500年来人们一直对《蒙娜丽莎》鉮秘的微笑莫衷一是。不同的观者或在不同的时间去看感受似乎都不同。有时觉得她笑得舒畅温柔有时又显得严肃，有时像是略含哀傷有时甚至显出讥嘲和揶揄。在一幅画中光线的变化不能像在雕塑中产生那样大的差别。但在蒙娜丽莎的脸上微暗的阴影时隐时现，为她的双眼与唇部披上了一层面纱而人的笑容主要表现在眼角和嘴角上，达·芬奇却偏把这些部位画得若隐若现，没有明确的界线，因此才会有这令人捉摸不定的“神秘的微笑”。荷兰阿姆斯特丹的一所大学应用“情感识别软件”分析出蒙娜揭密蒙娜丽莎的微笑笑包含的內容及比例：高兴 83％厌恶 9％，恐惧 6％愤怒 2％。

一位著名的大学心理学家从心理学角度解析“蒙娜丽莎”的矛盾情绪“达芬奇想给她畫像，这让‘蒙娜丽莎’挺高兴但她又有些厌恶由一名老男人为自己画像。生气的原因是她已经坐在那里许久了，可达芬奇还没画完”