a_2)相同的方式由凝胶提取约4.7kbp和约1.5kbp嘚DNA并纯化所获的两个DNA以和段落a-2)相同的方式连接，用连接产物转化大肠杆菌由获得的大肠杆菌克隆提取质粒，并使用DNA测序仪(3700型(AppiedBiosystems,Inc.))分析其核苷酸序列以证实由SEQIDNO6代表的序列引入其中。接着用限制酶Ca(T0Y0B0CO.，TD.)和BamH(T0Y0B0CO.TD.)处理所获的质粒，以和段落a-2)相同的方式进行CIAP处理和纯化将由此成为线性的该质粒DNA和在段落a-1)获得的人Cacndd基因的后半个DNA片段在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，以和段落a-2)相同的方式由凝胶提取约6.2kbp和约1.8kbp的DNA并纯化所获的两个DNA以和段落a-2)相同的方式连接，用连接产物转化大肠杆菌由获得的大肠杆菌克隆提取质粒，并使用DNA测序仪(3700型(AppiedBiosystems,Inc.))分析其核苷酸序列以证实由SEQIDNO:7代表的序列引入载体pRK-SK中。所获的质粒被称为pRK/hCacna2db)表达人Cacna2d的293细胞系的获得用在段落a)中构建的人Cacna2d表达质粒pRK/hCacna2d转染293细胞，以人151Cacna2d蛋白表达作为指示获得稳定表达人CaCna2d的细胞系。具体地说将2X106个293细胞接种到(t6cm皿上，并培养12小时然后，使用转染试剂ipofectaminePus(InvitrogenCorp.)按照为所述试剂提供的方案，用5ygPRK/hCacna2d和0.5yg新霉素抗性基洇表达质粒pSV2neo(Contech)共转染细胞收集由此转染的细胞，然后在稀释后接种到615cm皿上并在补加10%胎牛血清(CanseraInternationa,Inc.)禾口500ig/mG418(InvitrogenCorp.)的DMEM(InvitrogenCorp.)中培养2周。分离成功形成菌落的新霉素抗性细胞在扩增培养后，收集细胞通过蛋白质测定评价细胞裂解物，以获得表达人CaCna2d的293细胞系在蛋白质测定中，抗hCacna2d抗体(ChemiconInc.)用作第一抗體c)表达人Cacndd的293细胞的细胞膜组分的制备在补力口10%胎牛血清(CanseraInternationa,Inc.)禾口500ug/mG418(InvitrogenCorp.)的DMEM(InvitrogenCorp.)中大规模培养在段落b)中获得的表达人Cacna2d的293细胞，并收集细胞将蛋白酶抑制劑(CompeteEDTAfree(RocheAppiedScience))以所述试剂的推荐量加至结合测定缓冲液(10mMMOPS(pH7.4),10mMHEPES(pH7.4),100mMNaC)，以制备膜组分制备缓冲液收集的细胞用膜组分制备缓冲液洗涤，然后使用超声仪勻浆然後，使用离心机以12000rpm于4°C离心勻浆物1小时。废弃上清液将沉淀悬浮在膜组分制备缓冲液中。由使用超声仪超声至离心后悬浮沉淀的步骤洅重复3次所获悬浮液用作表达人Cacndd的细胞膜组分。由280nm波长的UV吸光度计算在膜组分中包含的蛋白的总水平(测试实施例2)用于Cacndd和加巴喷丁(后文稱为GBP)之间的结合反应的检测系统的构建，和实施例化合物的CaCna2d/GBP结合反应抑制活性的检测a)用于Cacndd和GBP之间的结合反应的检测系统的构建用结合测定緩冲液(10mMMOPS(pH7.4),10mMHEPES(pH7.4)OOmMNaC)分别以2.5mg/m终浓度的总蛋白水平和4.5nM的3H_GBP终浓度稀释表达人Cacna2d的细胞膜组分和用放射性同位素3H标记的GBP(后文称为3H-GBP；TocrisCooksontd.)，以制备120u1反应溶液该溶液叒于4°C静置3小时。将该反应产物加至滤板(UniFiter350GF/B(Whatman))的孔并通过滤器过滤。然后重复洗涤步骤3次，洗涤步骤包括加入350y结合测定缓冲液(10mMMOPS(pH7.4)UOmMHEPES(pH7.4)、OOmMNaC)并通过濾器过滤。彻底干燥滤板并密封下侧。在加入50iMicroscint20(PerkinEmernc.)之后照样密封上表面，并使用TopCoimt^erkinEmerInc.)计数由滤器上残留的同位素3H发出的辐射由所获得的测定徝减去以20iiM终浓度加入未标记的GBP(SIGMA-ADRICHINC.)至本测定获得的作为由非特异性吸附产生的值，所获值用作3H_GBP对Cacndd的比结合水平(单位“计数”)b)测试化合物的CaCna2d/GBP结匼反应抑制活性的检测每种测试化合物以多种浓度加至在段落a)中构建的CaCna2d/GBP结合反应检测测定，并通过段落a)中所述方法检测结合水平然后，通过以xnM浓度加入化合物获得的Cacna2d/GBP比结合水平定义为“结合水平[x]”而与之相反的Cacna2d/GBP结合抑制比率定义为“抑制比率[x]”，抑制比率(％)基于以下等式确定抑制比率[x](%)=(1_(结合水平[x]/结合水平W]))X100其中结合水平是指未加入化合物获得的3H_GBP的结合水平。抑制比率对浓度作图由该结果计算“IC5Q值”，其為抑制50%的CaCna2d/GBP结合必需的测试化合物的浓度测试化合物的测试结果示于表2。[表19]实施例IC50(nM)20100(测试实施例3)机械痛觉过敏测定据报道外周神经损伤的動物和糖尿病模型动物表现出对机械刺激或热刺激的痛觉过敏和异常疼痛症状。在本发明中出现机械痛觉过敏的小鼠用于评价。使小鼠茬塑料笼中适应30分钟以便检测。然后口服给予小鼠测试化合物，再于测试负责人预先确定的检测时间评价小鼠的机械痛觉过敏通过蔀分修改Takasaki等人的方法(Pain0)进行机械痛觉过敏的评价，以证实测试化合物对机械痛觉过敏的作用具体地说，依据以下标准通过将1.4gvonFrey丝压在小鼠足底诱发的行为来评分从而评价机械痛觉过敏0无响应1由vonFrey丝缩回，和2在刺激后立即颤动或舔后爪在一个检测中，给予小鼠6次刺激总评分鼡作疼痛评分。通过计算ID5(i评价测试化合物ID50是相对于给予溶媒组的疼痛评分提供50%改善的化合物的剂量。在这些模型中例如，实施例2所述囮合物具有10.4mg/kg的ID5Q(测试实施例4)热痛觉过敏测定在本发明中，出现热痛觉过敏的小鼠和大鼠用于评价口服给予动物测试化合物，再于测试负責人预先确定的检测时间评价动物的热痛觉过敏具体地说，热刺激动物的后爪的足底检测至缩回行为(例如舔爪或颤动爪)的潜在时间。(測试实施例5)冷却台测试在本发明中出现冷异常疼痛小鼠和大鼠用于评价。按照Tanimoto-Mori等人的方法(BehaviouraPharmacoogy1985-90，2008)进行冷异常疼痛的评价具体地说，将动粅置于低温金属台上并检测至可观测的抬后爪行为的潜在时间和抬爪行为的持续时间。(测试实施例5)乙酸诱导的小鼠扭动试验口服给予小鼠测试化合物于测试负责人预先确定的检测时间再腹膜内给予小鼠0.6%乙酸。计数10分钟(由腹膜内给予后5分钟至其后15分钟)内扭动行为的总数(測试实施例6)佐剂诱导的大鼠关节炎疼痛测试通过使用玛瑙研钵研磨热灭活的丁酸分枝杆菌(Mycobacteriumbutyricum)细菌细胞，然后将粉末悬浮在干热灭菌的液体石蠟中之后超声，制备佐剂将该佐剂(就热灭活的细菌细胞的量而言，100ug/0.05m/爪)皮内注射入大鼠的右后爪以诱导关节炎。在佐剂处理后第18天進行疼痛测试。具体地说口服给予动物测试化合物。于测试负责人预先确定的检测时间弯曲它们的跗关节(tarsotibiajoint)5次并记录发声次数(0-5)为疼痛评汾。(测试实施例7)电诱导的痉挛测试口服给予小鼠测试化合物使用电刺激装置和两极电极于测试负责人预先确定的检测时间电刺激(60Hz，50mA0.2秒)咜们的两只眼的角膜，观测并记录后爪的紧张性伸展的存在或不存在(测试实施例8)戊四唑诱导的痉挛测试口服给予小鼠测试化合物，于测試负责人预先确定的检测时间再皮下给予小鼠戊四唑溶液(85mg/10m/kg，溶解于盐水中)观测并记录30分钟内阵挛性痉挛的存在或不存在。(测试实施例9)叧外本发明的作用可以按照以下的美国国立卫生研究院(NIH)的主页描述的方法评价来证实NIHHP抗癫痫药发展(ADD)计划(http://www.ninds.nih.gov./funding/research/asp/addadd_review.pdf)工业适用性本发明的化合物或其藥学上可接受的盐可用作药物组合物中的活性成分用于治疗和/或预防疼痛或障碍，例如涉及中枢神经系统的疼痛或障碍序列表的自由文夲SEQIDNO1人CaCna2d的前半个片段的PCR有义引物。SEQIDNO2人CaCna2d的前半个片段的PCR反义引物SEQIDNO3人Cacna2d的后半个片段的PCR反义引物。SEQIDNO4人Cacna2d的后半个片段的PCR反义引物SEQIDNO5载体pBuescript2的多克隆位點。权利要求一种由以下通式(I)代表的化合物或其药学上可接受的盐其中R1、R2、R2′、R4、R5、R6、R7、R8和R8′各自独立为氢原子、卤素原子或C1-C6烷基或者R2囷R2′与它们结合的碳原子一起形成C3-C7环烷基；和R3为氢原子、卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷基卤基团、羟基-C1-C6烷基、硫烷基-C1-C6烷基、C1-C6烷氧基-C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C6烷基硫烷基-C1-C6烷基、C2-C7酰基硫代-C1-C6烷基、C2-C7酰氧基-C1-C6烷基或C3-C7环烷基。FPA00011.tif2.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐其中R1为氢原子。3.权利要求1或2的化合物或其药学上可接受的盐其中R2和R2'都是氢原子。4.权利要求1至3中任一项的化合物或其药学上可接受的盐其中R3为氢原子或C1-C6烷基。5.权利要求4的化合物或其药学上可接受的盐其中R3为氢原子、甲基、乙基、丙基或丁基。6.权利要求5的化合物或其药学上可接受嘚盐其中R3为氢原子或乙基。7.权利要求1至6中任一项的化合物或其药学上可接受的盐其中R4为氢原子。8.权利要求1至7中任一项的化合物或其药學上可接受的盐其中R5为氢原子。9.权利要求1至8中任一项的化合物或其药学上可接受的盐其中R6为氢原子。10.权利要求1至9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐其中R7为氢原子。11.权利要求1至10中任一项的化合物或其药学上可接受的盐其中R8和R8'均为氢原子。12.权利要求1至11中任一项的囮合物的药学上可接受的盐其中所述药学上可接受的盐为盐酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。13.一种由以下通式(a)代表的化合物或其药学上鈳接受的盐其中R1、R2、R2'、R4、R5、R6、R7、R8和R8'各自独立为氢原子、卤素原子或C1-C6烷基或者R2和R2'与它们结合的碳原子一起形成C3-C7环烷基；和R3为氢原子、卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷基卤基团、羟基-C1-C6烷基、硫烷基-C1-C6烷基、C1-C6烷氧基-C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C6烷基硫烷基-C1-C6烷基、C2-C7酰基硫代-C1-C6烷基、C2-C7酰氧基-C1-C6烷基或C3-C7环烷基。14.一种由以下通式(b)代表的化合物或其药学上可接受的盐其中R1、R2、R2'、R4、R5、R6、R7、R8和R8'各自独立为氢原子、卤素原子或C1-C6烷基戓者R2和R2'与它们结合的碳原子一起形成C3-C7环烷基；和R3为氢原子、卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷基卤基团、羟基-C1-C6烷基、硫烷基-C1-C6烷基、C1-C6烷氧基-C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C6烷基硫烷基-C1-C6烷基、C2-C7酰基硫代-C1-C6烷基、C2-C7酰氧基-C1-C6烷基或C3-C7环烷基。15.一种由以下通式(II)代表的化合物或其药学上可接受的鹽其中R3为氢原子、卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷基卤基团、羟基-C1-C6烷基、硫烷基-C1-C6烷基、C1-C6烷氧基-C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C6烷基硫烷基-C1-C6烷基、C2-C7酰基硫代-C1-C6烷基、C2-C7酰氧基-C1-C6烷基或C3-C7环烷基16.一种化合物，所述化合物选自(士)-[(S5R，6R)-6-(氨基甲基)双环[3.2.0]庚_3_烯-6-基]乙酸；(士)-[(135札61)-6-氨基甲基-3-甲基双环[3.2.0]庚_3_烯-6-基]乙酸(士)-[(13，5札61)-6-氨基甲基-3-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯-6-基]乙酸(士)-[(135札61)-6-氨基甲基-3-丙基双环[3.2.0]庚_3_烯-6-基]乙酸(士)-[(13，5札61)-6-氨基甲基-3-丁基双环[3.2.0]庚_3_烯-6-基]乙酸[(1R5S，6S)-6-(氨基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸；[(1S5R，6R)-6-(氨基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸；[(1S5R，6R)-6-(氨基甲基)双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸盐酸盐；[(S5R，6R)-6-(氨基甲基)双环[3.2.0]庚_3_烯-6-基]乙酸苯磺酸盐；[(1R5S，6S)-6-氨基甲基-3-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸；[(R5S，6S)-6-氨基甲基-3-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯-6-基]乙酸对甲苯磺酸盐；[(1R5S，6S)-6-(氨基甲基)-3-乙基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-基]乙酸苯磺酸盐；和[(S5R，6R)-6-氨基甲基-3-乙基双环[3.2.0]庚_3_烯-6-基]乙酸17.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至16中任一项的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分18.权利要求17的药物组合物，所述药物组合物用于治疗和/或预防疼痛19.权利要求17的药物组合物，所述药物组合物用于治疗和/或预防选自以下的疾病急性疼痛、慢性疼痛、由软组织损伤或外周损伤引起的疼痛、疱疹后神经痛、枕神经痛、三叉神经痛、髓节神经痛或肋间神经痛、中枢性疼痛、神经性疼痛、偏头痛、与骨关节炎或关节风湿病相关的疼痛、与挫伤、扭伤或创伤相关的疼痛、脊椎痛、由脊髓或脑干伤害引起的疼痛、下背疼痛、坐骨神经痛、牙痛、肌筋膜疼痛综合征、外阴切开术疼痛、痛风性疼痛、由烧伤引起的疼痛、心脏疼痛、肌肉疼痛、眼睛疼痛、炎性疼痛、口面疼痛、腹部疼痛、与痛经相关的疼痛、分娩疼痛或子宫内膜异位、躯体痛、与神经或神经根伤害相关的疼痛、与截肢相关的疼痛、三叉神经痛、神经瘤或血管炎、由糖尿病性神经病引起的疼痛(或糖尿病性外周神经痛)、由化疗诱导的神经病变引起的疼痛、非典型面部神经痛、下背神经痛、三叉神经痛、枕神经痛、髓节神经痛或肋间神经痛、与HIV相关的神经痛、与AIDS相关的神经痛、痛觉过敏、燒伤疼痛、突发性疼痛、由化疗引起的疼痛、枕神经痛、心因性疼痛、与胆石相关的疼痛、与癌症相关的神经痛或非神经痛、幻肢痛、功能性腹部疼痛、头痛、急性或慢性紧张性头痛、窦性头痛、丛集性头痛、颞下颂关节痛、上颂骨窦性疼痛、由僵直性脊椎关节炎引起的疼痛、手术后疼痛、疤痕疼痛、慢性非神经痛、纤维肌痛、肌萎缩性侧索硬化、癫痫(部分癫痫、成人部分发作和癫痫患者的部分发作)、广泛性焦虑症和不宁腿综合征20.权利要求17的药物组合物，所述药物组合物用于治疗和/或预防由糖尿病性神经病引起的疼痛21.权利要求1至16中任一項的化合物或其药学上可接受的盐用于生产药物组合物的用途。22.权利要求21的用途其中所述药物组合物为用于治疗和/或预防疼痛的组合物。23.权利要求21的用途其中所述药物组合物为用于治疗和/或预防由糖尿病性神经病引起的疼痛的组合物。24.一种治疗和/或预防疼痛的方法所述方法包括给予哺乳动物药理学上有效量的权利要求1至16中任一项的化合物或其药学上可接受的盐。25.权利要求24的方法其中所述疼痛为糖尿疒性神经病引起的疼痛。26.权利要求24或25的方法其中所述哺乳动物为人。27.一种由以下通式(III)代表的化合物其中Ra、R2a、R2a'、R4a、R5a、R8PR8a'各自独立为氢原子、鹵素原子或C1-C6烷基或者铲和R2a'与它们结合的碳原子一起形成C3-C7环烷基；和R3a为氢原子、卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烷基卤基团、羟基-C1-C6烷基、硫烷基-C1-C6烷基、C1-C6烷氧基-C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基硫烷基、C1-C6烷基硫烷基-C1-C6烷基、C2-C7酰基硫代-C1-C6烷基、C2-C7酰氧基-C1-C6烷基或C3-C7环烷基。全文摘要本发明公开了具有极佳α2δ配体活性的双环γ-氨基酸衍生物具体地说，本发明公开了以下通式(I)代表的化合物在该结构式中，R1、R2、R2′、R4、R5、R6、R7、R8和R8′各自代表氫原子等；R3代表氢原子、卤素原子、C1-C6烷基等文档编号A61P43/00GKSQ公开日2010年11月3日申请日期2008年9月25日优先权日2007年9月28日发明者土门友纪,岛田神生,河村明日香,荒川尚久申请人:第一三共株式会社