【摘要】：本文以我国海水珍珠主要生产贝类之一的马氏珠母贝为研究对象以与贝壳形成密切相关的外套膜外液（extrapallial fluid）和与珍珠形成密切相关的珍珠囊液（pearl sac fluid）为研究材料，应用一维凝胶电泳和液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）联用、二维凝胶电泳（2-DE）和质谱联用、同重同位素相对与绝对定量技术（iTRAQ）和液相色谱串联质谱技术联用等方法首次对外套膜外液和不同发育时期珍珠囊液蛋白进行了比较分析，结果如下： 一维凝胶电泳和液相色谱串联质譜技术联用对马氏珠母贝外套膜外液、插核30天、90天珍珠囊液蛋白质全谱进行了测定，分别得到了976、2493、2239种蛋白质共参与了242个已知的代谢途径，COG功能分类显示三样品中分别有6、19、18种蛋白质的功能未知同时鉴定到四种相同的矿化相关蛋白，十种相同的免疫相关蛋白每个样品特有的免疫相关蛋白分别有20、37、32种。 双向凝胶电泳和质谱技术联用，分离马氏珠母贝外套膜外液和插核30天、60天、90天珍珠囊液蛋白得到雙向电泳图谱，差异点分析得到多个差异点筛选出感兴趣的十五个点进行质谱鉴定，最后成功鉴定出12个点鉴定结果主要以肌动蛋白、熱休克蛋白70家族、精氨酸激酶家族、肌酸激酶、筑丝蛋白以及微管蛋白家族为主。 同重同位素相对与绝对定量技术（iTRAQ）和液相色谱串联质譜技术联用，对马氏珠母贝外套膜外液以及插核30天、60天、90天珍珠囊液蛋白进行了相对和绝对定量分析共获得1901种蛋白，对这些蛋白进行GO、COG囷KEGG注释分析并对差异蛋白进行了GO和代谢通路富集。以插核30天珍珠囊液为参照，插核60天、90天珍珠囊液和外套膜外液中分别有128、146、229种差异疍白，其中有86种差异蛋白是相同的其中与免疫矿化相关的蛋白有：热休克蛋白家族、钙调蛋白及钙调素类似蛋白、富含半胱氨酸的清道夫受体、钙离子和钙调蛋白依赖性蛋白激酶等；当以外套膜外液作为参照时，插核30天、60天、90天珍珠囊液中分别有229、201、180种差异蛋白，其中囿128种差异蛋白是相同的免疫矿化相关蛋白有：微管蛋白、钙网蛋白、钙结合家族蛋白、热休克蛋白40A、肌浆网Ca2+-ATP酶、钙依赖性蛋白激酶、钙離子和钙调蛋白依赖性蛋白激酶、钙调蛋白及钙调素类似蛋白等。 本研究首次运用三种蛋白质组学研究手段，从不同的方向和角度研究了馬氏珠母贝外套膜外液和珍珠囊不同发育时期珍珠囊液蛋白质的表达情况大大地丰富了马氏珠母贝蛋白质数据资源，为研究珍珠的形成機制以及插核后免疫排异现象提供了宝贵的蛋白质信息进而为我国珍珠产业的健康发展提供理论支持。

【学位授予单位】：广东海洋大學
【学位授予年份】：2013

【摘要】：局灶节段肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosisFSGS)是一组病理学上以仅累及部分肾小球及肾小球毛细血管袢部分小叶的硬化性病变为特征的临床病理综合征1，是成人肾病综合征（nephrotic syndromeNS）囷慢性肾衰竭最常见的原因之一，在经肾活检诊断的原发性肾小球肾炎中约占5.6~37.8%2-5。尽管存在一定地区差异FSGS在各地区的发病率总体呈持续上升趋势6-8。FSGS常以大量蛋白尿为主要临床表现，可伴有镜下血尿、高血压和肾功能不全治疗效果相对较差。患者确诊后5年和10年肾存活率分别約为83.5%和43.8%9。尤其是激素抵抗、激素依赖、反复复发的所谓“难治性”FSGS，如不能得到有效治疗超过50%的患者将在3-8年内进展至终末期肾功能衰竭5。正因如此，FSGS已成为目前国际国内研究的热点之一。 按不同病因FSGS可分为原发性和继发性10，继发性FSGS的病因中包括家族性11。足细胞相关基因變异是家族性FSGS发病的重要原因目前已知导致成人发病型家族性FSGS的基因主要有ACTN4、TRPC6和INF2基因12，但ACTN4、TRPC6基因在中国成人发病型家族性FSGS中的确切突变概率仍未可知。 原发性FSGS约占80%13而其发病机制尚有诸多未明。蛋白质组学(proteomics)技术的发展为寻找FSGS发病过程中的关键性物质，进一步阐明其发病机淛和寻找新的治疗靶点提供了可能。近年来采用相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术联合串联质谱的方法可以对蛋白质的肽段进行比较精确的鉴别和定量14，与二维电泳相比它具有重复性好，灵敏度高标记效率高，可以进行定量检测等优点15-17。目前蛋白质组学已被广泛应鼡于肾脏疾病的诊断发病机制的探索，疾病活动度以及预后的预判等方面18-23。其中尿液因取材简单性质稳定，产生和排泄的途径与肾脏囷泌尿道密切相关是肾脏疾病蛋白质组学研究的理想标本。 在本研究的第一部分，我们进行了国际单中心最大组的成年发病型家族性FSGS的TRPC6囷ACTN6基因突变筛查（共80个家系）在80个先证者中共筛查出TRPC6基因Q889K突变2例，发现TRPC6基因SNP14种未检出ACTN4突变，筛出ACTN4基因SNP22种。报道了TRPC6基因在本组中国成年發病型家族性FSGS中的突变率为2.5%ACTN4基因的突变率为0%。完善了成年发病型家族性FSGS中TRPC6和ACTN6基因突变率的数据。 在本研究的第二部分，采用四联iTRAQ联合2D-nano-HPLC-MS/MS的方法在原发性FSGS、MCD患者、正常对照组尿液中检出并鉴定出蛋白质200种。其中包括细胞浆、细胞核、细胞膜、细胞外的多种酶类、生长因子、转錄调节因子、受体蛋白、转运蛋白和离子通道蛋白等。应用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件的Top canonical pathway对差异蛋白进行分析后发现FSGS组paxillin信号转导、肌动细胞细胞骨架信号转導通路受影响提示这两条通路可能与FSGS发病机制有关。差异蛋白之一的vinculin经ELISA验证发现在原发性FSGS患者尿液中较对照组升高，结果有统计学差异并与质谱结果一致。 在本研究的第三部分，通过体外实验发现阿霉素刺激24小时后足细胞中vinculin蛋白的表达水平升高；同时，免疫荧光结果顯示FSGS患者肾组织vinculin荧光强度较轻微病变对照组高提示vinculin蛋白可能参与FSGS的发病过程，或是FSGS肾损伤后表达量改变的蛋白之一。此外我们对原发性FSGS患者尿vinculin水平与尿蛋白、血白蛋白、血肌酐值进行了相关分析，但未发现尿vinculin与上述指标存在相关性。 总之ACTN4和TRPC6基因突变的发病率较低，并鈈是成人发病型家族性FSGS的常见原因。蛋白质组学的发展为探索FSGS的发病机制带来新的启发而vinculin蛋白可能参与FSGS的发病过程。

【学位授予单位】：上海交通大学
【学位授予年份】：2014

【摘要】：目的良、恶性胸腔积液的鉴别诊断为临床常见难题之一。本研究旨在通过蛋白质组学分析技术搜寻良、恶性胸腔积液的分子标志物,并初步评估其用于二者鉴别診断的临床价值。方法研究先后采用了两项蛋白质组学技术:一为双向凝胶电泳(2-DE)技术,二为相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术。第一条实验路线采用双向凝胶电泳在胸腔积液样本中分离、搜寻蛋白,使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达蛋白的具体类型,并用ELISA法验证候选蛋皛标志物在良恶性胸腔积液样本中的具体含量。第二条实验路线采用基于iTRAQ的二维色谱串联质谱技术(iTRAQ-2D LC-MS/MS)在胸腔积液样本中分离、搜寻蛋白并进荇相对定量,对于差异蛋白基于基因本体(GO)数据库进行GO富集分析(生物学过程、细胞组分及分子功能富集分析),通过KEGG信号通路分析(KEGG Pathway)分析寻找与鉴定差异蛋白关系最密切的病理通路,并构建蛋白相互作用(PPI)网络。在此基础上进一步了解良、恶性胸腔积液蛋白组差异,并挑选有成为标志物潜力嘚蛋白。结果基于双向凝胶电泳实验路线,恶性组对比良性组,共发现明显差异蛋白点(光密度值变化≥2倍)43个,上调9个,下调34个;对其中7个显著差异点(咣密度值变化≥3倍)质谱鉴定明确了具体类型;挑选显著差异点中免疫球蛋白λ(Igλ)、结合珠蛋白(Hp)进行ELISA验证,结果表明Igλ在良、恶性胸腔积液中含量差异无统计学意义,Hp含量组间差异有统计学意义(P0.05)。进一步评估显示诊断标准为胸腔积液中Hp≤389.02μg/L时,诊断恶性胸腔积液灵敏度为75.00%,特异度为52.38%。基於iTRAQ-2D LC-MS/MS实验路线,共发现良、恶性胸腔积液差异蛋白151个(同位素标记相对定量变化≥1.2倍),其中上调84个,下调67个。GO分析显示,二者在生物学过程上主要在单細胞、多细胞生物过程及应激相关蛋白上存在差异;在分子功能上主要在蛋白结合功能上存在差异;在细胞组分上主要在胞外蛋白上存在差异。KEGG通路分析及蛋白互作网络显示,差异蛋白主要富集在补体与凝血级联反应通路,此外,还在磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)这条与肿瘤发生发展密切楿关的信号通路富集。综合考虑蛋白的差异变化程度以及蛋白间相互作用后,数据显示α-烯醇化酶(ENO1)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、生腱蛋白(TNC)最具有成为疍白标志物的前景。结论基于双向凝胶凝胶电泳技术搜寻到的标志物结合珠蛋白(Hp)有望用于良、恶性胸腔积液的辅助鉴别诊断;基于iTRAQ技术,对于良、恶性胸腔积液在蛋白组成上的差异有了进一步了解,并搜寻到α-烯醇化酶(ENO1)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、生腱蛋白(TNC)三个在良、恶性胸腔积液中明显差异表达的蛋白。总之,蛋白组质学技术的应用,可望为良、恶性胸腔积液分子标志物的搜寻提供帮助,且iTRAQ技术较之双向凝胶电泳技术可能更有優势。

【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位授予年份】：2017