胚胎干细胞特有小分子多肽es61编码基因的克隆方法

【专利摘要】本发明提供了一种胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法步骤如下：（1）提取人绒毛组织总RNA，然後将总RNA反转录成cDNA；（2）设计PCR扩增引物将目标基因扩增出来；（3）PCR产物的回收和纯化；（4）基因酶切连接转化本发明的能够有效克隆该ES61编碼基因，方便了以后ES61多肽基因的定量检测为以后研究ES61多肽基因功能奠定了基础。

【专利说明】胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法

[0001]本发明属于基因工程领域具体涉及一种胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法。

[0002]人胚胎干细胞(Embryonic Stem cell, ES细胞)是在胚胎发育早期存茬的一类细胞具有全能性，能分化成为生物体的各个组织器官；RP4-792G4.2 (NCBI登陆号HG)基因是目前发现特异性表达于ES细胞等多能干细胞中的一类不能翻譯蛋白质的ncRNA (non-coding RNA, ncRNA),研究发现,RP4-792G4.2基因可以编码一种有61个氛基酸组成的多肽命名为ES61多肽，编码ES61多肽的核苷酸序列由183个碱基组成编码61个氨基酸，此氨基酸经过生物信息学分析存在典型分泌信号肽序列

[0003]目前尚没有人报道针对该多肽ES61编码基因的克隆方法，因此难以完成对该ES61多肽基因的定量检测以进一步研究该多肽的功能。

[0004]本发明的目的是针对以上要解决的技术问题提供一种有效的针对胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法。

[0005]为了实现以上技术目的本发明公开了一种胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法，步骤如下:

[0007](2 )设计PCR扩增引物将目标基因扩增出来；

[0010]根据本发明的方法所述步骤(2)的具体操作为:在ES61后面添加HA标签序列，上下游引物两端分别添加XhoI和HindIII限制性内切酶序列引粅扩增片段总长度为234bp ;将目标片段克隆连接到PLEGFP-N1真核生物表达载体中，引物序列如下:

1.一种胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法步驟如下: (I)提取人绒毛组织总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ； (2 )设计PCR扩增引物将目标基因扩增出来； (3)PCR产物的回收和纯化； (4)基因酶切、连接、转化

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)的具体操作为:在ES61后面添加HA标签序列上下游引物两端分别添加XhoI和HindIII限制性内切酶序列，引物扩增片段总长度为234bp ;将目标片段克隆连接到PLEGFP-N1真核生物表达载体中引物序列如下:

10个循环；在60°C退火，进行25个循环；PCR反应循环后72°C继续延伸7min然后16°C保存。

3.根据权利要求1所述的方法其特征在于:所述步骤(4)中，用XhoI和HindIII酶对上述PCR产物和PLEGFP-N载体进行双酶切酶切反应体系如下:10X Buffer4 μ I，DNA约2 μ g内切酶(?ου/μ I)各1μ 1，灭菌去离子水补足到40μ 1反应条件37°C、lhr。

5.根据权利要求1所述的方法其特征在于所述步骤(4)中，转化步骤如下:取连接产物加到100 μ 1DH5 α感受态细胞中，混匀冰浴30分钟；将上述转化液置于42°C水浴90秒，取出后立即置于冰浴中放置2-3分钟；向其中加入900μ 137°C预热的LB培养基150rpm、37°C振蕩培养45分钟；2500rpm离心5min，将上清液吸走留100 μ I混匀菌液，加到含Kana抗生素LB固体琼脂培养基上用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开；待平板表面干燥后，倒置平板37°C培养12-16小时。

【发明者】张茂雷, 陈杰 申请人:广州达恩基因科技有限公司