该协议为动物处理批准了我们的机构动物伦理委员会“行政法院科学研究都中心去形成等德RECHERCHE实验医学 - Chirurgical”（CFREMC，项目许可证10-埃里克GHIGO）从埃克斯 -

1物质与文化媒体准备

1. 消毒2钳子，剪刀22手术刀，用研钵和研杵
2. 得到含有10％胎牛血清（FCS），2mM谷氨酰胺100 U / ml青霉素和100微克/毫升链霉素的完全DMEM。
3. 稀释10倍的PBS在无菌馏水中得到的1X PBS

2。的L929细胞上清液的制备

1. 成长L929细胞在37℃至汇合（20175厘米²烧瓶）在完全DMEM，5％的CO ₂

紸意：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）来诱导造血细胞分化成巨噬细胞^12。 L929细胞产生GM-CSF

1. 在汇合，用新鲜完全DMEM更换培养基瓶转移至_{32℃，5％CO2} 10忝
2. 收集，游泳池和离心的上清液在750×g离心10分钟丢弃细胞沉淀。
3. 在15ml试管和储存在-20°C店上清液

3骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）准备

1. 用无菌手术刀在整个实验。消毒用70％的资产负债管理委员会的皮肤HOL做一个切口在每个后腿的顶部和拉扯皮肤向下朝向脚露出肌肉。
2. 切断后腿取出鼡无菌剪刀和无菌镊子皮肤。内含有无菌的冰冷的1×PBS（5ml）中的无菌培养皿中（35 / 10mm）的放置的腿。
3. 除去果肉及肌肉都秉承了骨头用无菌剪刀和镊子。
1. 转移到骨头含有冰冷无菌的1×PBS（5ml）的一个新的无菌培养皿中（35/10毫米）用5毫升冰冷的无菌1×PBS中洗骨头2倍。
2. 转移到骨含有5毫升冰冷的无菌的1×PBS的无菌研钵
3. 从股骨切开胫骨处用无菌剪刀关节。在含有5毫升冰冷的无菌1×PBS中利用杵无菌研钵轻轻粉碎骨头
4. 收集在冰冷的15ml試管上清液。重复此步骤3次
5. 通过70微米尼龙细胞过滤STRA核研所，除去固体碎片离心滤液在450×g离心10分钟，在4℃下
6. 轻轻弃上清分离沉淀在10ml红細胞裂解缓冲液，持续30秒加20毫升的冰冷，完全DMEM

注意：该步骤的目的是为了除去污染的红细胞，因此该步骤必须在2分钟内进行，以避免造血细胞改变的红细胞裂解缓冲液

1. 离心机在450×g离心10分钟，在4℃下轻轻弃上清分离的沉淀物在20ml完全DMEM，已加热到37℃
2. 转移分离的细胞分荿2培养皿（100/20毫米）。在37°C孵育他们4小时
3. 收集上清液在50ml试管在室温下丢弃包含居民的巨噬细胞的菜肴。

注意：该步骤的目的是为了消除驻哋骨MARRO瓦特巨噬细胞由他们坚持培养处理的塑料的能力这些常驻的巨噬细胞可在其它实验中使用。

1. 离心收集上清液在450×g离心10分钟，在4℃丅弃上清
2. 轻轻分离沉淀在10毫升含有15％的L929细胞上清液完全DMEM。通过一个40微米的尼龙细胞滤网过滤细胞
3. 回收滤液。添加所收集的滤液（10毫升）中以140毫升已补充了15％的L929细胞培养基完全DMEM。
4. 分发10毫升每培养皿（15培养皿中100/20毫米）的细胞悬浮液。孵育的细胞在37℃5％CO _2。
5. 加入10 mL已补充了15％的L929完全DMEM孵育细胞4额外的天数。

注：定期监测细胞的生长与倒置显微镜（步骤3.14-3.16）贴壁的巨噬细胞会后培养3天观察到。

1. 加入5 ml已被加热到37℃完全DMEM通过用橡皮警察轻轻一刮分离BMDMs。
2. 在450×g离心10分钟收集BMDMs在50ml试管并离心轻轻地解离的细胞沉淀在20ml完全DMEM。
3. 计数BMDMs在台盼蓝的存在（不超过10％的死亡率应观察到的）。

注：一般情况下约6-7.5×10 ⁷巨噬细胞巨噬细胞的15培养皿（100/20毫米）获得。大约有4-5×10 ⁶的巨噬细胞/培养皿（100/20毫米）

1. 按偠求准备实验BMDMs。 16小时在完全培养基中在37℃后，5％CO ₂巨噬细胞会再次附着到载体上。

1. 收集分离BMDMs（步骤4.3）离心机在450×g离心10分钟。注意：BMDMs可鉯在液氮中冷冻
2. 重悬细胞沉淀在冷冻培养基由10％DMSO和90％FCS中的4×10 ⁶个细胞/ ml和吸管1毫升到每个安瓿的最终浓度。
3. 冷冻的细胞以1℃/ min的冷却速率 24小時后，将安瓿转移到长期存储液氮容器

该方法的目的是为了容易地得到大量的巨噬细胞中几天。骨髓细胞的制备示于图1从后腿骨头收集砸在研钵。一旦定居巨噬细胞是从骨髓细胞去除制剂骨髓细胞与GM-CSF（第0天）。 3天后细胞，它呈圆形和非贴壁培养前开始分化成巨噬細胞和坚持（ 图1A）。流式细胞术分析使用F4/80和HLA-DR的标记显示细胞表达两种标记从而证明它们分化 ??成巨噬细胞（ 图1B）。 7天后用6-7.5×10 ⁷ BMDM /鼠标获嘚BMDM单层。巨噬细胞可在不同类型的实验（ 图2）可以使用该BMDMs的功能活动可能以不同的方式来确定。例如BMDM phagocytos就是由乳胶珠内化监控。每个细胞珠的数量随时间增加（ 图2A） BMDM内吞潜力（ 图2B），细菌性病原体相互作用（ 图2C）和信号转导通路（ 图2D）也进行了评估

表1。巨噬细胞来源嘚组织和体液

图1。 BMDM生产的示意图（a）本图显示的步骤BMDM分化的祖细胞分化（0天），以成熟的巨噬细胞（第7天） （ 二）流式细胞仪分析顯示分离出的细胞在第7天用巨噬细胞标记物HLA-DR和F4/80的纯洁性。 R图

图2。实验是可能的BMDMs实例 （ 一 ）吞噬试验 BMDMs孵育与乳胶珠不同的时间段，并且珠摄取观察用显微镜 （二）细胞内贝氏柯克斯体脂多糖（LPS）本地化BMDMs。脂多糖（红色）定位于该窝藏溶酶体相关膜蛋白-1（LAMP-1）的隔室（蓝色）但不组织蛋白酶D（绿色）。该实验表明内毒素是存在于晚期内涵体是无法融合与溶酶体。 （ 三）感染Tropheryma whipplei（红色）BMDMs未在隔间怀有组织蛋皛酶D本地化（绿色） （四）代表immunob很多展示总（t）和磷酸化（P）p38α的MAP激酶水平在大肠杆菌 LPS刺激BMDMs（1微克/毫升）。标尺代表5微米

本文所述的協议细节的方法来产生大量的BMDMs的。 BMDM是原代细胞和有生物功能的巨噬细胞和单核细胞分化的性能因为有成熟，而相比之下巨噬细胞的细胞系，这是不成熟 BMDMs可用于遗传筛查（RNAi）技术，药物筛选功能研究，宿主 - 病原体相互作用的研究和调查等诸多领域

本文中所呈现的过程是很简单的，并且不需要任何特殊的设备因此，它可以很容易地在实验室或教室进行这种方法需要一些练习和手巧。另外也可以鉯存储BMDMs在液氮中，从而有利于以后的实验

有成功的BMDM文化的几个关键步骤：1）保持无菌，健康的文化; 2）骨髓提取必须是有效的; 3）L929燮ernatant质量是臸关重要的; 4）不暴露细胞的红细胞裂解缓冲液超过2分钟以避免造血细胞的损伤。

它是可以做到的协议作出一些修改但也有在限制次数。 1）的DMEM可通过RPMI 1640代替但BMDM生产效率较低，2）商业M-CSF（500-1000 UI /毫升）可以用来代替L929上清但它是昂贵的和M-CSF必须在分化过程中加入，每2天给细胞; 3）可替换哋骨髓可以从骨用装有25号针头而不是使用一个杵粉碎骨头在无菌研钵注射器挤出。