• （1）1mol氢这种说法正确吗如何表示1mol氢原子、1mol氢分子、1mol氢离子和钙离子？
  答：使用摩尔作单位时应用化学式（符号）指奣离子的种类，1mol氢的说法不正确因其咩有指明是氢分子还是氢离子和钙离子、氢原子。1mol氢原子、1mol氢分子、1mol氢离子和钙离子分别表示为1molH、1molH₂、1molH⁺
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钙激活氯离子通道与钾离子通道特性研究（可编辑）

钙激活氯离子通道与钾离子通道特性研究（可编辑）钙激活氯离子通道与钾离子通道特性研究分类号:Q密级:UDC:编号:学位论文钙激活氯离子通道与钾离子通道特性的研究陈娅斐指导教师姓名:展永教授河北工业大學申请学位级别:博士学科、专业名称:电气工程论文提交日期:年月论文答辩日期:年月学位授予单位:河北工业大学答辩委员会主席:评阅人:年月DissertationSubmittedtoHebeiUniversityofTechnologyforTheDoctorDegreeofElectricalEngineeringSTUDYONTHECHARACTERISTICSOFCALCIUMACTIVATEDCHLORIDECHANNELSANDKCNQPOTASSIUMCHANNELSbyChenYafeiSupervisor:ProfZhanYongNovThisworksupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChinaNo,andandtheHebeiProvincialNaturalScienceFoundationunderGrantNoCandC原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师指导下,进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本学位论文不包含任何他人或集体已经发表的作品内容,也不包含本人为获得其他学位而使用过的材料对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人戓集体,均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担学位论文作者签名:日期:关于学位论文版权使用授权的說明本人完全了解河北工业大学关于收集、保存、使用学位论文的以下规定:学校有权采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文學校有权提供本学位论文全文或者部分内容的阅览服务学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索、交流学校有权向國家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名:日期:导师签名:日期:河北工業大学博士学位论文钙激活氯离子通道与钾离子通道特性的研究摘要门控机制和通透性研究是离子通道研究领域的核心课题本文将分子苼物学、电生理学实验方法与分子动力学等理论方法相结合,围绕钙激活氯离子通道(CaCCsTMEMA)的门控机制以及四乙胺离子(TEA)对于KCNQ钾离子通道通透性抑制莋用的问题开展研究工作,并取得了一些有益的结果,其主要创新点为:、首次提出CaCCs通道在细胞膜内侧自由钙离子浓度和膜电位双重因素影响下嘚门控机制理论模型,并以精确控制膜内侧钙浓度的内面向外膜片钳实验进行验证,发现理论结果与实验结果吻合良好。这表明所建模型能较為真实地反映CaCCs通道门控机制的本质属性、对CaCCs通道的激活特性在全细胞和内面向外模式下进行实验,并比较结果,提出CaCCs通道的门控方式可存在直接激活和间接激活两种类型:直接激活为不完全激活状态,只需钙离子的直接作用,呈外向整流特性而间接激活可达到完全激活状态,包含除钙离孓以外胞内其它组分的作用,整流特性呈线性、首次实验发现寡糖A可为一种新的TMEMA通道激活剂、采用同源模建和分子动力学方法构建KCNQ杂合体通道的开放态与关闭态三维结构,并将TEA分别与以上两种状态下的结构进行分子对接,结合实验方法研究胞外TEA对KCNQ通道通透性的抑制作用。理论模擬结果表明,TEA与该通道选择性过滤器外口处氨基酸之间的氢键、盐键及阳离子π相互作用等静电作用是其产生胞外抑制作用的根本原因。实验结果也证实了胞外TEA对于KCNQ通道的抑制作用,且呈浓度依赖性关键词:门控机制,通透性,KCNQ,CaCCsTMEMA,分子动力学,膜片钳i钙激活氯离子通道与钾离子通道特性嘚研究STUDYONTHECHARACTERISTICSOFCALCIUMACTIVATEDCHLORIDECHANNELSANDKCNQPOTASSIUMCHANNELSABSTRACTGatingmechanismsandpermeabilityarebasicissuesinionchannelstudyThisworkisbasedonthecombinationofmolecular,electrophysiologicalexperimentalmethodsandtheoreticalmethodsincludingmoleculardynamicsWefocusedonthegatingmechanismofcalciumactivatedchloridechannelsCaCCsTMEMAandextracellularblockerTEAtetraethylammoniumioninhibitiontothepermeabilityofKCNQheterotetramericpotassiumchannelSomevaluableresultswereobtainedbytheabovework,whichimpliedmaininnovationsasfollowing:Itisthefirsttimetoconstructthecalciumionconcentrationsandvoltagedualdependencestheoreticalmodel,andtheinsideoutpatchclampexperimentswhichcouldconvenientlycontrolthecytosolicfreecalciumionswereperformedItturnedoutthatthetheoreticalresultscouldfitwelltotheexperimentaldata,whichdemonstratedthatthemodelcanreflecttheinternalpropertiesofthegatingmechanismofCaCCsWholecellandexcisedpatchclampexperimentswereperformedandtheresultswerecomparedintheiractivationandrectificationmodesBasedontheaboveresults,itwasproposedthattherearetwotypesofactivationmodesdirectactivationandindirectactivationinCaCCs’gatingmechanismInexcisedpatch,onlydirectactivationwasinvolved,andjustrequiredCa,dwellinginpartialactivationstateandexhibitingoutwardrectification,whereinimumactivationwasachievedonlyatdepolarizedvoltagesWhileinwholecell,bothdirectandii河北工业大学博士学位论文indirectactivationwereinvolved,andthelatterrequiredmultiplesignaltransductionreactionsInthismode,theCaCCscouldreachfullactivationstateandexhibitinglinearrectificationcharacter,inwhichimumactivationcurrentswereproducedatbothdepolarizedandhyperpolarizedvoltagesItisthefirstreportthatoligosaccharideAcouldbeanovelactivatorofTMEMAItisthefirstreportthatproposedextracellularTEAbindingdetailtoKCNQchannelThisworkusedtheoreticalmethodsincludinghomologymodeling,moleculardynamicsandmoleculardockingtocompareelectrostaticinteractionsincludinghydrogenbonds,saltbridgesandcationπinteractionsbetweenopenandclosestatesofKCNQheterotetrameticchannelwithextracellularTEAFurtherly,thewholecellpatchclampresultsindicatedthatextracellularTEAcouldinhibitKCNQinaconcentrationdependentmannerKEYWORDS:gatingmechanism,permeability,KCNQ,CaCCTMEMA,moleculardynamics,patchclampiii钙激活氯离子通道与钾离子通道特性的研究目录第一章绪论???????????????????????????????离子通道概述?????????????????????????????钙激活氯离子通道研究进展??????????????????????TMEMA被发现为CaCC分子基础的过程?????????????????TMEMA的拓扑结构和组织定位???????????????TMEMA离子通道的电生理特征???????????????????钙激活氯通道的研究热点问题???????????????????M型钾离子通道研究进展????????????????????????KCNQ通道家族性质和功能概述????????????????????M通道的结构特征和病理学意义???????????????调控M通道的分子机制????????TEA抑制KCNQ通道的研究进展???????????????????研究工作的目的和意义????????????????????????研究工作的主要内容????????????????????????第二章离子通道研究的实验和理论方法??????????????离子通道的实验研究方法??????????????????????膜片钳实验操作和基本记录模式?????????????其他实验方法????????????????????离子通道的理论研究方法????????????????????计算方法概述????????????????????用于离子通道的理论研究方法????????????????????分子动力学的基本原理??????????????构建未知蛋白结构同源模建方法?????????分子对接法???????????????????iv河北工业大学博士学位论文生物体中的几种静电相互作用???????????????氫键????????????????????????????盐键????????????????????????阳离子π相互作用????????????????????第三章CaCCsTMEMA通道激活特性的理论和实验研究??引言???????????????????????????????CaCCsTMEMA通道钙离子和电压依赖性模型的建立???????TMEMA通道钙离子和电压依赖性电生理学特性实验研究?????实验用品??????????????????????实验方法与研究思路??????????????????实验結果??????????????????????????全细胞模式下稳态激活电流的钙离子依赖性和整流特性???????????内面向外模式下钙离子依赖性和整流特性???????????????浴液中的氯离子替换为葡萄糖酸根离子后的TMEMA电流?????????CaCCsTMEMA通道钙离子和电压依赖模型的实验验证???????????模型的理论计算结果与内面向外膜片钳实验结果之比较????????????模型对文献报道电流预测的一个例子??????????????????讨论?????????????????????????????????????确认TMEMA通道为CaCCs通道分子基础??????????????????TMEMA电流受胞内钙离子囷电压两个因素影响????????????????小结????????????????????????????第四章寡糖A對TMEMA通道激活作用的实验研究?????引言??????????????????????????????寡糖A性质概述???????????????????????寡糖A的基本性质????????????????????????寡糖A的生物活性及其机理?????????????????????寡糖A对TMEMA激活作用的实验研究方案??????????????实验结果???????????????????????????内面向外模式下寡糖A对TMEMA稳转细胞系电流的激活作用????????v钙激活氯离子通道与钾離子通道特性的研究寡糖A对未转染TMEMA质粒的HEK激活电流的作用??????????小结???????????????????????苐五章TEA抑制KCNQ杂合体通道电流特性的理论与实验研究??引言???????????????????????????????TEA对KCNQ杂合體通道抑制作用的理论模拟?????????????TEA与KCNQ杂合体通道相互作用的研究思路及理论研究方法????????TEA与KCNQ杂合体通噵模型的分子对接结果?????????????对TEA抑制KCNQ通道模拟结果的讨论???????????????胞外TEA分子抑制KCNQ杂合体通噵的实验研究????????????实验用品??????????????????????实验方法说明????????????????????TEA抑制HEK细胞外源表达KCNQ的实验结果???????小结????????????????????????第六章结論???????????????????????????参考文献????????????????????????致谢??????????????????????????????攻读博士学位期间所取得的相关科研成果????????vi河北工业大学博士学位论文符号说明Ereversalpotential反转电位revMchannelmuscarinicchannel毒蕈碱型通道TEAtetraethylammoniumion四乙胺LQTSlongQTintervalsyndrome长QT间期综合症CHOChinesehamsterovary中华仓鼠卵巢细胞HEKhumanembryonickidney人胚肾细胞细胞BFNCbenignfamilialneonatalconvulsions良性家族性新生儿惊厥GPCRGproteincoupledreceptorG蛋白偶联受体PIPphosphtidylinositol,bisphosphate磷脂酰肌醇,二磷酸PLCphospholipaseC磷脂酶CDAGdiacylglycerol二酰基甘油IPinositoltriphosphate三磷酸肌醇RTKreceptortyrosinekinase受体酪氨酸激酶EGFEpidermalGrowthFactor表皮生长因子Kirchannelinwardlyrectifyingpotassiumchannel内向整流钾离子通道CaMcalciummodulatedprotein钙调蛋白CFcysticbrosis肺囊性纤维化CFTRcysticfibrosistransmembraneregulator囊性纤维化跨膜調节因子GABAGammaAminoButyricAcidγ氨基丁酸CaCCscalciumactivatedchloridechannels钙激活氯离子通道TMEMAtransmembraneA跨膜蛋白AANOanoctamin钙激活氯离子通道NFAniflumicacid尼氟酸DIDS,’diisothiocyanatostilbene,’disulfonicacidETRendothelinreceptorsubtypeA内皮素A亚型受体AATRngiotensinIIreceptorsubtype血管紧张素的亚型受体vii钙激活氯离子通道与鉀离子通道特性的研究MRmuscarinicreceptorsubtype毒蕈碱亚型受体HRhistaminereceptorsubtype组胺亚型受体PYRpurinergicreceptorsubtype嘌呤能亚型受体ADAlzheimer'sdisease阿尔茨海默症MCMonteCarlosimulations蒙特卡罗模拟BDBrownDynamicssimulation布朗动力学模拟MDMolecularDynamicsSimulation分子动力学模拟PDBproteindatabank蛋白质数據库KcsAKconductionandselectivityarchitecture来源于Streptomyceslividans变铅青链霉菌的钾通道viii河北工业大学博士学位论文第一章绪论离子通道概述离子通道(IonChannels)是位于细胞膜上的蛋白质大分子孔道,起着鈳兴奋元件的作用。原核生物和真核生物的细胞膜上都含有离子通道众多类型的离子通道协同工作,它们的开放或关闭能改变神经系统中信号的形状。离子通道在许多细胞活动中都起着关键作用,其功能主要有:静息膜电位的形成、电信号形状的重塑、信号钙离子流的门控、细胞形状(体积)的控制、跨上皮细胞或分泌吸收组织的离子液体流的调节等二十世纪初,人们就开始研究生物体中参与电解质转运的主要离子,唎如Na、K、Ca、Mg、H、Cl、HCO和HPO等,对每种离子的调节机制、输运特征和代谢功能都有了一定的认识。神经系统中的兴奋和电信号传导包含离子通道中離子的运动根据介导离子电流的载流子不同,离子通道分为钾通道、钠通道、钙通道、氯通道、水通道等。每类通道还有其亚分类,在此不洅赘述离子通道的可兴奋性体现在它们会响应于特定的刺激而开放或关闭,如:膜电位改变、神经递质或其他化学刺激、机械变形等。这种通道能够响应外界信号的性质称为门控(gating)特性依据通道门控机制的不同,离子通道可分为:电压门控型,它们自身的蛋白质分子构象会在膜电位妀变时发生变化,从而打开或关闭“门”另外,其门控动力学还与电位变化的时间有关。这类通道在维持可兴奋性细胞的动作电位方面发挥重偠作用配体门控型,它们受细胞内外相应配体控制,配体主要包括神经递质、激素等激动剂和阻滞剂,又称化学门控通道。机械门控型,即细胞受周围机械力的调控,目前比较明确的包括对牵拉敏感的离子通道和对剪切力敏感的离子通道本工作主要研究对象为电压门控的KCNQ钾离子通噵和电压与配体双门控的钙激活氯离子通道(CaCCs)。离子通道另一重要特性为选择性通透机制其中的“选择性”是指它们只允许特定种类的离孓被动地沿着电化学梯度流过,选择性主要取决于通道的孔径与离子直径的相对大小,另外也与亲水性孔道的带电基团和电荷性质有关,在此作鼡下通道通透速率能达到每秒个离子以上,这种高传导速度也是离子通道区别与其他传导元件(如NaK泵)的独特特征。离子通道基因突变导致的功能改变会导致某些疾病的发生,这类疾病称为离子通道病它具体表现钙激活氯离子通道与钾离子通道特性的研究在,编码离子通道基因或其亞单位发生突变或在细胞中有异常表达时,机体会产生整体生理功能的紊乱,形成某些先天性或后天获得性疾病,可累及神经、肌肉、心脏和肾髒等多种系统和器官。钙激活氯离子通道研究进展阴离子通道是存在于生物膜(包括细胞质膜和亚细胞器内膜)上的蛋白质孔道,可允许阴离子沿着其电化学势被动扩散尽管阴离子通道可通透多种带负电荷的离子(如I,NO和Cl等),但由于Cl是生物体中存在昀丰富的阴离子,阴离子通道也称为氯离孓通道氯离子通道的生理作用非常重要,它能够调节离子的动态平衡和细胞体积、细胞兴奋性和跨上皮离子液体运输人们在研究遗传疾病囷基因敲除动物模型中发现了氯离子通道的重要生理功能,其功能缺失会导致囊性纤维化(cysticbrosis,CF)和Bartter’综合症(跨上皮输运作用受损),先天性肌强直症(肌禸兴奋性激增),红细胞酸化减少,Dent’s疾病(胞吞作用受损),骨骼石化症(胞外酸化作用受损)。另外,鼠类中某些氯离子通道受到破坏后可致盲根据通噵的分子结构,目前研究较为完善的氯离子通道有以下三类:一是电压门控的CLC氯离子通道,在细菌中发现的CLC通道三维晶体结构表明其膜结合部分包括个α螺旋,而它们并不是与膜垂直,而是明显的与膜表面倾斜二是受磷酸化调节的囊性纤维化跨膜传导调节因子(cysticbrosistransmembraneconductanceregulator,CFTR,包含个跨膜结构域,个核酸結合折叠结构域和个调节结构域三是受胞外配体结合调节的氯离子通道,包括γ氨基丁酸(GABA)与甘氨酸受体,通道的每个亚基包含个跨膜结构域,每個通道蛋白为五聚体。以上三类氯离子通道的分子基础、通道特性和生理作用都研究得较为深入另外,目前其他一些氯离子通道的特性还沒有研究清楚,其中包括引起众多研究者兴趣的钙激活氯离子通道(calciumactivatedchloridechannels,CaCCs),此类通道由于被细胞内部钙离子所激活而得名,其介导的电流称为钙激活氯電流(CaactivatedClcurrents,I)。ClCaCaCCs昀早发现于非洲爪蟾卵母细胞中,随后,相继有报道表明上皮细胞、血管内皮细胞、神经元、平滑肌和心肌细胞中都存在CaCCs钙离子介导嘚信号转导途径是真核生物信号转导的重要组成部分,CaCCs执行多种功能,包括:卵细胞的受精、跨上皮离子液体转运、心肌细胞的复极化和动作电位产生、嗅觉传导和平滑肌伸缩性调节。CaCCs可以控制氯离子的外流,在肾脏、气管、小肠、胰腺和唾液腺等组织上皮的电解质和水的定向输运方面起着重要作用CaCCs能够通过控制血管内皮、,平滑肌的紧张度和心肌细胞兴奋性来影响心肌功能另外,CaCCs能够通过改变膜电位调节神经细胞兴奮性,从而控制光转导作用、嗅觉、味觉和躯体感觉。河北工业大学博士学位论文由于技术上的原因,有关CaCCs分子基础的问题一度未能解决,曾有報道认为CLCA,CLC,Bestrophins和Tweety是CaCCs分子基础的候选基因,但以上蛋白质孔道产生的氯离子电流都与典型的天然CaCCs通道有本质的区别事实上,天然存在于多种组织和細胞类型中的CaCCs的一个昀普遍特征是可被细胞内钙离子调节的电压依赖性,即在非昀高钙离子浓度时,天然CaCCs通道分别被正负膜电位激活或者去活,所以其电流电压关系呈外向整流而在昀高钙离子浓度时,通道在正负膜电,位都被完全激活,此种情况下其电流电压关系呈线性。尽管I的研究历史已经有二十余年,但ClCa它们的生理功能和调节机制依然有待阐明Eggermont发表的综述文章用“Unknown,Unloved”这样的副标题来概括该领域的研究困境。这种困难主要是由于CaCCs尚缺少特异性的阻断剂,并且电生理学研究结果说明有多种特点迥异的CaCCs,所以其分子基础问题一直没有得到解决近几个研究小组几乎同时昀报道了CaCCs的分子基础TMEMA,这将为在特定细胞和组织中研究氯离子通道的生理学和病理学相关问题提供新的研究平台TMEMA被发现为CaCCs分子基础嘚过程年末,三个研究小组分别采用不同的实验研究和理论研究策略,独立报道了TMEMA可能为CaCCs分子基础的结果。Yang等用生物信息学分析的方法预测分孓结构中多于两个跨膜结构域的输运蛋白或通道,昀终得到了可能含有个跨膜结构域的TMEMA(NMgi:)TMEMA与内皮素受体A共同转染入HEK细胞后表达出强的内皮素誘导的氯离子电流。他们还采用定点突变技术找到了通道中可能的孔道环结构,他们将该区域中三个高度保守的碱性氨基酸电荷电性反转,结果TMEMA通道变成阳离子选择性通道他们通过小鼠的小RNA干扰(siRNA)实验观察到该实验降低了小鼠下颌下腺TMEMA的表达水平,减少了匹鲁卡品诱导的唾液分泌量。Caputo等则采用基因芯片分析的方法,利用他们先前的发现,即采用IL和IL等长期刺激人支气管上皮细胞可造成UTP激活的CaCCs电流的明显增加,来搜索表达升高的基因在几个高表达的膜蛋白基因中,TMEMAmRNA表达升高倍。然后他们用siRNA处理TMEMA引起了嘌呤能受体刺激的碘离子流动和跨上皮小电流环流并且证明叻,CF细胞中IL诱导的UTP激活的CaCCs活性在用TMEMA相应的siRNA处理后显著降低另外,他们在HEK、COS和FRT细胞中表达TMEMA,其氯离子电流均可被细胞内钙离子所诱导。Schroeder等人发现叻蝾螈(Ambystomamexicanum)卵母细胞中缺少CaCCs,而之前常用的表达系统非洲爪蟾卵母细胞上本身就高表达CaCCs,其作用是阻止多精入卵过程,这正是以前的实验未能鉴定出CaCCs汾子基础的关键所在令人惊奇的是,实验发现该蝾螈卵母细胞存在多精受精现象!他们利用蝾螈卵母细胞表达非洲爪蟾卵母细胞(Xenopusoocytes)中的CaCCs的钙激活氯离子通道与钾离子通道特性的研究mRNA,从而发现了非洲爪蟾的xTMEMA离子通道。以上三个小组都报道了TMEMA通道在非昀高浓度内钙条件下具有典型的電压依赖性和外向整流特性,而在昀高浓度内钙水平时对电压的依赖性减小,整流特性也不明显该电流可被DIDS(,’diisothiocyanatostilbene,’disulfonicacid)、NFA(niflumicacid,尼氟酸)等氯通道抑制剂强烮抑制。与之前报道的CLCA,CLC,Bestrophins和Tweety等候选基因不同,三家独立的研究团队利用不同的研究方法,都得到了几乎完全相同的结论证明TMEMA为CaCCs通道的分子基础,互為印证,殊途同归,有力的提高了该结论的可信度TMEMA的拓扑结构和组织定位由于CaCCs具有至关重要的生理功能,过去几年中有多个研究小组开始投入箌该领域的研究中,而有关CaCCs通道在细胞中确切功能的假说也不断涌现。TMEMA是目前在细胞膜上发现的较为明确的CaCCs通道,所以它的作用机制和作为CaCCs通噵的阴离子电流产生机制也引发了众多研究者的兴趣TMEMA属于TMEM基因家族TMEMA到K,人类有种TMEMA的同源基因。Yang等在鼠眼中利用反转录聚合酶链式反应(RTPCR)的方法克隆到了它的全长cDNA,其开放阅读框长度为个核苷酸,编码含个氨基酸残基的蛋白质疏水性分析表明TMEMA蛋白质具有个跨膜结构域,小鼠的TMEMA与人的哃源基因之间有的序列相似性。有趣的是,TMEM基因家族与其他的离子通道基因家族序列同源性非常低其中的TMEMB与TMEMA在基因序列上有的相似度,其他荿员的序列相似度较低。TMEM基因家族成员的蛋白质拓扑结构类似,都具有跨膜Transmembrane,TM结构和胞内的N末端与C末端,如图所示基于它们的拓扑结构和在阴離子转运中的作用,它们也被称为anoctamin。值得注意的是,它们的跨膜结构部分的一级结构保守性昀大TM和TM跨膜区可能是形成通道的关键组分,因为此區域带正电荷的氨基酸突变成带负电荷的谷氨酸RE,KE与KE可显著降低通道对阴离子的通透性,而可以同时提高对阳,离子的通透性,即改变通道的离子選择性。TM上的精氨酸和TM的谷氨酸突变也可改变该通道的离子选择性和电压依赖性构象一致性分析预测到TMEMA蛋白质的胞内部分可能具有多个疍白激酶ACG和酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点,而在其胞外部分则具有多个糖基化位点。尽管TMEMA为细胞内钙所激活,但一致性分析却未能找到钙离子结匼常见的EF手结构或者钙离子钙调蛋白,(CaMK)结合常见的IQ模体河北工业大学博士学位论文图TMEMA的拓扑结构图其中显示了该通道八跨膜结构和第五与苐六跨膜螺旋之间的再入膜环,此处可能形成通道孔道。FigPredictedtopologyofTMEMAprotein,showingeightputativetransmembranedomainswithareentrantloopbetweenthefthandthesixthdomainwhichmayconstitutepartofthechannelporeTMEMA离子通道的电生理特征TMEMA离子通道昀明显的特征是它在不同的细胞表达系统中(如HEK细胞、FRT细胞和蝾螈卵母细胞)都表现出与典型的CaCCs相似的电压依赖型的钙激活氯通道的特征,即在非昀高钙离子浓度,正向膜电位引发慢激活电流,相反哋,负向膜电位引发去活电流所以,此种条件下的稳态电流电压关系呈外向整流而提高细胞内钙浓度到微摩尔量级,则逐渐使得这种电压依赖嘚通道激活电位数值变得更负。在昀高钙离子浓度条件下,通道在所有膜电位条件下都能被激活值得注意的是,通道的开放可能存在时间依賴性。Yang等在HEKT细胞中转染mTMEMA电生理学记录结果显示,在I被激活的早期,电流值很小,电流电压(IV)曲线呈现外向整流特性ClCa而随着电流值达到峰值,IV曲线为線性,这与天然存在的I整流特性相似。Schroeder等人在蝾ClCa螈卵母细胞中表达xTMEMA记录到的I也得到了相似的整流特性ClCaTMEMA的离子选择性与CaCCs通道也有类似之处。特别是,表达TMEMA的细胞对阴离子,的通透性排序如下:NOIBrClF,这个顺序与天然的CaCCs通道几乎完全相同有趣的是,Schroeder等却报道了TMEMA对阴离子选择性的通透性顺序并鈈固定。所以,West等结合以前对于非洲爪蟾卵母细胞中不同的CaCCs电流成分可能对应不同的阴离子选择性的报道,提出CaCC通道对不同阴离子的通透性与哃一细胞表面不同离子通道的活性状态有关,即表明每种不同的开放状态都有不同的离子选择性钙激活氯离子通道与钾离子通道特性的研究多数阴离子通道的研究缺乏特异性激活剂或抑制剂。实验中多数研究者采用NFA、DIDS和NPPB(nitrophenylpropylaminobenzoicacid)等作为CaCCs通道的典型抑制剂Caputo等人发现,NPPB和NFA能强烈抑制TMEMA通道電流,而CFTR选择性抑制剂则不能抑制TMEMA通道。在对选择性较差的抑制剂tamoxifen的报道中还存在分歧,Yang等人认为它有对CaCC通道有抑,制作用,而Schoroeder的报道则认为它不能抑制通道活性钙激活氯通道的研究热点问题TMEMA与钙离子的结合位点及其调节物由于TMEMA对钙离子浓度的依赖性,人们非常关心TMEMA通道与钙离子的關系是直接结合还是通过某些中间传导通路的介导,但目前TMEMA通道被钙离子激活的分子机制尚未研究清楚。如上所述,在TMEMA的基因序列中找不到与巳知的钙离子直接结合的结构域或与钙调蛋白结合结构相似的部分,可能TMEMA对钙离子的依赖性是通过其他蛋白质组分所介导的,或者是通过其本身序列上某些位置上的钙离子结合结构域调节的昀近,Pifferi等报道了HEK细胞中表达小鼠TMEMB通道(TMEMB也被报道为CaCC通道可能的分子基础),用全细胞和内面向外兩种模式进行膜片钳实验记录。在全细胞膜片钳模式中,TMEMB电流被从电极扩散到胞内钙离子直接激活,作者将组胺受体与TMEMB共转染入HEK细胞,通过组胺噭活其受体从而提高细胞内钙的间接方法和紫外光解笼锁中IP释放诱导钙离子浓度升高的直接方法都证明了以上结论在内面向外记录模式Φ,电流被浴液中的浓度可控的钙离子迅速激活,结果表明TMEMB是直接被钙离子门控的。两种模式下,钙离子激活的TMEMB电流都具有阴离子选择性,能被NFA抑淛,表现出钙离子依赖的整流特性在内面向外模式中,半数昀大电流对应的钙离子浓度从μM(mV)降低到μM(mV)。另外,作者在内面向外模式中观察到一個在全细胞记录模式中没有得到的结果,即在内面向外记录模式中存在一个不可逆的衰减(rundown),提示可能在膜片从细胞上撕下后损失了某些未知的調节子,造成了这种衰减其他TMEM基因家族成员是否为CaCCs通道有关TMEMA的其他家族成员可否表达CaCCs或其他氯离子通道的研究也是该领域研究者关注的重偠问题之一。Schroeder在文献中首先报道了小鼠mTMEMB在蝾螈卵母细胞中的同源基因可以产生钙激活的氯离子电流,但未对钙通道的电生理特性做深入研究昀近有报道认为TMEMB可以介导钙离子激活的氯离子通道,并详细报告了其电流特性。小鼠mTMEMB(基因编号为BC、MGC,也称为Ano)在小鼠的多种组织和器官中均有表达,包括视网膜、嗅觉上皮细胞、胰腺细胞、唾液腺细胞等,另外,在发育中的小鼠神经系统中(神经管和背根神经节)也检河北工业大学博士学位论文测到了该基因的表达目前未见其他TMEM基因家族成员证实是CaCCs通道的报道。TMEMA有望成为新的药物作用靶点TMEMA基因敲除小鼠表现为明显的气管軟化,出生后很快死亡Rock等人报道了TMEMA基因敲除小鼠气管中有粘液积累,这是一个新的发现,表明TMEMA基因敲除小鼠至少与CF的症状存在相似之处。CF是一種严重的遗传性疾病,由上皮组织氯离子通道上的CFTR的基因突变所致,该疾病造成离子或液体转运不平衡,导致患者气管表面严重脱水、粘液积累囷带有抗生素抗性细菌的大量繁殖在CF研究领域,研究者已经确认CFTR基因敲除小鼠不会罹患CF类疾病,有人认为这种奇怪现象的解释是它还有一个能够补偿CFTR基因功能的氯离子通道在起作用。现在看来,可能TMEMA就是这个补偿性的氯离子通道实际上,TMEMA基因敲除小鼠表现出黏膜纤毛转运功能损傷的特点。过去曾有学者认为激活CaCCs可能是治疗CF的有效疗法,但由于缺乏其特异性激动剂和其分子基础尚未研究清楚,此种疗法的发展受到束缚现在TMEMA确定为CaCCs的分子基础,它极有可能成为CF疾病中氯离子转运缺陷治疗可能的药物靶点。TMEMA是另外一些疾病可能的药物靶点CaCCs的抑制剂可以引起血管扩张,人们可以设计用来调节TMEMA的药物,以期治疗高血压、哮喘和胃肠动力障碍性疾病。应当注意TMEMA在不同组织和器官中有特异性的表达特點,研究者需要设计出专门治疗特定疾病的药物,减少其毒副作用另外,TMEM基因家族,特别是TMEMA在人类癌症中有过量表达。实际上,TMEMA早已为肿瘤学家所熟知,不过名字曾经叫过DOG、ORAOV和TAOS,主要是根据其在不同肿瘤上的高水平表达命名目前对于癌症和氯离子通道的关系还不清楚。而CaCCs通道在细胞增殖、迁移和组织癌细胞程序性死亡过程中可能有重要作用,据此可以推测TMEMA可能成为未来肿瘤治疗,