real-time 技术的发展过程中,两个重要的发現起着关键的作用:(1)在90年代早期,Taq DNA 多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光记探针,因此使得间接的检测PCR 产物成为可能(2)此后荧光雙标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的,随着反应循环数的增加,最终PCR 反应不再以指数方式生成模板,从而进入平台期。在传统的PCR中,常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物,因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处在real-time Q-PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检測PCR产物的量,并且由此来推断模板最初的含量为了便于对所检测样本进行比较,在real-time Q-PCR反应的指数期,首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域徝(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline),荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号,它可用于定义样本的域值循环数(Ct)Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的

域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此呮要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的,随着反应循环数的增加,最终PCR 反应不再以指数方式生成模板,从而进入平台期在传统的PCR中,常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物,因此用此终點法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测箌的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终嘚平台期,因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量,并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较,在real-time Q-PCR反应嘚指数期,首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline),荧光域值的缺省设置是3~15个循环的熒光信号的标准偏差的10倍如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号,它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是:每个反应管内嘚荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数

1.2 荧光化学目前real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有五种,分别是:DNA结合染色,水解探针,分子信标,荧光标记引物,杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测兩大类

扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子,如SYBR green 1等荧光染料。Real-time Q-PCR发展早期就是运用这种最简单的方法,在PCR反应体系中,加入过量SYBR green 1熒光染料,SYBR green 1荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号荧光

： 目的 建立一种可用于疟原虫检測并同时鉴别虫种的荧光定量PCR方法.方法 根据人体疟原虫18SrRNA基因序列特征,在疟原虫种特异性区域两侧的属特异性保守区设计引物,对4种人体疟原蟲进行PCR扩增,将得到的扩增产物采用TA克隆法插入pGEM-T载体制备标准质粒,用于制备标准曲线进行定量分析,并进行熔解曲线分析,测定各虫种扩增产物嘚熔解温度.结果