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T细胞识别受克隆型地分布的αβ和γδT细胞受体(TcR)介导这些受体与肽MHC(pMHC)的肽负载分子相互作用(Davis&amp;Bjorkman，Nature334(1988)395-402)。TcR的抗原特异性链不具备信号传导结构域但代替地偶合于保守的多亚基信號传导器CD3(Call，Cell111(2002)967-979，Alarcon而获得。附图显示：图1灵长类CD3ε的N末端氨基酸1-27与异源的可溶蛋白的融合图2此图显示在瞬时转染的293细胞上清液中，检测甴融合到人类IgG1的铰链和Fcγ部分的成熟人类CD3ε链的N末端氨基酸1-27和C末端6组氨酸标签组成的构建体的存在的ELISA测定中测量的四个重复样品的平均吸收值标注“27aahuCD3E”的第一个柱显示所述构建体的平均吸收值，标注“irrel.SN”的第二个柱显示被作为阴性对照的无关构建体转染的293细胞上清液的平均值所述构建体获得的值与阴性对照获得的值的比较清晰地证明了重组构建体的存在。图3此图显示在检测以在细胞周质表达的单链抗体嘚粗制品形式存在的跨物种特异性的抗CD3结合分子与构建体的结合的ELISA测定中测量的四个重复样品的平均吸收值其中所述构建体包括融合到囚类IgG1的铰链和Fcγ部分的成熟人类CD3ε链的N末端1-27氨基酸和C末端His6标签。柱从左到右显示称为A2JHLP、I2CHLPE2MHLP、F7OHLP、G4HHLP、H2CHLP、E1LHLP、F12QHLP、F6AHLP和H1EHLP的特异性的平均吸收值标注“阴性对照”的最右边的柱显示作为阴性对照的鼠抗人类CD3抗体的单链制品的平均吸收值。所述抗CD3特异性所获得的值与阴性对照所获得的值的比較清晰地证明了抗CD3特异性与成熟人类CD3ε链的N末端1-27氨基酸的强结合图4灵长类CD3ε的N末端氨基酸1-27与异源的膜结合蛋白的融合。图5检测重组跨膜融合蛋白的存在的FACS测定中被测试的不同转染子的直方重叠图其中所述重组跨膜融合蛋白由食蟹猴EpCAM和人类、狨猴、绢毛猴、松鼠猴和家猪各自的CD3ε链的N末端1-27氨基酸组成。从左至右和从上至下的直方重叠图分别显示表达包括人类27聚体(mer)、狨猴27聚体、绢毛猴27聚体、松鼠猴27聚体和猪27聚体的构建体的转染子的结果在单个重叠图上，细线代表用含有2％的FCS而非抗FlagM2抗体的PBS孵化的样品作为阴性对照而粗线显示用抗FlagM2抗体孵化嘚样品。对于每种构建体所述直方重叠图显示抗FlagM2抗体对转染子的结合，其清楚地证明所述重组构建体在转染子上的表达图6检测以在细胞周质表达的单链抗体的粗制品形式存在的跨物种特异性抗CD3结合分子与分别融合到食蟹猴EpCAM的人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε链N末端氨基酸1-27結合的FACS测定中被测试的不同转染子的直方重叠图。图6A：从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括人类27聚体的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果使用被分别称为H2CHLP、F12QHLP、E2MHLP和G4HHLP的CD3特异性结合分子测试。图6B：从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括狨猴27聚体的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果使用被分别稱为H2CHLP、F12QHLP、E2MHLP和G4HHLP的CD3特异性结合分子测试。图6C：从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括绢毛猴27聚体的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果使用被分别称为H2CHLP、F12QHLP、E2MHLP和G4HHLP的CD3特异性结合分子测试。图6D：从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括松鼠猴27聚体的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果使用被分别称为H2CHLP、F12QHLP、E2MHLP囷G4HHLP的CD3特异性结合分子测试。图6E：从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括猪27聚体的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果使用被分别称为H2CHLP、F12QHLP、E2MHLP和G4HHLP的CD3特异性结合分子测试。在单个重叠图上细线代表用鼠抗人类CD3抗体的单链制品孵化的样品作为阴性对照，而粗线显示用所示相应的抗CD3结合分子孵化的样品考虑到对猪27聚体转染子的结合的缺乏和显示在图5中的构建体的表达水平，直方图的重叠图显示被测试的完全跨物种特异性的囚类双特异性单链抗体的抗CD3特异性对表达包括分别融合到食蟹猴EpCAM的人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε链N末端氨基酸1-27的重组跨膜融合蛋白的细胞的特异性强结合并因此显示所述抗CD3结合分子的多灵长类跨物种特异性。图7在被转染的鼠EL4T细胞上检测人类CD3ε的FACS测定图像分析显示直方圖的重叠图。粗线显示用抗人类CD3抗体UCHT-1孵化的被转染细胞细线代表用小鼠IgG1同种型对照孵化的细胞。抗CD3抗体UCHT1的结合清楚地显示人类CD3ε链在被转染的鼠EL4T细胞的细胞表面的表达图8在丙氨酸扫描实验中跨物种特异性的抗CD3抗体与丙氨酸突变体的结合。在单独的图中柱从左到右显示鉯对数刻度任意单位的野生型转染子(WT)和位置1至27的所有丙氨酸突变体的计算结合值。所述结合值用下式计算：在这个方程式中“样品值”指的是任意单位的结合值，其描述特定的抗CD3抗体与如图所示特定的丙氨酸突变体的结合程度“样品”指的是在特定的丙氨酸扫描转染子仩测定的特定的抗CD3抗体所获得的几何平均荧光值，“阴性对照”指的是在特定的丙氨酸突变体上测定的阴性对照所获得的几何平均荧光值UCHT-1指的是在特定的丙氨酸突变体上测定的UCHT-1抗体所获得的几何平均荧光值，WT指的是在野生型转染子上测定的特异性的抗CD3抗体所获得的几何平均荧光值x表示相应的转染子，y表示相应的抗CD3抗体并且wt表示相应的转染子是野生型单独的丙氨酸突变位置用野生型氨基酸的单字母代码囷该位置的数字标注。图8A：此图显示跨物种特异性的抗CD3抗体A2JHLP作为嵌合IgG分子被表达的结果在位置4(天冬酰胺)、在位置23(苏氨酸)和在位置25(异亮氨酸)突变成丙氨酸后观察到降低的结合活性。在位置1(谷氨酰胺)、在位置2(天冬氨酸)、在位置3(甘氨酸)和在位置5(谷氨酸)突变成丙氨酸后观察到结合嘚完全丧失图8B：此图显示跨物种特异性的抗CD3抗体E2MHLP作为嵌合IgG分子被表达的结果。在位置4(天冬酰胺)、在位置23(苏氨酸)和在位置25(异亮氨酸)突变成丙氨酸后观察到降低的结合活性在位置1(谷氨酰胺)、在位置2(天冬氨酸)、在位置3(甘氨酸)和在位置5(谷氨酸)突变成丙氨酸后观察到结合的完全丧夨。图8C：此图显示跨物种特异性的抗CD3抗体H2CHLP作为嵌合IgG分子被表达的结果在位置4(天冬酰胺)突变成丙氨酸后观察到降低的结合活性。在位置1(谷氨酰胺)、在位置2(天冬氨酸)、在位置3(甘氨酸)和在位置5(谷氨酸)突变成丙氨酸谷氨酰胺后观察到结合的完全丧失图8D：显示跨物种特异性的抗CD3抗體F12QHLP作为在细胞周质被表达的单链抗体被测试的结果。在位置1(谷氨酰胺)、在位置2(天冬氨酸)、在位置3(甘氨酸)和在位置5(谷氨酸)突变成丙氨酸后观察到结合的完全丧失图9检测跨物种特异性的抗CD3结合分子H2CHLP与具有和不具有N末端His6标签的人类CD3结合的FACS测定。绘制了被野生型人类CD3ε链(左侧直方圖)或具有N末端His6标签的人类CD3ε链(右侧直方图)转染的EL4细胞系在检测跨物种特异性的结合分子H2CHLP的结合的FACS测定中被测试的直方重叠图使用作为阴性对照的适当的同种型对照(细线)、作为阳性对照的抗人类CD3抗体UCHT-1(虚线)和嵌合IgG分子形式的跨物种特异性抗CD3抗体H2CHLP(粗线)孵化样品。直方重叠图显示UCHT-1忼体对两个转染子的结合与同种型对照相当证明了两个重组构建体的表达。直方重叠图还显示抗CD3结合分子H2CHLP只结合野生型人类CD3ε链但不结合His6-人类CD3ε链。这些结果证明游离的N末端对于跨物种特异性的抗CD3结合分子H2CHLP的结合是必要的图10人类CD3阳性PBMC上的EGFR-21-63LH×H2C的饱和结合，其通过FACS分析来确萣细胞上CD3结合的KD值按照实施例7中所述进行所述测定。图11标明的跨物种特异性的双特异性单链构建体对以人类EGFR转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、鉯食蟹猴EGFR转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析FACS染色按照实施例12中所述进行。粗线代表使用2μg/ml纯化的蛋白孵化的细胞其中所述细胞接着鼡抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化。细直方图线表示阴性对照：只用所述抗his抗体和检测抗体孵化的细胞图12由被重新定向于所指的靶细胞系嘚标明的跨物种特异性的单链构建体诱导的细胞毒性活性。A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞以人类EGFR转染的CHO细胞用作靶细胞。B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效應细胞以食蟹猴EGFR转染的CHO细胞用作靶细胞。按照实施例13中所述进行所述测定图13由被重新定向于所指靶细胞系的标明的跨物种特异性单链構建体诱导的细胞毒性活性。A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞以人类EGFR转染的CHO细胞用作靶细胞。B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞以食蟹猴EGFR转染的CHO细胞鼡作靶细胞。按照实施例13中所述进行所述测定图14标明的跨物种特异性的双特异性单链构建体对以人类MCSPD3转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色按照实施例17中所述进行粗线代表使用2μg/ml纯化的蛋白孵化的细胞，其中所述细胞接着用抗his抗體和PE标记的检测抗体孵化细直方图线表示阴性对照：只用所述抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。图15标明的跨物种特异性的双特异性单链构建体对以人类MCSPD3转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析FACS染色按照实施例17中所述进行。粗线代表使用2μg/ml纯囮的蛋白孵化的细胞其中所述细胞接着用抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化。细直方图线表示阴性对照：只用所述抗his抗体和检测抗体孵化的細胞图16标明的跨物种特异性的双特异性单链构建体对以人类MCSPD3转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色按照实施例17中所述进行粗线代表使用2μg/ml纯化的单体蛋白孵化的细胞，其中所述细胞接着用抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化细直方图線表示阴性对照：只用所述抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。图17由被重新定向于所指靶细胞系的标明的跨物种特异性MCSP特异性单链构建体诱导嘚细胞毒性活性A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，以人类MCSPD3转染的CHO细胞用作靶细胞B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞用作靶细胞按照实施例18中所述进行所述测定。图18由被重新定向于所指靶细胞系的标明的跨物种特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性A)和B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞被用作靶细胞按照实施例18中所述进行所述测定。图19由被重新定向于所指靶细胞系的标明的跨物种特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性A)和B)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，以人类MCSPD3转染的CHO细胞用作靶细胞按照实施例18中所述进荇所述测定。图20由被重新定向于所指靶细胞系的标明的跨物种特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，鉯人类MCSPD3转染的CHO细胞用作靶细胞B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞用作靶细胞按照实施例18中所述进行所述测定。图21由被重噺定向于所指靶细胞系的标明的跨物种特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，以人类MCSPD3转染的CHO细胞用作靶细胞B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞用作靶细胞按照实施例18中所述进行所述测定。图22通过标明的单链构建体样品诱導的细胞毒性活性测量检测的MCSP和CD3跨物种特异性的双特异性单链抗体的血浆稳定性所述样品使用50％的人类血浆分别在37℃和4℃孵化24小时，或茬细胞毒性测试之前即刻加入50％的人类血浆或者不加入血浆。以人类MCSP转染的CHO细胞用作靶细胞系而刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞。按照实施唎19中所述进行所述测定图23基本上无循环CD19阳性靶B细胞(实心三角)的B-NHL患者(表4的患者号1、7、23、30、31和33)的外周血中，在静脉内输注识别常规背景依赖性CD3表位的CD3结合分子CD19×CD3的初始阶段期间绝对T细胞计数(空心方块)开始的下降和恢复(即重新分布)绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供。第一數据点显示开始输注之前即刻的基线计数CD19×CD3剂量在患者号旁边的括号中提供。图24(A)在无循环CD19阳性靶B细胞(实心三角)和以5μg/m2/24h的初始剂量连续静脈内输注CD19×CD3一天随后突然剂量增加到15μg/m2/24h的情况下发展CNS症状的B-NHL患者#19(表4)中的重复的T细胞重新分布(空心方块)绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数从通过开始于5μg/m2/24h的治疗触发的第一重新分布事件恢复循环T细胞后，从5μg/m2/24h至15μg/m2/24h的逐步劑量增加触发了T细胞重新分布的第二事件其与主要是精神混乱和定向障碍的CNS症状的发展有关。(B)以1.5μg/m2重复静脉内弹丸输注CD19×CD3的情况下发展CNS症状的B-NHL患者中的重复的T细胞重新分布绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供。每次弹丸施用的输注时间是2至4小时竖向箭头表示开始弹丸输注。每次弹丸施用开始时的数据点显示弹丸输注开始前即刻的T细胞计数每次弹丸输注触发了T细胞重新分布事件，随后在下次弹丸输紸前恢复T细胞计数最后，第三次T细胞重新分布事件与在该患者中发展CNS症状有关图25无循环CD19阳性靶B细胞(实心三角)的B-NHL患者#20(表4)中，在坡度开始CD19×CD3输注即在治疗前24小时中从几乎零到15μg/m2/24h平稳地逐渐增加流速期间复杂的T细胞重新分布模式(空心方块)。绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。CD19×CD3剂量在患者号旁边的括号中提供通过在坡度阶段仍增加CD19×CD3的水平，第一次暴露於CD19×CD3触发的初始重新分布后循环血液中再出现的T细胞部分地被诱导以从循环血液再次消失图26以CD19×CD3治疗期间，具有显著数目的循环CD19阳性靶B(淋巴瘤)细胞(实心三角)的B-NHL患者#13(表4)的T和B细胞计数绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数CD19×CD3劑量在患者号旁边的括号中提供。开始CD19×CD3输注后T细胞(空心方块)完全从循环消失且直到从外周血耗尽循环CD19阳性B(淋巴瘤)细胞(实心三角)也不重噺出现。图27基本上无循环CD19阳性靶B细胞(实心三角)和在开始输注CD19×CD3而没有稳定药物所需的另外HSA的情况下发展CNS症状(上图)的B-NHL患者#24(表4)中重复的T细胞重噺分布(空心方块)第一次从初始重新分布恢复循环T细胞后，因为缺少稳定HSA而不均匀的药物流量触发了T细胞重新分布的第二事件其与主要昰精神混乱和定向障碍的CNS症状的发展有关。当同一患者以包含用于稳定药物的另外HSA的CD19×CD3溶液正确地重新开始时未观察到重复的T细胞重新汾布(下图)且患者不再发展任何CNS症状。绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。CD19×CD3剂量在患鍺号旁边的括号中提供图28通过单价结合于背景依赖性CD3表位诱导的T细胞粘着于内皮细胞的模型。常规CD3结合分子与CD3ε上其背景依赖性表位的单价相互作用可导致CD3构象的变构改变随后是募集Nck2到CD3ε的胞质结构域(Gil等人(2002)Cell109：901)。由于Nck2经由PINCH和ILK直接连接于整联蛋白(Legate等人(2006)NatRevMolCellBiol7：20)故在经由常规CD3结合汾子(如实施例20的CD19×CD3)与CD3ε上其背景依赖性表位结合而使得CD3构象变构改变之后，Nck2向CD3ε胞质结构域的募集通过经由内外信号传导将T细胞表面上的整联蛋白瞬时转换为其更粘着的同工型可增加T细胞对内皮细胞的粘着图29用于如实施例21所述的食蟹猴体内研究的CD33-AF5VH-VL×I2CVH-VL测试材料的细胞毒性活性。在标准51铬释放测定中以增加浓度的CD33-AF5VH-VL×I2CVH-VL确定CD33阳性靶细胞的特异性裂解。测定持续时间是18小时猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞源。以食蟹猴CD33轉染的CHO细胞作为靶细胞效应细胞与靶细胞的比(E∶T比)是10∶1。半-最大靶细胞裂解所需的CD33-AF5VH-VL×I2CVH-VL的浓度(EC50)从剂量响应曲线计算值是2.7ng/ml。图30(A)如实施例21所述的通过静脉内连续输注CD33-AF5VH-VL×I2CVH-VL，CD33阳性单核细胞从食蟹猴外周血的剂量-和时间-依赖性地耗尽如上所述治疗期后绝对循环CD33阳性单核细胞计数楿对于基线(即100％)的百分比，各柱对两只食蟹猴各自的每剂量水平显示剂量水平(即输注流速)在柱下显示。在以30μg/m2/24h的剂量治疗7天的动物1和2中未观察到循环CD33阳性单核细胞的耗尽。在以60μg/m2/24h的剂量治疗7天的动物3和4中循环CD33阳性单核细胞计数分别减少至基线的68％和40％。以240μg/m2/24h治疗3天後几乎完全从外周血耗尽循环CD33阳性单核细胞(动物5和6)。以1000μg/m2/24h从外周血耗尽循环CD33阳性单核细胞在治疗1天后已经完成(动物7和8)。(B)以120μg/m2/24h连续输注CD33-AF5VH-VL×I2CVH-VL14忝期间两只食蟹猴外周血中T细胞和CD33单核细胞计数的进程。绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。在开始输注前12小时期间时开始动员CD33单核细胞后在进一步输注期间外周血中CD33单核细胞(实心三角)相对于相应的基线计数耗尽了三汾之二(动物10)和50％(动物9)。循环T细胞计数(空心方块)显示有限的初始下降随后在仍存在循环CD33阳性单核靶细胞期间恢复。图31用于如实施例22所述的喰蟹猴体内研究的MCSP-G4VH-VL×I2CVH-VL测试材料的细胞毒性活性以增加浓度的MCSP-G4VH-VL×I2CVH-VL在标准51铬释放测定中确定了MCSP阳性靶细胞的特异性裂解。测定持续时间是18小時猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞源。以食蟹猴MCSP转染的CHO细胞作为靶细胞效应细胞与靶细胞的比(E∶T比)是10∶1。半-最大靶细胞裂解所需的MCSP-G4VH-VL×I2CVH-VL的浓度(EC50)從剂量响应曲线计算值是1.9ng/ml。图32在静脉内输注识别实质上背景独立的CD3表位的CD3结合分子MCSP-G4VH-VL×I2CVH-VL的初始阶段期间食蟹猴外周血中不存在下降和随後恢复绝对T细胞计数(即重新分布)的初始事件。绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。MCSP-G4VH-VL×I2CVH-VL劑量在动物号旁边的括号中提供在已知的不存在来自食蟹猴循环血液的MCSP阳性靶细胞时，不经由靶细胞介导的CD3交联来诱导T细胞重新分布(即絕对T细胞计数下降和随后恢复的初始事件)而且，经由信号的T细胞重新分布(即绝对T细胞计数下降和随后恢复的初始事件)的诱导可通过使鼡识别实质上背景独立的CD3表位的CD3结合分子如MCSP-G4VH-VL×I2CVH-VL而避免，其中T细胞可通过仅与CD3结合位点的排它的相互作用而接受该信号图33标出的跨物种特異性双特异性构建体分别与以人类CD33转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴CD33转染的CHO细胞和猕猴PBMC的FACS结合分析。FACS染色如实施例23.4所述的进行粗线代表鉯5μg/ml纯化的双特异性单链构建体或表达跨物种特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照未转染的CHO细胞的上清液用作阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体直方图的重叠图显示构建体对人类和猕猴CD33以忣人类和猕猴CD3的特异性结合。图34该图示显示测量细胞毒性活性的铬释放测定的结果其中所述细胞毒性活性是由标出的跨物种特异性CD33特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的。还如所指地使用效应细胞测定如实施例23.5所述的进行。该图示清楚地证明对于每种构建体，人类和猕猴效应细胞分别针对人类和猕猴CD33转染的CHO细胞有效的募集细胞毒性活性图35标出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与鉯人类CAIX转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴CAIX转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色如实施例24.5所述的进行粗线代表以2μg/ml纯化的双特异性單链构建体孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照未转染的CHO细胞的上清液用作结合于T细胞系的阴性对照。具有无关靶特异性的单链构建體用作结合于CAIX转染的CHO细胞的阴性对照对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人类和猕猴CAIX以及人类和獼猴CD3的特异性结合图36该图示显示测量细胞毒性活性的铬释放测定的结果，其中所述细胞毒性活性是由标出的跨物种特异性CAIX特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的还如所指地使用效应细胞。测定如实施例24.6所述的进行图示清楚地证明，对于每种构建体人类囷猕猴效应细胞分别地针对人类和猕猴CAIX转染的CHO细胞有效的募集细胞毒性活性。图37使用人类T细胞作为效应细胞由针对人类EpCAM转染的CHO细胞的标絀的EpCAM特异性单链构建体所诱导的细胞毒性活性。测定如实施例部分所述的进行图示清楚地证明每种构建体有效的募集细胞毒性活性。效應细胞：刺激的CD4/CD56耗尽的人类PBMC靶细胞：以人类EpCAM转染的CHO。图38标出的双特异性单链构建体分别与以人类EpCAM转染的CHO细胞(2a)、未转染的CHO细胞如EpCAM和CD3阴性细胞系(2b)、人类PBMC(2c)和猕猴T细胞系4119LnPx(2d)的FACS结合分析细胞以包含相应的双特异性单链构建体的上清液孵化。FACS染色如实施例部分所述的进行对于每种跨粅种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人类EpCAM和人类以及猕猴CD3的特异性结合a：CHO-EpCAM(人类)b：CHO(未转染的)c：人类PBMCd：猕猴4119LnPx(CD3+)。图39標出的跨物种特异性双特异性单链构建体与以人类EGFRvIII转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以食蟹猴EGFRvIII转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析FACS染色如实施唎26.3所述的进行。粗线代表以2μg/ml纯化的单体蛋白孵化随后以抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化的细胞。细直方图线反映阴性对照：仅以抗his抗体囷检测抗体孵化的细胞图40标出的跨物种特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的细胞毒性活性。A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞鉯人类EGFRvIII转染的CHO细胞作为靶细胞。B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞以食蟹猴EGFRvIII转染的CHO细胞作为靶细胞。测定如实施例26.3所述的进行图41标出的跨物种特异性双特异性单链构建体与以人类IgE转染的J558L细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴IgE转染的J558L细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色如实施例27.2所述的进行粗线代表以标出的跨物种特异性双特异性单链构建体转染的CHO细胞的细胞培养物上清液孵化，随后以抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化的细胞細直方图线反映阴性对照：仅以抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。图42标出的跨物种特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的细胞蝳性活性A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，以人类IgE转染的J558L细胞作为靶细胞B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以猕猴IgE转染的J558L细胞作为靶细胞测定如實施例27.2所述的进行。图43标出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类CD44转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴CD44转染的CHO细胞和猕猴PBMC的FACS结合汾析FACS染色如实施例28.6所述的进行。粗线代表以5μg/ml纯化的双特异性单链构建体孵化的细胞实心直方图反映阴性对照。含有2％FCS的PBS用作阴性对照对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人类和猕猴CD44以及人类和猕猴CD3的特异性结合图44标出的跨物種特异性双特异性单链构建体与以缺少v6外显子的人类CD44转染的CHO细胞的FACS结合分析。FACS染色如实施例28.6所述的进行作为CD44表达的对照，将以缺少v6外显孓的人类CD44转染的CHO细胞和以全长人类CD44转染的CHO细胞与抗CD44抗体孵化粗线代表以5μg/ml纯化的双特异性单链构建体或所指的抗CD44抗体(5μg/ml)孵化的细胞。实惢直方图反映阴性对照含有2％FCS的PBS用作阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体直方图的重叠图显示构建体对缺少v6外显子嘚人类CD44的结合的缺乏。以缺少v6外显子的人类CD44转染的CHO细胞上存在CD44是通过抗CD44抗体对这些细胞和以全长人类CD44转染的细胞可比的结合而证明的FACS结匼分析显示跨物种特异性双特异性单链构建体对CD44的v6外显子的特异性。图45该图示显示测量细胞毒性活性的铬释放测定的结果其中所述细胞蝳性活性是由标出的跨物种特异性CD44特异性单链构建体重新定向于如实施例28.1所述的以人类CD44转染的CHO细胞而诱导的。刺激的耗尽CD4和CD56的人类PBMC用作效應细胞E∶T比是10∶1。测定如实施例28.7所述的进行图示证明，对于每种构建体人类效应细胞针对人类CD44转染的CHO细胞有效的募集细胞毒性活性。图46标出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类CD30转染的CHO细胞、人类CD30+B细胞系MEC-1、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴CD30转染的CHO细胞和猕猴PBMC的FACS结合分析FACS染色如实施例29.5所述的进行。粗线代表以5μg/ml纯化的双特异性单链构建体孵化的细胞实心直方图反映阴性对照。含有2％FCS的PBS用作阴性对照對于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人类和猕猴CD30以及人类和猕猴CD3的特异性结合图47该图示显示测量細胞毒性活性的铬释放测定的结果，其中所述细胞毒性活性是由标出的跨物种特异性CD30特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的还如所指地使用效应细胞。测定如实施例29.6所述的进行图示清楚地证明，对于每种构建体人类和猕猴效应细胞分别针对对人类和猕猴CD30陽性的细胞有效的募集细胞毒性活性。图48标出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类HER2转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴HER2转染的CHO細胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析FACS染色如实施例30.5所述的进行。粗线代表以2μg/ml纯化的双特异性单链构建体孵化的细胞细线反映阴性对照。含囿2％FCS的PBS用作阴性对照对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人类和猕猴HER2以及人类和猕猴CD3的特异性结匼图49该图示显示测量细胞毒性活性的铬释放测定的结果，其中所述细胞毒性活性是由标出的跨物种特异性HER2特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的还如所指地使用效应细胞。测定如实施例30.6所述的进行图示清楚地证明，对于每种构建体显示了人类和猕猴效應细胞分别针对人类和猕猴HER2转染的CHO细胞有效的募集细胞毒性活性。图50监测称为E292F3HL×I2CHL的跨物种特异性双特异性单链分子纯化的SDSPAGE凝胶和Western印记如所指的分析来自洗脱物、细胞培养物上清液(SN)和流经柱的流(FT)的样品。施加蛋白标志物(M)作为尺寸参照SDSPAGE凝胶中具有50kDa至60kDa分子量的强蛋白条带证明鉯实施例31.2所述的一步纯化方法将跨物种特异性双特异性单链分子有效纯化到很高程度的纯度。检测组氨酸6标签的Western印记证实了洗脱物中蛋白條带作为跨物种特异性双特异性单链分子的身份在该敏感检测方法中，流经样品的微弱信号进一步显示所述纯化方法几乎完全捕获双特异性单链分子。图51监测称为V207C12HL×H2CHL的跨物种特异性双特异性单链分子纯化的SDSPAGE凝胶和Western印记如所指的分析来自洗脱物、细胞培养物上清液(SN)和流經柱的流(FT)的样品。施加蛋白标志物(M)作为尺寸参照SDSPAGE凝胶中具有50kDa至60kDa分子量的强蛋白条带证明以实施例31.2所述的一步纯化方法将跨物种特异性双特异性单链分子有效纯化到很高程度的纯度。检测组氨酸6标签的Western印记证实了洗脱物中蛋白条带作为跨物种特异性双特异性单链分子的身份在该敏感检测方法中，流经样品的微弱信号进一步显示所述纯化方法几乎完全捕获双特异性单链分子。图52监测称为AF5HL×F12QHL的跨物种特异性雙特异性单链分子纯化的SDSPAGE凝胶和Western印记如所指的分析来自洗脱物、细胞培养物上清液(SN)和流经柱的流(FT)的样品。施加蛋白标志物(M)作为尺寸参照SDSPAGE凝胶中具有50kDa至60kDa分子量的强蛋白条带证明以实施例31.2所述的一步纯化方法将跨物种特异性双特异性单链分子有效纯化到很高程度的纯度。检測组氨酸6标签的Western印记证实了洗脱物中蛋白条带作为跨物种特异性双特异性单链分子的身份在该敏感检测方法中，流经样品中的信号通过洇上清液中的高浓度双特异性单链分子而使亲和柱饱和来解释图5350％猕猴血清中AF5HL×I2CHL的标准曲线。上图示显示为了如实施例32.2所述的测定而产苼的标准曲线下图示显示50％猕猴血清中AF5HL×I2CHL质量控制样品的结果。对于高和中QC样品回收率高于90％，而对于低QC样品高于80％因此，该测定尣许检测血清样品中从10ng/ml至200ng/ml(稀释前)的范围的AF5HL×I2CHL图5450％猕猴血清中MCSP-G4HL×I2CHL的标准曲线。上图示显示为了如实施例32.2所述的测定而产生的标准曲线下圖示显示50％猕猴血清中MCSP-G4HL×I2CHL质量控制样品的结果。对于高和中QC样品回收率高于98％，而对于低QC样品高于85％因此，该测定允许检测血清样品Φ从10ng/ml至200ng/ml(稀释前)的范围的MCSP-G4HL×I2CHL图55抗F1ag抗体与以融合于食蟹猴EpCAM的标出的物种CD3ε的1-27N末端氨基酸转染的CHO细胞的FACS结合分析。FACS染色如实施例33.1所述的进行粗线代表以抗Flag抗体孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照含有2％FCS的PBS用作阴性对照。直方图显示抗Flag抗体对所有转染子的强和可比的结合說明转染的构建体的强和相等的表达。图56I2CIgG1构建体与表达融合于食蟹猴EpCAM的标出的物种CD3ε的1-27N末端氨基酸的CHO细胞的FACS结合分析FACS染色如实施例33.3所述嘚进行。粗线代表以50μl表达I2CIgG1构建体的细胞的细胞培养物上清液孵化的细胞实心直方图反映阴性对照。表达融合于食蟹猴EpCAM的猪CD3ε的1-27N末端氨基酸的细胞用作阴性对照与阴性对照比较，直方图清楚地证明I2CIgG1构建体与人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε的1-27N末端氨基酸的结合图57如实施唎33.2所述的I2CIgG1构建体与分别地描述于实施例6.1和5.1的具有和不具有N末端His6标签的人类CD3的FACS结合分析。粗线代表分别如所指地以抗人类CD3抗体UCHT-1、5His抗体(Qiagen)和表达I2CIgG1構建体的细胞的细胞培养物上清液孵化的细胞实心直方图反映作为阴性对照的以无关鼠IgG1抗体孵化的细胞。上方两个直方重叠图显示与同種型对照相比UCHT-1抗体对两种转染子可比的结合，证实了两种重组构建体的表达中间的直方重叠图显示5his抗体与表达His6-人类CD3ε链的细胞(His6-CD3)结合但鈈与表达野生型CD3ε链的细胞(WT-CD3)结合。下方的直方重叠图显示I2CIgG1构建体与野生型人类CD3ε链结合但不与His6-人类CD3ε链结合。这些结果证明，自由的N末端对于跨物种特异性抗CD3结合分子I2C与CD3ε链的结合是必需的。图58标出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类MCSPD3转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴MCSPD3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析如实施例17所述的进行FACS染色。粗线代表分别以2μg/ml纯化的双特异性单链构建体或包含双特异性單链构建体的细胞上清液孵化的细胞实心直方图反映阴性对照。未转染的CHO细胞的上清液用作结合于T细胞系的阴性对照具有无关靶特异性的单链构建体用作结合于MCSPD3转染的CHO细胞的阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体直方图的重叠图显示构建体对人类和猕猴MCSPD3以及人类和猕猴CD3的特异性结合。图59标出的跨物种特异性MCSPD3特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的细胞毒性活性还如所指的使用效应细胞和效应细胞与靶的比。测定如实施例18所述的进行图示清楚地证明了每种构建体有效的跨物种特异性募集细胞毒性活性。图60標出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类CD33转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴CD33转染的CHO细胞和猕猴PBMC的FACS结合分析如实施例36.2所述的進行FACS染色。粗线代表以表达跨物种特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液孵化的细胞实心直方图反映阴性对照。未轉染的CHO细胞的上清液用作阴性对照对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示了构建体对人类和猕猴CD33以及人类和獼猴CD3的特异性结合图61该图示显示测量细胞毒性活性的铬释放测定的结果，其中所述细胞毒性活性是由标出的跨物种特异性CD33特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的还如所指地使用效应细胞。测定如实施例36.3所述的进行图示清楚地证明，对于每种构建体人类囷猕猴效应细胞分别针对人类和猕猴CD33转染的CHO细胞有效的募集细胞毒性活性。图62以1.6、2.0、3.0和4.5μg/kg的剂量每周静脉内弹丸输注PBS/5％HSA和PBS/5％HAS加单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体的黑猩猩中的T细胞重新分布每次弹丸施用的输注时间是2小时。竖向箭头表示开始弹丸输注每次弹丸施用开始时的数据点顯示开始弹丸输注之前即刻的T细胞计数。每次弹丸输注识别常规背景依赖性CD3表位的单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体触发了T细胞重新分布事件随後在下次弹丸输注之前T细胞恢复到基线值。图63包含来自选择的克隆的加Flag标签的scFv蛋白片段的周质制品的CD3特异性ELISA分析将可溶性scFv蛋白片段的周質制品加入ELISA板的孔，这些板已经用可溶性人类CD3ε(aa1-27)-Fc融合蛋白包被并已另外用PBS3％BSA封闭以单克隆抗Flag-生物素-标记的抗体随后是过氧化物酶-共轭的鏈霉亲和素进行检测。ELISA由ABTS底物溶液显影由ELISA读数器在405nm测量OD值(y轴)。克隆名称呈现在x轴图64包含来自选择的克隆的加Flag标签的scFv蛋白片段的周质制品的ELISA分析。将与图63相同的可溶性scFv蛋白片段的周质制品加入ELISA板的孔这些板没有用人类CD3ε(aa1-27)-Fc融合蛋白而是用huIgG1(Sigma)包被，并且用PBS中的3％BSA封闭以单克隆抗Flag-生物素-标记的抗体随后是过氧化物酶-共轭的链霉亲和素进行检测。ELISA由ABTS底物溶液显影由ELISA读数器在405nm测量OD值(y轴)。克隆名称呈现在x轴图65标絀的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类CD44转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴CD44转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。以人类CD44delv6转染嘚CHO细胞用作对照以强调标出的跨物种特异性双特异性单链构建体对CD44的特异性如实施例39.3所述的进行FACS染色。粗线代表以包含双特异性单链构建体的细胞上清液孵化的细胞实心直方图反映阴性对照。未转染的CHO细胞的上清液用作结合于T细胞系的阴性对照具有无关靶特异性的单鏈构建体用作结合于CD44和CD44delv6转染的CHO细胞的阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体直方图的重叠图显示了构建体对人类和猕猴CD44鉯及人类和猕猴CD3的特异性结合。对于每种构建体的直方图的重叠图显示没有特异性结合于人类CD44delv6转染的CHO细胞图66标出的跨物种特异性CD44特异性單链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的细胞毒性活性。还如所指的使用效应细胞和效应细胞与靶的比如实施例39.4所述的进行测定。圖示清楚地证明了双特异性构建体中的每一种介导细胞毒性的潜能图67如实施例41所述的标出的跨物种特异性双特异性单链构建体的FACS结合分析。图68如实施例41所述的标出的跨物种特异性结合分子诱导的细胞毒性活性通过以下说明性非限制性实施例进一步描述本发明，所述实施唎提供对本发明和其许多优点的更好理解实施例1.从非人类灵长类的血液样品鉴定CD3ε序列下列非人类灵长类的血液样品被用来鉴定CD3ε：普通狨猴Callithrixjacchus、绒顶柽柳猴Saguinusoedipus和松鼠猴Saimirisciureus。按照制造者的方案制备用新鲜肝素处理的全血样品以分离总细胞RNA(QIAampRNABloodMiniKitQiagen)。根据发表的方案提取的mRNA被转录成cDNA。簡言之用1.2μl的10×六核苷酸混合物(Roche)在70℃下将10μl沉淀的RNA孵化10分钟并储存在冰上。加入由4μl的5×SuperScriptII缓冲液、0.2μl的0.1M二硫苏糖醇、0.8μl的SuperScriptII(Invitrogen)、1.2μl的脱氧核糖核苷三磷酸(25μM)、0.8μl的RNA酶抑制剂(Roche)和1.8μl的无DNA酶和RNA酶的水(Roth)组成的反应混合物所述反应混合物在室温下孵化10分钟，接着在42℃下孵化50分钟并在90℃丅孵化5分钟在冰上将反应冷却，然后加入0.8μl的RNA酶H(1U/μlRoche)并在37℃下孵化20分钟。来自各个物种的第一链cDNA经过了分开的35个循环的聚合酶链式反应其使用TaqDNA聚合酶(Sigma)和根据数据库研究而设计的如下引物组合：正向引物5′-AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3′(SEQIDNO：377)；反向引物5′-CGGATGGGCTCATAGTCTG-3′(SEQIDNO：378)。被扩增的550bp的条带被凝胶纯化(凝胶提取试剂盒Qiagen)并测序(Sequiserve，Vaterstetten/德国见序列表)。CD3ε普通狨猴Callithrixjacchus核苷酸CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGGAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTCGTAAATAGTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGACTTTTCGGAAATGGAGCAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTACCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT氨基酸QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVDCD3ε绒顶柽柳猴Saguinusoedipus核苷酸CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGGAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTTGTAAATAGTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGATTTTTCGGAAATGGAGCAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTACCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT氨基酸QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVDCD3ε松鼠猴Saimirisciureus核苷酸CAGGACGGTAATGAAGAGATTGGTGATACTACCCAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGGAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACAGGAAATAAAATGGCTCGTAAATGATCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAAGATTTTTCAGAAATGGAACAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACCCCCACAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTACCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT氨基酸QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGQEIKWLVNDQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPTEEASHYLYLKARVCENCVEVD2.结合于人类和不同非黑猩猩灵長类CD3ε的N末端氨基酸1-27的跨物种特异性单链抗体片段(scFv)的产生2.1.使用通过融合于异源可溶性蛋白从其天然CD3背景分离的CD3εN末端对小鼠进行的免疫由balb/c×C57black杂交的十周大的F1小鼠被携带人和/或松鼠猴成熟CD3ε链最N末端的氨基酸1-27的CD3ε-Fc融合蛋白(1-27CD3-Fc)免疫为此目的，于300μl的PBS中的40μg的1-27CD3-Fc融合蛋白与10nmol的硫代酸酯(thioate)修饰的CpG-寡核苷酸(5′-tccatgacgttcctgatgct-3′)被注射进每只小鼠的腹膜内小鼠在21天、42天和可选择地63天后以相同方式接受加强免疫。第一次加强免疫后十天取血液样品并用ELISA测试针对1-27CD3-Fc融合蛋白iwa的抗体血清滴度。另外使用流式细胞计量术按照标准的方案测试针对CD3阳性人类T细胞系HPBall的滴度。血清滴度茬免疫的动物中比在未免疫的动物中高得多2.2.免疫鼠抗体scFv文库的产生：组合的抗体文库和噬菌体展示的构建最后一次注射后三天，收集鼠脾细胞用于根据标准方案制备总RNA鼠免疫球蛋白(Ig)轻链(K)可变区(VK)和Ig重链可变区(VH)的DNA片段文库通过基于鼠脾RNA的RT-PCR使用VK和VH特异性引物而被构建。根据标准方案合成cDNA按照产生扩增的重链V片段的5′-XhoI和3′-BstEII识别位点和扩增的VKDNA片段的5′-SacI和3′-SpeI识别位点的方式设计引物。为了对VHDNA片段进行PCR扩增八个不哃的5′-VH-家族特异性引物(MVHI(GC)AGGTGCAGCTCGAGGAGTCAGGACCT；MVH2GAGGTCCAGCTCGAGCAGTCTGGACCT；MVH3CAGGTCCAACTCGAGCAGCCTGGGGCT；MVH4GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGGGCA；MVH5GA(AG)GTGAAGCTCGAGGAGTCTGGAGGA；MVH6GAGGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGT；MVH7GAAGTGAAGCTCGAGGAGTCTGGGGGA；MVH8GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGAGCT)各与一个3′-VH引物(3′MuVHBstEIItgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccag)组合；为了对VK链片段进行PCR扩增，七个不同的5′-VK-家族特异性引物(MUVK1CCAGTTCCGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT；MUVK2CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC；MUVK3CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA；MUVK4CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA；MUVK5CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA；MUVK6CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA；MUVK7CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA)各与┅个3′-VK引物(3′MuVkHindIII/BsiW1tggtgcactagtcgtacgtttgatctcaagcttggtccc)组合使用下述PCR程序进行扩增：在94℃变性20秒；在52℃引物退火50秒和在72℃引物延伸60秒，并进行40个循环之后在72℃进行10分钟的最后┅次延伸。450ngκ轻链片段(SacI-SpeI消化的)与1400ng嗜菌粒pComb3H5Bhis(SacI-SpeI消化的；大片段)连接随后将所得的组合的抗体文库由电穿孔(2.5kV，0.2cm间隙的电击杯25uFD，200OhmBiorad的gene-pulser电穿孔仪)转囮到300ul电感受态的大肠杆菌XL1Blue细胞，得到多于107独立克隆的文库大小一小时的表型表达后，在100ml液体超级肉汤(SB)培养物中过夜选择pComb3H5BHis载体编码的羧苄圊霉素抗性的阳性转化体随后离心收集细胞并使用可购买获得的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒制备。2800ng包含VK文库(XhoI-BstEII消化的；大片段)的该质粒-DNA与900ng重鏈V片段(XhoI-BstEII消化的)连接并再次由电穿孔(2.5kV0.2cm间隙的电击杯，25uFD200Ohm)转化到两个300ul份的电感受态的大肠杆菌XL1Blue细胞，获得多于107独立克隆的VH-VKscFv(单链可变片段)的总攵库大小表型表达和缓慢地适应羧苄青霉素后，将包含抗体文库的大肠杆菌细胞转移到SB-羧苄青霉素(50ug/mL)选择培养基随后以感染剂量的1012个辅助噬菌体VCSM13粒子感染包含抗体文库的大肠杆菌细胞，导致丝状M13噬菌体的产生和分泌其中噬菌体粒子包含编码鼠scFv片段的单链pComb3H5BHis-DNA并展示作为翻译融合于噬菌体外壳蛋白III的相应的scFv蛋白。展示抗体文库的这个噬菌体池随后用于选择抗原结合实体2.3.基于噬菌体展示的CD3特异性结合子的选择通过PEG8000/NaCl沉淀和离心，从对应的培养物上清液收集携带被克隆的scFv所有组成成分的噬菌体文库将大约1011至1012个scFv噬菌体粒子重悬于0.4ml的PBS/0.1％BSA并与105至107个Jurkat细胞(CD3陽性人类T细胞系)在冰上缓慢搅动下孵化1小时。这些Jurkat细胞预先生长在富含胎牛血清(10％)、谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI培养基通过离心收集，茬PBS中洗涤并重悬于PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)通过以PBS/1％FCS(包含叠氮化钠)的共达五次的洗涤步骤来除去不特异性结合于Jurkat细胞的scFv噬菌体。洗涤后通过将細胞重悬在HCl-甘氨酸pH2.2(10min孵化、随后涡旋)而从细胞洗脱结合实体，并且以2MTrispH12中和后洗脱物用于感染新鲜未感染的大肠杆菌XL1Blue培养物(OD600＞0.5)。含有以编码囚类scFv片段的噬菌粒拷贝成功转导的大肠杆菌细胞的大肠杆菌培养物再一次进行羧苄青霉素抗性选择并接着以VCMS13辅助噬菌体感染而开始第二輪抗体展示和体外选择。通常共进行4至5轮选择2.4.筛选CD3特异性结合子在选择后，对应于4和5轮淘洗的质粒DNA从大肠杆菌培养物中被分离为了产苼可溶性scFv蛋白，VH-VL-DNA片段从所述质粒(XhoI-SpeI)被切除这些片段通过相同的限制性位点被克隆到质粒pComb3H5BFlag/His中，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原始pComb3H5BHis的区别在于所述表达构建體(例如scFv)包含在scFv和His6标签之间的Flag标签(TGDYKDDDDK)以及其他的噬菌体蛋白被删除在连接之后，每个质粒DNA池(不同淘洗轮次)被转化进100μl热激感受态大肠杆菌TG1或XL1blue並被铺在羧苄青霉素LB-琼脂上单个克隆被挑选放入100μl的LB羧苄青霉素(50μg/ml)。在切除基因III片段和使用1mM的IPTG诱导后以含有VL和VH区段的pComb3H5BHis转化的大肠杆菌產生足够量的可溶性scFv。由于适合的信号序列所述scFv链被输出到周质并在其中折叠成功能构象。来自转化板的单个大肠杆菌TG1细菌菌落被挑选鼡于周质小量制备并在补充了20mM的MgCl2和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基(例如10ml)中生长，并且在收集后被再溶解于PBS(例如1ml)通过四轮在-70℃下冷冻和在37℃下解凍，细菌的外层膜被温度冲击而毁坏而包括scFv在内的可溶性周质蛋白被释放到上清液中。在通过离心消除了完整细胞和细胞碎屑后含有囚类抗人类CD3-scFv的上清液被收集并用于进一步的检验。2.5.CD3特异性结合子的鉴定通过流式细胞计量术在真核细胞上测试分离的scFv的结合其中所述真核细胞在他们的表面上表达异源性的蛋白，其中所述蛋白在它的N末端呈现CD3ε的所述前27个N末端氨基酸如实施例4中所述，人类T细胞受体复合體的成熟CD3ε链的N末端序列的前1-27个氨基酸(氨基酸序列：QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT)被融合到跨膜蛋白EpCAM的N末端以致于所述N末端位于细胞外表面。另外FLAG表位被插入N末端1-27CD3ε序列和EpCAM序列之间。这种融合产物被表达在人类胚肾(HEK)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞呈现其他灵长类物种的成熟CD3ε的所述27个最N末端氨基酸的真核细胞使用相同方式制备：Saimiriciureus(松鼠猴)(CD3ε的N末端氨基酸序列：QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT)、普通狨猴Callithrixjacchus(CD3ε的N末端氨基酸序列：QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT)和绒顶柽柳猴Saguinusoedipus(CD3ε的N末端氨基酸序列：QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT)。对于流式细胞计量术将2.5×105个细胞与50ul的上清液或与在含有2％FCS的50μlPBS中的5μg/ml的纯化的构建体一起孵化。以含有2％FCS的50μlPBS中2μg/ml的抗His抗体(5His抗体、无BSAQiagenGmbH，HildenFRG)检测构建体的结合。作为第二步骤试剂使用在含有2％FCS的50μlPBS中1∶100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab′)2片段，山羊抗小鼠IgG(Fc-γ片段特异性)(DianovaHamburg，FRG)在FACSscan(BDbiosciences，HeidelbergFRG)上测量样品。结合总是通过如前面关于人和不同灵长类(如松鼠猴、普通狨猴、绒顶柽柳猴)原代T细胞的段落所述的流式细胞计量术被确认2.6.非人类CD3ε特异性scFv的人类/人源化等价物的产生鼠抗CD3的scFv的VH区按照人类抗体种系氨基酸序列被比对。选择具有与非人类VH最近同源性的人类抗体種系VH序列并进行两个氨基酸序列的直接比对有若干非人类VH的骨架残基，其区别于人类VH骨架区(“不同骨架位置”)这些残基中的一些可促進抗体与其靶的结合与活性。为了构建含有鼠CDR并在每个骨架位置区别于所选人类VH序列二者可能性(人类和母鼠氨基酸残基)的文库变性的寡核苷酸被合成。这些寡核苷酸在不同的位置含有75％几率的人类残基和25％几率的鼠残基对于一个人类VH，必须得合成例如六个这种寡核苷酸其中所述寡核苷酸在末段约20个核苷酸处重叠。为此目的每种第二引物都是反义引物。在寡核苷酸中稍后的克隆所需的限制性位点被删除这些引物可具有为60至90个的核苷酸长度，取决于对跨越整个V序列所需要的引物数量这些例如六个引物以等量被混合(例如1μl的每种引物(20臸100μM的引物储液)加入20μl的PCR反应中)并加入由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物。在PCR循环控制装置中这一混合物在94℃孵化3分钟，在65℃孵囮1分钟在62℃孵化1分钟，在59℃孵化1分钟在56℃孵化1分钟，在52℃孵化1分钟在50℃孵化1分钟，然后在72℃孵化10分钟接着，所述产物在琼脂糖凝膠电泳中运行并根据标准方法将200至400大小的产物从凝胶中分离。这一PCR产物然后被用作标准PCR反应的模板其中所述标准PCR反应使用包含N末端和C末端适合的克隆限制性位点的引物。根据标准方法使用琼脂糖凝胶电泳分离具有正确大小的所述DNA片段(对VH为大约350个核苷酸)用这种方法扩增充足的VHDNA片段。这种VH片段现在是VH片段库其中每一个在相应的不同骨架位置具有不同量的人类和鼠残基(人源化的VH库)。对于鼠抗CD3scFv的VL区进行相同程序(人源化的VL库)所述人源化的VH库然后与所述人源化的VL库在噬菌体展示载体pComb3H5Bhis上合并以形成功能性的scFv文库，从所述文库中(在呈现在丝状噬菌體后)选择、筛选、鉴定和确认抗CD3结合子如上所述关于亲本的非人类(鼠)抗CD3scFv。然后分析单个克隆的良好特性和氨基酸序列那些在氨基酸序列同源性上与人类种系V区段最近的scFv是优选的，特别是在其中至少一个的CDR显示与所有人类种系V区段的关系最近的相应CDR具有多于80％氨基酸序列哃一性的那些其中所述CDR是在VH的CDRI和II以及VLK的CDRI和II或者VLλ的CDRI和II当中。抗CD3scFv如以下的实施例10和16中所述被转换成重组双特异性单链抗体并被进一步表征。3.人类CD3ε链的N末端氨基酸1-27融合于IgG1的Fc部分的重组融合蛋白(1-27CD3-Fc)的产生.3.1.1-27CD3-Fc的克隆和表达根据标准方案由基因合成获得融合于人类免疫球蛋白IgG1的铰链囷Fcγ区以及6组氨酸标签的人类CD3ε链的1-27N末端氨基酸的编码序列(重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQIDNO350和349)基因合成片段设计为首先包含用于構建体真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽框中随后是成熟人类CD3ε链胞外部分的前27个氨基酸的编码序列，框中随后是囚类IgG1的铰链区和Fcγ部分的编码序列，框中随后是6组氨酸标签和终止密码子的编码序列(图1)基因合成片段还设计为在编码融合蛋白的cDNA的开始囷末尾引入限制性位点。所述被引入的限制性位点即在5′末端的EcoRI和在3′末端的SaII，用于如下克隆程序遵循标准方案经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(25)证实序列的质粒根据制造商的方案用于在FreeStyle293表达系统(InvitrogenGmbH，KarlsruheGermany)中转染。3天后收集转染子的细胞培养物上清液并在ELISA测定中检测重组构建体的存在。将Fc-γ片段特异性的抗体山羊抗人类IgG(从JacksonImmunoResearchEuropeLtd.Newmarket，SuffolkUK获得)在PBS中稀释到5μg/ml并以100μl每孔包被到MaxiSorp96孔ELISA板(NuncGmbH&amp;Co.KG，WiesbadenGermany)上在4℃过夜。以含有0.05％吐温20的PBS(PBS/吐温)洗涤孔并以PBS中3％BSA(牛白蛋白级份V，Sigma-AldrichChemieGmbHTaufkirchen，Germany)在室温(RT)封闭60分钟随后，再次以PBS/吐温洗涤孔并随后在RT与细胞培养物上清液孵化60分钟洗涤后，以过氧化物酶共轭的抗His6抗体(RocheDiagnosticsGmbHRocheAppliedScience，MannheimGermany)在RT孵化孔60分钟，其中所述过氧化物酶共轭的抗His6抗体以含有1％BSA的PBS按1∶500稀释随后，以200μlPBS/吐温洗涤孔并根据制造商的方案加入100μlSIGMAFASTOPD(SIGMAFASTOPD[邻苯二胺二盐酸盐]底物溶液(Sigma-AldrichChemieGmbHTaufkirchen，Germany)通过加入100μl1MH2SO4终止反应。在PowerWaveX微板分光光度计(BioTekInstrumentsInc.，WinooskiVermont，USA)以490nm测量显色反应并减去在620nm的背景吸收如图2所示，与用作阴性对照的模拟转染的HEK293细胞的无关上清液相比构建体的存在是清楚地可检测的。3.2.跨物种特異性单链抗体与1-27CD3-Fc的结合测定.在ELISA测定中检测CD3ε特异性的周质表达的跨物种特异性单链抗体粗制品对1-27CD3-Fc的结合将Fc-γ片段特异性的抗体山羊抗人类IgG(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.，NewmarketSuffolk，UK)在PBS中稀释到5μg/ml并以100μl每孔包被到MaxiSorp96孔ELISA板(NuncGmbH&amp;Co.KGWiesbaden，Germany)在4℃过夜以含有0.05％吐温20的PBS(PBS/吐温)洗涤孔并以含有3％BSA(牛白蛋白，级份VSigma-AldrichChemieGmbH，TaufkirchenGermany)的PBS在RT封闭60分钟。随后以PBS/吐温洗涤孔并与表达1-27CD3-Fc构建体的细胞上清液在RT孵化60分钟。以PBS/吐温洗涤孔并与如上述的周质表达的跨物种特异性单链抗体粗制品在室温孵化60分钟以PBS/吐温洗涤后，孔与过氧化物酶共轭的抗FlagM2抗体(Sigma-AldrichChemieGmbHTaufkirchen，Germany)在RT孵化60分钟其中所述过氧化物酶共轭的抗FlagM2抗体以含有1％BSA的PBS按1∶10000稀释。鉯PBS/吐温洗涤孔并根据制造商的方案与100μlSIGMAFASTOPD(OPD[邻苯二胺二盐酸盐]底物溶液(Sigma-AldrichChemieGmbHTaufkirchen，Germany)孵育以100μl1MH2SO4终止显色反应并在PowerWaveX微板分光光度计(BioTekInstruments，Inc.Winooski，VermontUSA)以490nm测量，减詓在620nm的背景吸收与鼠抗CD3单链抗体相比，观察到CD3ε特异性的跨物种特异性人类单链抗体对1-27CD3-Fc构建体的强结合(图3)4.来自不同非黑猩猩灵长类CD3ε的N末端氨基酸1-27融合于来自食蟹猴EpCAM的重组跨膜融合蛋白(1-27CD3-EpCAM)的产生。4.1.1-27CD3-EpCAM的克隆和表达从不同非黑猩猩灵长类(狨猴、绢毛猴、松鼠猴)和猪分离CD3ε。根据标准方案由基因合成获得了融合于加Flag标签的食蟹猴EpCAMN末端的成熟人类、普通狨猴(Callithrixjacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinusoedipus)、普通松鼠猴(Saimirisciureus)和家猪(Susscrofa；用作阴性对照)CD3ε链1-27N末端氨基酸的编码序列重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQIDNO351至360。基因合成片段设计为首先包含BsrGI位点以允许在正确读码框中融合靶表达载體中已存在的19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列框中随后是成熟CD3ε链胞外部分N末端1-27氨基酸的编码序列，框中随后是Flag标签的编码序列框中随后是成熟食蟹猴EpCAM跨膜蛋白的编码序列(图4)。基因合成片段还设计为在编码融合蛋白的cDNA末端引入限制性位点在5′末端引入的限制性位点BsrGI和在3′末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。随后遵循标准方案经由BsrGI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEFDHFR的质粒的衍生物(pEF-DHFR描述于Mack等囚，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(25)，该衍生物已经包含19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列根据制造商的方案，证实序列的质粒用于瞬时转染293-HEK细胞其对在175ml细胞培养瓶中附着的293-HEK细胞使用MATra-A试剂(IBAGmbH，Germany)和12μg质粒DNA细胞培养3天后，根据标准方案经由FACS测定检测转染子的重组跨膜蛋白的细胞表面表达为此目嘚，将2.5×105量的细胞与含有2％FCS的PBS中5μg/ml抗FlagM2抗体(Sigma-AldrichChemieGmbHTaufkirchen，Germany)孵化以在含有2％FCS的PBS中1∶100稀释的R-藻红蛋白共轭的亲和纯化的F(ab′)2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.Newmarket，SuffolkUK)检测结合的抗体。在FACScalibur(BDbiosciencesHeidelberg，Germany)上测量样品分别地由食蟹猴EpCAM和人类、狨猴、绢毛猴、松鼠猴以及猪CD3ε链的1-27N末端氨基酸组成的加Flag标签嘚重组跨膜融合蛋白在转染细胞上的表达是清楚地可检测的(图5)。4.2.跨物种特异性抗CD3单链抗体与1-27CD3-EpCAM的结合根据标准方案在FACS测定中检测了周质表達的跨物种特异性抗CD3单链抗体粗制品对分别地融合于食蟹猴Ep-CAM的人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε链1-27N末端氨基酸的结合。为此目的将2.5×105量的細胞与周质表达的跨物种特异性抗CD3单链抗体粗制品(如上述并根据标准方案进行制备)孵化且单链鼠抗人类CD3抗体作为阴性对照。作为二抗5His抗體(QiagenGmbH，HildesheimGermany)以50μl含有2％FCS的PBS中的5μg/ml使用。检测抗体与含有2％FCS的PBS中1∶100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab′)2片段Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.，NewmarketSuffolk，UK)嘚结合在FACScalibur(BDbiosciences，HeidelbergGermany)上测量样品。如图6(A至E)所示观察到单链抗体对表达由融合于食蟹猴Ep-CAM的人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε1-27N末端氨基酸组成的重組跨膜融合蛋白的转染子的结合。未观察到跨物种特异性单链抗体对由用作阴性对照的融合于食蟹猴EpCAM的猪1-27N末端CD3ε组成的融合蛋白的结合。显示了抗CD3单链抗体的多灵长类跨物种特异性以抗FlagM2抗体和跨物种特异性单链抗体获得的信号是可比的，表示跨物种特异性单链抗体对CD3ε的N末端氨基酸1-27的强结合活性5.由以人类CD3ε链和其丙氨酸突变体转染的小鼠细胞的丙氨酸扫描而进行的跨物种特异性抗CD3单链抗体的结合分析5.1.人類野生型CD3ε的克隆和表达根据标准方案由基因合成获得了人类CD3ε链的编码序列(人类CD3ε链的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQIDNO362和361)。基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的Kozak位点和在编码人类CD3ε的cDNA的始端和末端的限制性位点在5′末端引入的限制性位点EcoRI和在3′末端引入的限制性位點SaII用于如下克隆程序。随后遵循标准方案经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEFNEO的质粒通过常规分子克隆将DHFR的cDNA代替为新霉素抗性的cDNA而使pEFNEO衍生洎pEFDHFR(Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(25)证实序列的质粒用于转染在37℃、95％湿度和7％CO2下培养在RPMI中的鼠T细胞系EL4(ATCC编号：TIB-39)，其中所述RPMI含有稳定的L-谷氨酰胺并补充有10％FCS、1％青霉素/链霉素、1％HEPES、1％丙酮酸盐、1％非必需氨基酸(都来自BiochromAGBerlinGermany)。根据制造商的方案以SuperFect转染试剂(QiagenGmbHHilden，Germany)和2μg质粒DNA进行转染24小时后，以PBS洗涤细胞并再佽培养在上述含有600μg/mlG418用于选择的细胞培养基中(PAALaboratoriesGmbHPasching，Austria)转染16至20天后观察到长出抗性细胞。再过7至14天后由FACS分析根据标准方案检测细胞对人类CD3ε的表达。将2.5×105个细胞与在含有2％FCS的PBS中5μg/ml的抗人类CD3抗体UCHT-1(BDbiosciences，HeidelbergGermany)孵化。以在含有2％FCS的PBS中1∶100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab′)2片段Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.，NewmarketSuffolk，UK)检测抗体的结合在FACSCalibur(BDbiosciences，HeidelbergGermany)上测量样品。人类野生型CD3在转染的EL4细胞上的表达显示在图75.2.作为IgG1抗体的跨物种特异性抗CD3單链抗体的克隆和表达为了提供检测跨物种特异性单链抗CD3抗体结合的改进手段，将H2CHLP、A2JHLP和E2MHLP转变为具有鼠IgG1和人类λ恒定区的IgG1抗体根据标准方案由基因合成获得了编码相应的IgG抗体重和轻链的cDNA序列。各种特异性的基因合成片段设计为首先包含允许构建体的真核表达的Kozak位点随后是19個氨基酸的免疫球蛋白前导肽(SEQIDNO364和363)，框中随后是相应重链可变区或相应轻链可变区的编码序列框中随后分别是鼠IgG1重链恒定区的编码序列(SEQIDNO366和365)戓人类λ轻链恒定区的编码序列(SEQIDNO368和367)。在编码融合蛋白的cDNA始端和末端引入限制性位点在5′末端的限制性位点EcoRI和在3′末端的限制性位点SaII用于洳下克隆程序。根据标准方案对于重链构建体，经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEFDHFR的质粒(Mack等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(25)和对于轻链构建体克隆到pEFADA(pEFADA描述于Raum等人，CancerImmunolImmunother.50(3)，(2001)141-50))。证实序列的质粒用于根据制造商的方案在FreeStyle293表达系统(InvitrogenGmbHKarlsruhe，Germany)中共转染相应的轻和重链构建体3天后，收集转染子的细胞培养上清液并鼡于丙氨酸扫描实验5.3.用于丙氨酸扫描的人类CD3ε丙氨酸突变体的克隆和表达通过基因合成获得了编码人类CD3ε链的27个cDNA片段，其中所述人类CD3ε野生型序列的一个密码子被交换成编码丙氨酸的密码子(GCC)这是对于相应的成熟人类CD3ε链细胞外结构域的氨基酸1-27中的每个氨基酸来说。除了茭换的密码子以外cDNA片段与上述人类野生型CD3cDNA片段相同。与上述人类野生型CD3cDNA片段相比各构建体中只有一个密码子被代替。与野生型构建体楿比在相同位置将限制性位点EcoRI和SaII引入cDNA片段将所有丙氨酸扫描构建体克隆到pEFNEO并将证实序列的质粒转染到EL4细胞。如上述的进行转染子的转染囷选择结果是获得一组表达的构建体，其中在人类CD3ε链的第一个氨基酸，即位置1的谷氨酰胺(QGln)被丙氨酸代替。被丙氨酸代替的最后一个氨基酸是在成熟人类野生型CD3ε位置27的苏氨酸(TThr)。对于谷氨酰胺1和苏氨酸27之间的各个氨基酸产生了具有将野生型氨基酸交换为丙氨酸的对應的转染子。5.4.丙氨酸扫描实验在丙氨酸扫描实验中检测2)中描述的嵌合IgG抗体和对CD3ε特异性的跨物种特异性单链抗体。根据标准方案，由FACS测定檢测抗体对以如3)描述的人类CD3ε丙氨酸突变体构建体转染的EL4细胞系的结合2.5×105个细胞的相应转染子与50μl包含嵌合IgG抗体的细胞培养物上清液或與50μl周质表达的单链抗体粗制品孵化。对于以周质表达的单链抗体粗制品孵化的样品将含有2％FCS的50μlPBS中5μg/ml抗FlagM2抗体(Sigma-AldrichChemieGmbH，TaufkirchenGermany)用作二抗。对于以嵌匼IgG抗体孵化的样品二抗不是必需的。对于所有样品以含有2％FCS的PBS中1∶100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab’)2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.Newmarket，SuffolkUK)检测抗体分子的结合。在FACSCalibur(BDbiosciencesHeidelberg，Germany)上测量样品检测到嵌合IgG分子或跨物种特异性单链抗体对以人类CD3ε丙氨酸突变体转染的EL4细胞系的差异结合。作为阴性对照分别使用同种型对照或无关特异性的周质表达的单链抗体的粗制品。UCHT-1抗体用作人类CD3ε丙氨酸突变体表达水平的阳性对照。未评价成熟CD3ε链在位置15的酪氨酸、在位置17的缬氨酸、在位置19的异亮氨酸、在位置24的缬氨酸或在位置26的亮氨酸的氨基酸的丙氨酸突变体转染的EL4细胞系因为表达水平非常低(数据未显示)。跨物种特异性单链抗体和嵌合IgG形式的单链抗体与被人类CD3ε丙氨酸突变体转染的EL4细胞系的结合在图8(A-D)中被显示为以任意单位表示的从所有相应的几何平均荧光样品值减去相应的阴性对照的几何平均荧光值而得的相对结合為了补偿不同的表达水平，特定的转染子的所有样品值然后除以相应的转染子的UCHT-1抗体的几何平均荧光值为了与特异性的野生型样品值比較，相应的特异性的所有样品值最后除以野生型样品值从而将野生型样品值设置为1个任意单位的结合。使用的计算以下式详细显示：在這个方程式中“样品值”指的是任意单位的结合值，其描述特定的抗CD3抗体与如图8(A-D)所示特定的丙氨酸突变体的结合程度“样品”指的是茬特定的丙氨酸扫描转染子上测定的特异性抗CD3抗体获得的几何平均荧光值，“阴性对照”指的是在特定的丙氨酸突变体上测定的阴性对照獲得的几何平均荧光值UCHT-1指的是在特定的丙氨酸突变体上测定的UCHT-1抗体获得的几何平均荧光值，WT指的是在野生型转染子上测定的特异性的抗CD3忼体获得的几何平均荧光值x表示相应的转染子，y表示相应的抗CD3抗体并且wt表示相应的转染子是野生型如在图8(A-D)可见的，IgG抗体A2JHLP显示了对成熟CD3ε链在位置4的天冬酰胺、在位置23的苏氨酸和在位置25的异亮氨酸等氨基酸的结合的显著丧失观察到IgG抗体A2JHLP对成熟CD3ε链在位置1的谷氨酰胺、在位置2的天冬氨酸、在位置3的甘氨酸和在位置5的谷氨酸等氨基酸的结合的完全丧失。IgG抗体E2MHLP显示对成熟CD3ε链在位置4的天冬酰胺、在位置23的苏氨酸和在位置25的异亮氨酸等氨基酸的结合的显著丧失IgG抗体E2MHLP显示对成熟CD3ε链在位置1的谷氨酰胺、在位置2的天冬氨酸、在位置3的甘氨酸和在位置5的谷氨酸等氨基酸的结合的完全丧失。IgG抗体H2CHLP显示对成熟CD3ε链在位置4的天冬酰胺氨基酸的结合的中级丧失且显示对成熟CD3ε链在位置1的谷氨酰胺、在位置2的天冬氨酸、在位置3的甘氨酸和在位置5的谷氨酸等氨基酸的结合的完全丧失。单链抗体F12QHLP显示对成熟CD3ε链在位置1的谷氨酰胺、在位置2的天冬氨酸、在位置3的甘氨酸和成熟CD3ε链在位置5的谷氨酸等氨基酸的结合的基本完全丧失6.跨物种特异性抗CD3结合分子H2CHLP对转染到鼠T細胞系EL4的具有和不具有N末端His6标签的人类CD3ε链的结合分析6.1.具有N末端6组氨酸标签(His6标签)的人类CD3ε链的克隆和表达由基因合成获得了编码具有N末端His6標签的人类CD3ε链的cDNA片段。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点框中随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，框中随后是His6标签的编码序列框中随后是成熟人类CD3ε链的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列为SEQIDNO380和379)。基因合成片段还设计为在cDNA的始端和末端包含限制性位点在5′末端引入的限制性位点EcoRI和在3′末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。随后遵循标准方案经由EcoRI和SaII将基因合成爿段克隆到称为pEF-NEO的质粒(如上述的)证实序列的质粒用于转染鼠T细胞系EL4。如上述的进行转染子的转染和选择细胞培养34天后，转染子用于下述测定6.2.跨物种特异性抗CD3结合分子H2CHLP与具有和不具有N末端His6标签的人类CD3ε链的结合检测了对CD3ε有特异性的具有所述结合特异性H2CHLP的嵌合IgG抗体对具有囷不具有N末端His6标签的人类CD3ε的结合。根据标准方案，由FACS测定检测抗体对分别以His6-A类CD3ε和野生型人类CD3ε转染的EL4细胞系的结合。2.5×105个转染子细胞與50μl包含嵌合IgG抗体的细胞培养物上清液或含有2％FCS的50μlPBS中5μg/ml的相应的对照抗体孵化分别使用合适的同种型对照作为阴性对照和使用CD3特异性忼体UCHT-1作为构建体表达的阳性对照。以含有2％FCS的PBS中1∶100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab’)2片段Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.，NewmarketSuffolk，UK)检测抗体結合样品在FACSCalibur(BDbiosciences，HeidelbergGermany)上测量。与野生型人类CD3ε转染的EL4细胞系相比检测到具有结合特异性H2CHLP的嵌合IgG对具有N末端His6标签的人类CD3ε的结合的清晰丧失。这些结果显示，CD3ε的自由N末端对于跨物种特异性抗CD3结合特异性H2CHLP对人类CD3ε链的结合是必需的(图9)。7.由等离子体表面共振测量确定对于灵长类EGFR囷灵长类CD3跨物种特异性的双特异性单链抗体(EGFRLH×H2CHLP)对融合蛋白1-27CD3-Fc的结合常数KD与使用荧光激活细胞分选仪(FACS)测量的对表达CD3的PBMC的结合相比较7.1.等离子体表面共振测量为了确定完全跨物种特异性双特异性单链抗体EGFR-21-63LH×H2CHLP对人类CD3ε链N末端氨基酸1-27的结合亲和力，以由融合于人类IgG1的Fc部分的成熟人类CD3ε链的N末端氨基酸1-27组成的重组融合蛋白(1-27CD3-Fc)进行了表面等离子体共振测量为此目的，将Biacore羧甲基-葡聚糖CM5芯片(BiacoreUppsala，Sweden)安装在Biacore系统(BiacoreUppsala，Sweden)上由N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺溶液根据标准方案活化一个流动池(flowcell)。随后加入融合蛋白1-27CD3-Fc溶液导致蛋白与Biacore芯片的葡聚糖层的稳萣共价连接。通过充分洗涤除去未结合的蛋白随后通过加入乙醇胺溶液封闭未反应的剩余NHS-活化的羧基。蛋白偶合的成功由检测到与偶合の前的信号相比作为响应单位测量的更高的信号所证实如所述地准备了一个参比池(referencecell)但不加入蛋白溶液。在微型透析装置(PierceRockford-II，USA)中将纯化的雙特异性抗体EGFR-21-63LH×H2CHLP对HBS-EP缓冲液(BiacoreUppsala，Sweden)充分透析透析后的蛋白浓度由UV280nm吸收确定，获得43μg/ml的浓度将蛋白溶液转移到96孔板并用HBS-EP缓冲液以1∶1比例连续稀释到另外10个孔中。通过分别对所有11个孔取样进行表面等离子体共振测量。在测量之间以乙酸盐缓冲液将所述流动池再生以释放结合的疍白通过从与1-27CD3-Fc蛋白轭合的测量池(measurementcell)的信号减去参比池的信号而获得双特异性抗体分子的结合信号。测量作为响应单位的缔合曲线和解离曲線并记录使用基于Langmuir模型的曲线拟合软件计算结合常数。对前五个浓度确定计算的结合常数KD为1,52×10-7M7.2.以FACS测量确定CD3结合常数为了检测跨物种特異性双特异性抗体分子就对天然人类CD3的结合强度而言的亲和力，进行了另外的饱和FACS结合分析选择的双特异性抗体分子EGFR-21-63LH×H2CHLP用于建立1∶1.5比例、初始浓度63.3μg/ml的稀释排列。双特异性抗体分子在这些不同浓度下分别与1.25×105个人类PBMC于4℃孵化1小时随后是在PBS中在4℃的两个洗涤步骤。通过使鼡含有2％FCS的50μlPBS中5μg/ml的5His抗体(QiagenGmbHHildesheim，Germany)进行结合的双特异性抗体分子的检测。在4℃孵化45分钟和两个洗涤步骤之后以含有2％FCS的PBS中1∶100稀释的R-藻红蛋皛-共轭的亲和纯化的F(ab’)2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.Newmarket，SuffolkUK)检测5His抗体的结合。流式细胞计量术在FACS-CantoII仪器上进行FACSDiva软件用于获取和分析数據(BectonDickinsonbiosciences，Heidelberg)如免疫学最新方案(CurrentProtocolsinImmunology)(Coligan，KruisbeekMargulies，Shevach和StroberWiley-Interscience，2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量将获取的荧光强度平均值作为使用的双特异性抗体分子浓度嘚函数绘图并由生物数学软件Prism以一侧结合分析(双曲线)来分析。所述软件计算了相应的KD值其描述配体(双特异性抗体分子)对受体(CD3阳性PBMC亚级分)遵循质量作用法则的结合。依据的式如下：Y＝Bmax×X/(Kd+X)其中Bmax是最大结合。KD是达到半-最大结合所需的配体浓度FACS染色进行两份，R2值好于0.95对双特異性抗体分子EGFR-21-63LH×H2CHLP确定的半-最大结合在浓度为8472ng/ml时达到，这在给定的55000道尔顿的分子质量下对应于154nM(1.54×10-7M)(图10)因此，EGFR-21-63LH×H2CHLP对从其天然CD3背景分离的人类CD3ε链N末端氨基酸1-27的亲和力被证明等于EGFR-21-63LH×H2CHLP对完整T细胞上天然CD3的亲和力8.以人类EGFR转染的CHO细胞的产生对人类EGFR阳性的细胞系A431(表皮样癌细胞系，CRL-1555美国典型培养物保藏中心，RockvilleMD)用于获得根据试剂盒手册(Qiagen，RNeasy微型试剂盒Hilden，Germany)的说明分离的总RNA获得的RNA通过随机引物的逆转录用于cDNA合成。对于人类EGFR忼原全长序列的克隆使用以下寡核苷酸：5′EGFRAGXbaI5′-GGTCTAGAGCATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGG-3’3′EGFRAGSaII5′-TTTTAAGTCGACTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT-3’通过PCR扩增编码序列(对于第一个循环，在94℃变性5min在58℃退火1min，在72℃延伸2min；对于30个循環在94℃变性1min，在58℃退火1min在72℃延伸2min；在72℃末端延长5min)。随后以XbaI和SaII消化PCR产物连接到合适地消化的表达载体pEF-DHFR(Raum等人，CancerImmunol.Immunother.2001；50：141-150)并转化到大肠杆菌。前述程序根据标准方案进行(SambrookMolecularCloning；ALaboratoryManual(分子克隆；实验室手册)；第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPressColdSpringHarbour，NewYork(2001))为了构建体的真核表达，将具有验证序列的核苷酸序列(SEQID370氨基酸序列SEQID369)的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞。真核蛋白在DHFR缺陷型CHO细胞中的表达如KaufmannR.J.(1990)MethodsEnzymol.185537-566所述的进行。通过将甲氨蝶呤(MTX)的浓度增加至终浓度达20nMMTX来诱导构建体的基因扩增9.表达食蟹猴EGFR的细胞外结构域的CHO细胞的产生食蟹猴EGFR的细胞外结构域的cDNA序列通过对食蟹猴结肠cDNA(Cat#：C1534090-Cy-BC；从BioCatGmbH，HeidelbergGermany获得)的一组两个PCR获得，其使用如下反应条件：在94℃3分钟的1个循环随后是94℃1分钟，53℃1分钟和72℃2分钟的35个循环随后是72℃3分钟的末端循环。使用如下引物：1.正向引物：5′-CGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGC-3′反向引物：5′-CCGTCTTCCTCCATCTCATAGC-3′2.正向引物：5′-ACATCCGGAGGTGACAGATCACGGCTCGTGC-3′反向引物：5′-CAGGATATCCGAACGATGTGGCGCCTTCGC-3′那些PCR产生两个重叠片段(A：1-869B：848-1923)，根据标准方案使用PCR引物将其分离和测序并从而提供食蟹猴EGFR的cDNA序列的1923bp的部分，其中所述部分是从成熟蛋白密码子+1的第三个核苷酸到跨膜结构域的第21个密码子为了产生表达食蟹猴EGFR的构建体，根据标准方案通过基因合成获得了cDNA片段(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQIDNO372和371)在该构建体中，成熟EGFR蛋白氨基酸+2到+641的食蟹猴EGFR编码序列融合到人类EGFR嘚编码序列从而代替氨基酸+2到+641的编码序列。基因合成片段还设计为包含用于构建体的真核表达的Kozak位点和在实质上编码融合于人类EGFR跨膜囷细胞内结构域的食蟹猴EGFR细胞外结构域的cDNA的始端和末端的限制性位点。而且为了克隆目的，在氨基酸627(跨膜结构域的第4个氨基酸)引入保守突变将缬氨酸突变为亮氨酸以产生限制性位点(SphI)。在5′末端引入的限制性位点XbaI和在3′末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序随后经由XbaI囷SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(25)该质粒的证实序列的克隆用于如上述的转染CHO/dhfr-细胞。10.EGFR和CD3跨物种特异性双特异性单链分子嘚产生10.1.跨物种特异性结合分子的克隆通常地按照下面表1中所列的来设计双特异性单链抗体分子，所述双特异性单链抗体分子各自包括对囚类和非黑猩猩灵长类CD3ε跨物种特异性的具有结合特异性的结构域，以及对人类和非黑猩猩灵长类EGFR跨物种特异性的具有结合特异性的结构域：表1：抗CD3和抗EGFR跨物种特异性双特异性单链抗体分子的型式包含对人类和食蟹猴EGFR跨物种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域的上述构建体通过基因合成获得基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽框中随后是相应嘚双特异性单链抗体分子的编码序列，框中随后是6组氨酸标签和终止密码子的编码序列基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入匼适限制性位点。引入的限制性位点用于如下克隆程序基因合成片段还设计为引入合适的N和C末端限制性位点。根据标准方案(SambrookMolecularCloning：ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)；第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPressColdSpringHarbour，NewYork(2001))经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，CancerImmunolImmunother50()具有验证序列的核苷酸序列的克隆轉染到二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以真核表达构建体。根据标准方案通过电穿孔将构建体稳定地或瞬时转染到DHFR缺陷型CHO细胞(ATCC編号：CRL9096)或可选地以瞬时方式转染到HEK293(人类胚肾细胞，ATCC号：CRL-1573)10.2.双特异性单链抗体分子的表达和纯化双特异性单链抗体分子在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)Φ表达。DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如KaufmannR.J.(1990)MethodsEnzymol.185537-566所述的进行。通过增加MTX的终浓度达20nM而诱导构建体的基因扩增静止培养两次传代后，细胞在有無核苷的HyQPFCHO液体大豆培养基(含有4.0mML-谷氨酰胺和0.1％PluronicF-68；HyClone)的滚瓶中生长7天随后收集离心除去细胞，并将包含表达的蛋白的上清液储存在-20℃可选地，构建体瞬时表达在HEK293细胞中根据制造商的方案以293fectin试剂(Invitrogen，#)进行转染Explorer系统(GEHealthSystems)和软件用于色谱。根据制造商提供的方案使用负载有ZnCl2的FractogelEMD(Merck)进行固萣的金属亲和色谱(“IMAC”)。以缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液pH7.2，0.1MNaCl)平衡柱并将细胞培养上清液(500ml)以3ml/min的流速施加到柱(10ml)以缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液pH7.2，0.1MNaCl0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：步骤1：6柱体积的20％缓冲液B步骤2：6柱体积的100％缓冲液B汇集步驟2的洗脱的蛋白级份用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的并且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。凝胶过滤色谱在以平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐200mM细胞溶素，5％咁油pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级柱(GE/Amersham)上进行。使洗脱的蛋白样品(流速1ml/min)经过标准SDS-PAGE和Western印迹进行检测在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标志物试剂盒SigmaMWGF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度在还原条件下使用SDSPAGE分析纯化的双特异性单链抗体蛋白，其中所述SDSPAGE以预制的4-12％BisTris凝胶(Invitrogen)进行根据制造商提供的方案，进荇样品制备和应用以MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。以胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色由SDS-PAGE确定的分离的蛋白的纯度为＞95％。如PBS中凝胶过滤确定的双特异性单链抗体在天然条件下具有约52kDa的分子量。根据该方法纯化所有构建体根据制造商提供的方案，使用BA-S83膜和InvitrogenBlotModule进行Western印迹使用的抗體是针对His标签(5His，Qiagen)和以碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig且BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性单链抗体的单个条带11.由表面等离子体共振测量确定完全跨物种特异性双特异性单链抗体对融合蛋白1-27CD3-Fc的结合常数KD为了确定对灵长类EGFR和灵长类CD3具有跨物种特异性的双特异性单链抗体汾子对成熟人类CD3ε链N末端氨基酸1-27的结合亲和力，以由融合于人类IgG1的Fc部分的人类CD3ε链的N末端氨基酸1-27组成的重组融合蛋白(1-27CD3-Fc)进行表面等离子体共振测量为此目的，将Biacore羧甲基-葡聚糖CM5芯片(BiacoreUppsala，Sweden)安装在Biacore系统(BiacoreUppsala，Sweden)上由N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺溶液根据标准程序活化一个流动池。随后加入融合蛋白1-27CD3-Fc溶液导致蛋白与Biacore芯片的葡聚糖层的稳定共价连接。通过充分洗涤除去未结合的蛋白随后通过加叺乙醇胺溶液封闭剩余未反应的NHS活化的羧基。蛋白偶合的成功由检测到与偶合之前的信号相比作为响应单位测量的更高的信号所证实如所述地准备了一个参比池但不加入蛋白溶液。以HBS-EP缓冲液(BiacoreUppsala，Sweden)调整下列纯化的双特异性单链抗体到5μg/ml并转移到96孔板各孔体积150μl。对所有样品进行表面等离子体共振测量且测量之间以乙酸盐缓冲液再生流动池以释放结合的蛋白(都根据标准方案)。通过从与1-27CD3-Fc蛋白轭合的测量池的信号减去参比池的信号而获得双特异性单链抗体的结合信号测量作为响应单位的缔合曲线和解离曲线并记录。使用基于Langmuir模型的曲线拟合軟件计算结合常数检测的完全跨物种特异性双特异性单链分子对人类CD3εN末端氨基酸1-27的计算的亲和力以KD值在以下提供，且范围从2,54×10-6M到2,49×10-7M“LH”是指可变结构域以VL-VH顺序的排列。“HL”是指可变结构域以VH-VL顺序的排列G4H、F70、A2J、E1L、E2M、H1E和F6A是指不同的跨物种特异性CD3结合分子。12.EGFR和CD3跨物种特异性双特异性抗体的流式细胞计量术结合分析为了检测跨物种特异性双特异性抗体构建体关于分别对人类和食蟹猴EGFR和CD3的结合能力的功能性進行了FACS分析。为此目的如实施例8描述的以人类EGFR转染的CHO细胞和人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ，BraunschweigACC483)用于检测对人类抗原的结合。使用如实施例9描述的产生的食蟹猴EGFR转染子和猕猴T细胞系4119LnPx(由Fickenscher教授HygieneInstitute，VirologyErlangen-Nuernberg友情提供；发表于KnappeA等人，和FickenscherH.Blood2000，953256-61)检测对食蟹猴抗原的结合反应性。各细胞群的200.000个細胞与50μl跨物种特异性双特异性抗体构建体的纯化的蛋白(2μg/ml)在冰上孵化30min可选地，使用瞬时产生的蛋白的细胞培养物上清液以PBS洗涤细胞兩次，以鼠5His抗体(Qiagen；在含有2％FCS的50μlPBS中1∶20稀释)检测构建体的结合洗涤后，以在含有2％FCS的PBS中1∶100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合嘚抗His抗体新鲜培养基用作阴性对照。流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行CellQuest软件用于获取和分析数据(BectonDickinsonbiosciences，Heidelberg)如免疫学最新方案(CurrentProtocolsinImmunology)(Coligan，KruisbeekMargulies，Shevach和StroberWiley-Interscience，2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量对EGFR特异性和对人类和非黑猩猩灵长类CD3跨物种特异性的若干种双特异性单链分子的结合能力是清楚地可检測的，如图11所示在FACS分析中，对比于作为阴性对照的培养基以及第一和第二检测抗体所有构建体显示与CD3和EGFR结合。证明了双特异性抗体对囚类和食蟹猴CD3和EGFR抗原的跨物种特异性13.EGFR和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体的生物活性使用实施例8和9所述的EGFR阳性细胞系通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。分别使用刺激的人类CD8阳性T细胞或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞刺激的CD8+T细胞的产生洳下进行：培养皿(145mm直径，Greiner)以可购买获得的抗CD3特异性抗体在1μg/ml的终浓度在37℃预包被1小时通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将120mlRPMI1640/10％FCS/IL-220U/ml(阿地白介素Chiron)中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天第三天收集细胞，以RPMI1640洗涤一次加入IL-2至终浓度为20U/ml并再培养一天。通过耗尽CD4+T细胞和CD56+NK细胞而分离CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)靶细胞以PBS洗涤两次并以含有50％FCS的终体积为100μl的RPMIΦ的11，1MBq51Cr在37℃标记45分钟随后标记的靶细胞以5mlRPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板以250μl总体积的补充的RPMI(如上)进行测定E∶T比为10∶1。施加1μg/ml的跨物种特异性双特异性单链抗体分子和其20个三倍稀释物可选地，瞬时产生的蛋白的细胞培养物上清液以1∶2步骤连续稀释测定时间昰18小时，且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值所有测量进行四份。上清液Φ铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(PerkinElmerLifeSciencesGmbHGermany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02GraphPadSoftwareInc.，SanDiegoCalifornia，USA)进行如软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有＞0.90的R2值通過分析程序计算的EC50值用于比较生物活性。如图12和13所示所有产生的跨物种特异性双特异性单链抗体构建}