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蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程
&&分子生物学
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第14章.同位素标记技术在分子生物学实验技术中的应用
第14章.同位素标记技术在分子 生物学实验中的应用中国农业大学 齐孟文标记探针? 探针（proble) 带有检测标记的，与被检测目标 物分子具有特异性互补反应性能的探测物分子或 分子片断。 ? 探针类别核酸探针 DNA、RNA探针非核酸探针，抗体、蛋白质分子标签等核酸探针双链DNA探针DNA探针核酸探针 RNA探针DNA探针单链DNA探针cDNA探针标记类别标记信号 放射性标记非放射性标记32P，33P，3H, 35S，125I，131I生物素、酶、地 高辛配体、荧光 素 等。标记位置 均匀标记 非均匀标记 如DNA末端标记标记核素核素3H 32P 33P 35S 125I 131I半衰期12.33a 14.26d 25.5d 87.23d 60d 8.04的衰变方 式?-(100) ?-(100) ?-(100) ?-(100) EC ?-(100)?粒子能量 /MeV0. 0.248 0.167?粒子能量 /MeV0.027-0.0320.605 0.333标记单体? 掺入DNA探针的常用单体标 记化合物 [?-32p]dATP，[?32p]dCTP ， [?-32p]UTP ，[?32p]ATP 。国内供应商：北京福瑞 国外供应商： UK标记单体? 在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标 记物主要是放射性同位素，如32P，33P和 35S 。在掺入核苷酸的标记过程中，只有三 磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸链中，因 此使用 α 位磷酸被标记的三磷酸核苷酸， 如 [ α- 32 P]dATP 。而在标记 5' 末端磷酸 基团的反应中一般使用γ位磷酸被标记的 ATP 。放射性的信号通过X- 光片放射自显 影或磷屏扫描获取。核酸探针标记法 1.双链DNA探针⑴ 切口平移法 首先用DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后 借助于E.coli DNA聚合酶I的5`→3`外切酶活性，切去 带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活 性，使同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活 性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷 酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯 化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。最合适的 切口平移片段一般为50-500个核苷酸,产生均匀标记的 探针。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比 活性取决于[α -32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置 换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的 质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物 如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。切口平移法(2)随机引物法 通过热变性使模板DNA 变为单链DNA，随机 引物与单链DNA退火后，利用Klenow Fragment合 成互补链。此时如果底物中dNTP的一种或几种被 [α -32P], [α -35S], [3H] 等标记时，那么合成 的互补链DNA也被标记。合成后的双链DNA通过热 变性变成单链后即可用作杂交探针。随机引物 法? DNA标记法比较：切口平移法 反应时间 延长反应时间会降低 标记效率。必须确保 反应时间。 ～108 dpm/μg 琼脂糖等抑制反应。 随机引物法 短时间内即可得到高比活性的 探针。即使反应时间延长也不 受影响。 ～109 dpm/μg 即使有琼脂糖等混入，也相对 不受影响。探针比活性 模板纯度反应后纯化模板量要求需要除去未反应的dNTP ≥1 μg不需要除去未反应的dNTP≥25 ng2.单链DNA探针⑴ 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 M13噬菌体是一种单链DNA噬菌体，但它在感 染宿主（大肠杆菌）后，在菌体细胞内复制成为 双链并繁殖，又以单链形式透出菌体，再度感染 新的宿主菌。 将模板序列克隆到M13噬菌体,以特定的同用 引物或人工合成寡合苷酸为引物，在[?-32P]dNTP 存在下，由Klenow片断 酶促合成标记探针，反应 完毕后，酶切长短不一的产物，然后通过变性凝 胶电泳与模板分离。
⑵ 从RNA合成单链cDNA探针 用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: a. 寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用 于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏 向于mRNA 3‘末端序列。 b. 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上 述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA 中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列 往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。反转录得到 的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可 被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析 即可得到单链探针。
3.寡核苷酸探针 若只知道待分离的目的基因编码的 蛋白质产物，而对其核苷酸序列一无所知， 即可设计合成寡核苷酸探针。 利用寡核 苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的 点突变。 单一已知序列的寡核苷酸探针. 种类 许多兼并性寡核苷酸探针组成的 寡核苷酸探针库.4.RNA探针许多载体如pBluescript, pGEM等均带有来自 噬菌体SP6或E.coli噬菌体T7或T3的启动子,它们 能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA 聚合酶所识别,合成特异性的RNA。在反应体系中 若加入经标记的dNTP，则可合成RNA探针。 RNA探针一般都是单链,它具有单链DNA探针的 优点,又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主 要是： RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的 稳定性,所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性 的DNA探针所产生信号要强。 RNA:RNA杂交体用 RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA杂交体容易控制,所 以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果。5.末端标记（1）一种是在5`末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP 转移加到DNA片段5`-OH上。 （2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个 单标记的ddUTP。6.PCR 扩增标记在PCR扩增时加入标记的 dNTP ，不 仅能对探针 DNA 进行标记还可进行大量扩 增，尤其适合于探针 DNA 浓度很低的情形。标记一般流程核酸分子杂交? 互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配 对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过 程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可 以根据所使用的探针已知序列进行特异性 的靶序列检测。杂交类型核酸杂交 固相杂交 印迹杂交Southern Northern 斑点(dot)狭槽(slot)菌落 噬菌 真核原位杂交液相杂交Southern杂交DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜 或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA 或RNA。 Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA 片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤: (1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位 变性。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼 龙膜)上。 (3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性 结合的探针。 (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。检测灵敏 Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与 32 P标记的高比活性探针的(&109 cpm/μ g)互补 DNA。如果将10μ g基因组DNA转移到滤膜上，并 与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则 可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序 列。限制性酶切割限制片段 琼脂糖电泳DNA分子带有DNA片段的凝胶用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上凝胶 滤膜转膜 吸附有DNA 片段的膜杂交、显影Southern 印迹杂交的技术流程
凝胶电泳电泳示意图转印方法(1)毛细管虹吸 优点是简单,不需要用其他仪器。缺点 是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。 (2)电泳转印 将DNA变性后,经电泳印移至带电荷的尼 龙膜上。优点是可直接转移较大的DNA片段，缺点是转 移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管和真 空转移无效时,才予以采用。 (3) 真空转移 一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在 真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从 上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉 积在滤膜上。该法的优点是快速,在30分钟内就能从正 常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(&1%)的凝胶中定量地 转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强23倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 在洗膜不严格 时,其背景比毛细管法的要高。虹吸印迹
杂交过程分子杂交炉
成像观测? 放射性自显影 利用标记核素自身的放射性射线 使感光材料感光成象的过程。目前常用的方法有: 传统的胶片自显影 感光屏：医用X光片；原理： 爆光过程，射线粒子使X光片乳胶基质中均匀分布 的溴化银晶粒感光形成物点的潜影，然后经显影 及定影得像图。胶片影象可在底片上直接观察。X光自显影暗盒及图像增强屏
成像观测储存磷光屏（storage phosphor screen） 一种由磷光晶体制成的影像屏（Imaging Plate)。经射线爆光后IP以潜能储存射线能，当 在读取装置下扫描读取时， IP在扫描激光下释放 潜能发出蓝绿光，光强与爆光时射线强度成正比， 用光电传感器转换电信号，再经模数转换成二进 制编码信号，由计算机成象系统合成为影象图。 操作：用塑料薄膜盖电泳凝胶，贴附于装于暗盒 的磷光屏曝光，然后在成像仪上，通过扫描磷光 屏上储存的光能进行成象。
UVI化学发光凝胶成像系统与著名的Molecular DynamicsTM PhosphorImagerTM 系统是一样， 台风储磷技术---磷屏Typhoon9000系列能对所有电离辐射源提供高分 辨率图像并精确定量： 3H 32P 14C 33P 125I 35S 18F 99mTc大成像面积，高分辩光学系统和灵 敏的磷屏组合，为您提供可靠的实验结果。下图给出的是用32P标记的 AtlasTM 微阵列(macroarray)在GP屏上的图像。成像观测? 闪烁光纤屏 由塑料光纤制成的板，光纤中填有铅 和发光染料，使射线能转换为可见光光子， 然后再由电荷耦合器件CCD摄像机成像。较 胶片和磷光屏的分辨率好，近实时成像且 需曝光量低。成像观测? 放射性薄层扫描仪 由空间位置灵敏探测器组成核探测仪器。 可用于薄层层析板、凝胶电泳转印膜上放 射性条带的直接定位测定。美国的Bioscan公司 AR-2000图 像扫描仪AR2000图像扫描仪可对所有类型同位素（包括3H）标 记的TLC板、凝胶、印迹进行直接定位定量计数测量。 扫描仪采用充气式计数器，可检测γ和β射线的同位素。 对整块薄层层析条带的扫描可在1分钟内完成。整套系 统包括一个仪器控制和数据采集软件，扫描结果以层析 图或2D图像显示，自动完成对峰的定量，并以多种方 式显示结果。 ? 应用于TLC板、凝胶和印迹 ? 不需破坏TLC板即可进行定量 ? 对所有类型同位素（包括3H）灵敏 ? 简单易用的WinScan软件 ? 快速、自动、可靠的运行 ? 提供出色的空间分辨率 ? 针对1、2、3块TLC板可选择不同的型号 ? 2-D彩色图像 ? 主要应用于放射化学纯度、脂类生物化学、代谢研究、 酶分析、毒理学研究等领域。瑞士卡玛产地：德国同位素薄层扫描仪技术参数扫描面积为 400×200 mm（Gita , Rita ） 50×200mm(mini Gita ,mini Rita ) 扫描速度：可选 轨道数目：1-80 检测器：γ -radiation (BGO detector) ，?-radiation (GM counting tube)，gasflow 检测能量范围：0-2000KeV 可检测的放射物: γ -radiation (BGO scintillation probe) 背景: 129I:0.7 cps (20-100 KeV) 灵敏度: 129I : 20 Bq in 10 min 分辨率: 129I : 2-3 mm(depending on the used collimator) 可检测的放射物: ?-radiation open proportional counting tube (Recommended for 3H -requires counting gas P10 = 90% Ar 10% Ch4) 背景: 18F : 0.1 cps 灵敏度: 18F : 10 Bq in 10 min 分辨率: 18F : 1-2 mm防护措施INSPECTORNorthern杂交Northern杂交与Southern杂交很相似, 主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变 性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保 证RNA完全按分子大小分离。变性剂主要有 3种:乙二醛，甲醛，羟甲基汞。电泳后的 琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法 将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探 针杂交。菌落原位杂交对分散在若干个琼脂平板上的少数菌 落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本 方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板 以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝 酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对 菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直 至得到筛选结果。菌落原位杂交
斑点杂交斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸 纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示 样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经 不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以 它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方 法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基 因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的 序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其当本底 干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。
DNA序列分析? Sanger双脱氧链终止法 Cambridge的F. Sanger于1977年发明。 基本原理： ①DNA聚合酶能够以单链DNA作为模板，准确合成 的DNA互补链；②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷 三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中， 加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3， M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种 ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。
DNA序列分析? Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)对一个末端标记的DNA片段，用化学试 剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段。把 反应分为四组，每一组反应特异性地针对 某一种或某一类碱基，并且要保证每个DNA 分子平均只有一个靶碱基被修饰，这样， 在每一组反应中都在同一个或两个核苷酸 处DNA链发生断裂，由于碱基位置不同，就 会产生一组不同长度的DNA片段。最后，经 过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自 显影后就可读出待测DNA的核苷酸序列。化学修饰法
Maxam-Gilbert法所用的化学修饰技术碱基 G A+G特异修饰方法在pH8.0下，用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化，使C8－C9键对碱 裂解具有特异的敏感性 在 pH2.0 下，哌啶甲酸可以使嘌呤环的 N 原子质子化，从而导 致脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键 肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易于除去 在1.5mol/LNaCl存在下，只有胞嘧啶可同肼发生明显可见的反 应C+T CA+C在90℃下，用1.2mol/LNaOH处理，可使A位点发生剧烈的断裂 反应，而C位点的断裂反应较微弱DNA序列分析? DNA序列分析自动化用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作 为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段 能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终 止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后用 计算机检测。荧光标记物ddATPddTTPddGTPddCTP单泳道电泳及信号收集正极负极计算机排序5@? GS FLX系统超高通量测序技术原理GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物 发光进行DNA序列分析的新技术：在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶， 荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚 合与一次荧光信号释放偶联起来 (图 1)。通过检测荧光信号释放 的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不 需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。
? GS FLX系统的操作过程GS FLX系统提供了完整的从样品制备到后续的生 物信息学分析解决方案。 1）样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品 序列测定：包括基因组DNA，PCR产物，BAC，cDNA， 小分子RNA等等。 2）样品DNA打断：样品例如基因组DNA或者BAC等被 打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA， 这一步骤则不需要。短的PCR产物则可以利用GS融合 引物进行扩增后直接进行步骤4)的工作。 3）衔接子连接：借助一系列标准的分子生物学技术， 将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DN**段上。 接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。图中 仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DN**段。? GS FLX系统的操作过程4）一条DNA片段＝一个磁珠：接头使成百上千条DN** 段结合到它们自己唯一的磁珠上，此磁珠被单个油水混 合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有 其他的竞争性或者污染性序列的影响；整个DN**段进行 平行扩增。 5）一个磁珠＝一条读长：经过PCR扩增后，每个磁珠 上的DN**段拥有了成千上万个相同的拷贝。经过富集以 后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入 到PicoTiterPlate板中供后继测序使用了。 6）数据读取和分析工具：GS FLX系统 在7.5小时的运 行当中可获得40多万个读长，读取超过1亿个碱基信息。 GS FLX 系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数 据进行分析，适用于不同的应用：例如多达3 GB序列 的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析， 及 120 MB的从头测序工作等。备注 焦磷酸测序(pyrosequeneing)是通过核苷酸 和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促 使荧光素发光并进行检测的测序技术。既可进行 DNA序列分析，又可进行基于序列分析的单核昔酸 多态性(single 年nueleotide polymohism，SNP) 检测及等位基因频率测定。 焦磷酸测序是由DNA聚合酶(DNAPolymerase)、 三磷酸腺酰硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素 酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化 同一反应体系的酶级联化学发光反应，反应底物 为5’---磷酰硫酸(adenosines 5’phosphosuifate，ASP）备注和荧光素。反应体系还包括待测序DNA单链和测 序引物。在每一轮测序反应中，加人1种dNTP， 若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺人到 引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。 硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光 素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与 ATP量成正比的可见光信号，并由PyrogramMT转 化为一个峰值，其高度与反应中掺入的核苷酸数 目成正比。根据加人dNTP类型和荧光信号强度就 可实时记录模板DNA的核昔酸序列。DNA序列分析? DNA杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization) 如果一段较短的DNA探针能与较长的 DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，则 可认为靶DNA上存在着相应的互补序列，这 就是DNA杂交测序法的基本原理。如果将一 种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer 寡核苷酸探针混合杂交，在总数为48=65536 种8-mer的探针群体中，仅有5种探针会与 靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。
DNA杂交测序法? SBH的应用： ① 可有效检测靶DNA中的单碱基突变； ② 可用于不同DNA片段之间的序列比较； ③ 可用于检测不同生长发育状态下细胞中 特定基因的表达状况； ④ 可用于检验传统测序技术的准确性。蛋白质研究技术? Western免疫印迹 将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检 测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进 行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分 的抗体检测。 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳， 被检测物是蛋白质，“探针”是抗体。经过 PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如 硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键形式吸 附蛋白质，且保持电泳分离的多肽类型及其生物 学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为 抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位 素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射 自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的 蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的 表达。WB
PCR应用? 1.PCR技术的原理无细胞克隆法：以拟扩增的DNA片段为模板， 一对分别与模板互补的寡核苷酸为引物，在4种脱 氧核苷酸（dNTP）存在下，由DNA聚合酶在引物所 结合的位置向3’方向合成新的互补链。其反应以 双链DNA的变性、退火、延伸为一个循环。经过多 次循环（25-30次），便目标DNA片段得以大量扩 增。由于每一次循环所产生的新链均可成为新的 模板用于下一轮循环，故PCR产物以指数方式增加。Mullis的PCR构思引物DNA聚合酶DNA聚合酶引物特定DNA片段5’(a) (b) 引物2 5’ 3’ 5’ (c) 引物2互补链 3’(d)靶DNA的扩增3’3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链 5’ 5’ 3’3’ 5’新引物(e)不同长度的链单位长度的链(f)引物2互补链5’ 3’3’ 5’引物1互补链(g)目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图PCR的一般过程： 预变性(93-95?C,2-5m) 变性(93-95?C,30s)(25-35)总延伸 延伸 复性 (50-70?C,30s) (75?C,30-60s) (75?C,7m)经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上 。PCR技术的原理PCR步骤: （1）高温变性，双链DNA变性（90～95℃） 成为单链； （2）低温退火（37-60℃） ，引物与单链 DNA互补序列结合； （3）适温延伸，DNA聚合酶催化（70-75℃） 使引物延伸。 （4）重复（1）-（3）步。PCR技术的原理? 实验材料、仪器和试剂 1.材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T 质粒DNA 2.仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备 3.试剂：10XPCR 反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1和引物2PCR操作步骤1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL 10μmol/L 引物1 1.0 μL 10μmol/L引物2 1.0μL 质粒DNA 1.0 μL Taq 0.1 μL(5U) 水补充至 25.0 μL2.PCR循环PCR仪PCR操作步骤3.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按 比例混匀,上样电泳。琼脂糖凝胶电泳PCR应用PCR应用2.与标记相结合的应用 ? LP-PCR(labelled primers) 利用同位素、荧光素等对PCR引物进行 标记，可用以直观的检测目的基因，特别 适合于临床基因诊断，同时可以检测多种 基因成分。
PCR应用2.与标记相接合的应用 ? 原位PCR (Is-PCR) 以整个细胞作为反应体系，对目的基 因进行扩增，然后通过原位杂交等不破坏 细胞结构的方法进行检测的方法。其检测 标本一般为细胞涂片或组织切片，适合低 拷贝靶序列的检测。可用于细胞内的病毒 感染、基因重排，以及基因表达的检测。
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蛋白表达与纯化专题
：涵盖四大蛋白表达与纯化（原核(大肠杆菌)，哺乳动物，酵母系统）介绍、原理、操作步骤及实验FAQ，内容全面、丰富。
蛋白表达通常是指生物体内蛋白质的合成、修饰以及调控过程。在表达系统的相关研究中，表达是指利用基因重组技术表达蛋白质的过程。本文主要关注后一个话题，着重阐述重组蛋白生产过程中的主要细胞机制（cellular machinery）。
零风险蛋白表达与纯化服务；
不成功，全免费；不成功，不收费。
蛋白表达与纯化简介
蛋白在细胞内的合成和调控取决于功能的需求，蛋白质的遗传信息都储存在DNA的模板中，并由转录过程中产生的信使RNA（mRNA）进行解码，遗传信息通过一个mRNA编码，然后翻译为蛋白质。转录是指遗传信息从DNA传递到mRNA的过程，而翻译是指蛋白通过mRNA指定的序列进行合成的过程。
转录和翻译的简略示意图，描述了从DNA碱基对序列(基因)到形成氨基酸多肽序列(蛋白质)的过程。
在原核细胞中，转录和翻译是同时进行的。翻译甚至在成熟的mRNA转录产物完全合成前就已经开始了。这种转录翻译同时进行的方式被称为转录翻译的耦合（coupled）。而在真核细胞中，转录发生在细胞核内，翻译或蛋白合成的场所则是在细胞质中，俩者是分开且依次发生的。
真核和原核的转录翻译对比图
原核生物和真核生物的转录的过程都包括三个步骤：起始，延伸和终止。当双链DNA解旋并与RNA聚合酶结合时转录开始。一旦转录开始，RNA聚合酶就会从DNA中释放出来。转录的过程的调控依赖激活蛋白和阻遏蛋白，同时也与真核的染色质结构有关。在原核生物中，mRNA的原始转录产物一般不需要加工修饰，翻译往往在转录完成前就开始了。然而真核细胞中，原始转录产物则需要进一步的加工——除去内含子，mRNA的5′端添加“帽子”，mRNA 3′末端在多聚腺苷酸聚合酶参与下加上了一段多个腺嘌呤序列（poly A尾）。修饰后的mRNA移动到细胞质中进行翻译。
翻译或蛋白的合成是一个复杂的过程，包括起始，延长和终止三个步骤。整个过程需要生物大分子的协同作用，如核糖体，转运RNA（tRNA），mRNA等；同时还需要很多的蛋白因子和小分子蛋白，如氨基酸，ATP，GTP以及其它辅助因子。这些特殊的翻译因子存在于翻译的每一步中（详情见下表）。原核和真核的翻译过程整体上是相似的，但在部分过程中依然存在着区别。
在起始阶段，核糖体的小亚基会引发t-RNA扫描mRNA，识别并结合mRNA5’端的起始密码子（AUG）。核糖体的大亚基和小亚基在起始密码子处链接并形成起始复合物。蛋白因子和mRNA参与到起始密码子的识别和起始复合物形成的过程中。延长阶段，tRNA会结合到特定的氨基酸上（这通常被称为tRNA的装载作用）并在核糖体中聚合形成肽，氨基酸通过转录产物的mRNA序列不断添加到正在增长的肽段中。最终，新生多肽在终止密码子处停止翻译。同时，核糖体释放mRNA，准备开始新一轮的翻译。
原核生物与真核生物翻译过程中的主要组成部分概述
30S和50S亚基
40S和60S亚基
模板或mRNA
转录后，mRNA转录产物不需要进一步的修饰
mRNA是多顺反子并包含多个起始位点
转录后，mRNA除去非编码区（内含子），并且在mRNA的5’端和3’端分别加入“帽子”结构（M7甲基鸟嘌呤）和聚腺苷酸序列。
“帽子”结构和poly A尾在mRNA转移到细胞质的过程起到很重要的作用，可以保证翻译的正确性以及mRNA在其他功能中的稳定性。
mRNA通常是单顺反子。
翻译的特点
Shine-Dalgarno序列存在于mRNA转录物中，是核糖体亚基中的一段互补序列。
SD序列有助于mRNA在起始位点与核糖体的结合准确。
新生多肽的第一位氨基酸是甲酰化的甲硫氨酸。
翻译的起始发生在俩个方面：
Cap-dependent翻译：“帽结构”和帽结合蛋白负责核糖体结合mRNA并识别正确的密码子。mRNA的5’端第一个AUG密码子作为起始密码子，有时Kozak 序列会出现在起始密码子附近。
Cap-independent翻译：核糖体与mRNA是通过mRNA的“内部核糖体进入位点”（IRES）进行结合。
三个已知启动因子：IF1，IF2，IF3
三个以上的经磷酸化调节的起始因子，在真核翻译中，启动步骤通常是限制步骤（rate-limiting step）
EF-Tu，EF-Ts，EF-G
EF1(α, β, γ)和EF2
终止或释放因子
翻译后修饰
翻译后的多肽会采用多种加工方式来完成其蛋白结构或调节细胞活性。翻译后修饰（PTMs）是指各种添加或改变蛋白化学结构的方法，PTMs在整体细胞生物学中起到至关重要的作用。
翻译后修饰的类型包括：
通过分子伴侣的帮助，多肽折叠成一个能量处于最低的状态球状蛋白。
氨基酸的修饰，如第一个甲硫氨酸残基的去除
二硫键的形成或减少
促进结合功能的蛋白质修饰
蛋白异戊二烯化对膜的定位
组蛋白乙酰化修饰DNA组蛋白的相互作用
为了保证蛋白活性而添加的官能团：
蛋白表达与纯化的方法
在一般情况下，蛋白质组学研究涉及调查的一个蛋白的许多方面，如结构、功能、修饰、定位或蛋白质的相互作用等。为了研究特定蛋白的生物学调节作用，研究人员通常需要采用生产手段制造出感兴趣的功能蛋白。
对于已知大小和复杂性的蛋白，不能采用化学合成的方法。相反，活细胞及其细胞器通常被作为模板基因合成蛋白的场所。
不同的蛋白质，既可以使用简单的DNA综合构建，也可以利用已知的DNA序列在体外重组构建。因此，特殊基因的DNA模板无论带不带额外的亲和标签序列，均可以构造为表达模板。通过这样的重组DNA模板表达出来的蛋白被称为重组蛋白。
体内蛋白表达
传统蛋白表达纯化方式包括重组载体转染细胞，细胞培养以及转录翻译目的蛋白。通常情况下，会先裂解细胞提取蛋白，并对提取的蛋白进行纯化。原核细胞和真核细胞的体内蛋白表达系统已被广泛应用，系统的选择取决于表达蛋白的种类，功能活性和预期收益等。
具有易于培养，增长快速和产量高等优点。然而，多域（multi-domain）真核蛋白在细菌内的表达往往是不成功的，因为细胞无法满足翻译后修饰或分子折叠的需求。同时，许多表达的蛋白很容易形成不溶性的包涵体——如果没有合适的变性剂和复杂的复性程序很难恢复蛋白的天然构型。
哺乳动物体内表达系统虽然会产生活性蛋白，但也有着产量低，生产成本高以及细胞培养时间长等缺点。此外，在体内的表达系统不利于高通量（high throughput protein）蛋白合成或对宿主细胞有毒性的蛋白表达。
体外细胞表达（无细胞）
无细胞蛋白表达是采用全细胞翻译兼容提取物（translation-compatible extracts of whole cells）在体外合成蛋白质。原则上，全细胞提取物中含有所有的用于转录，翻译及翻译后修饰的大分子组件。这些组件包括RNA聚合酶，调控因子，转录因子，核糖体和tRNA。
在添加辅助因子，核苷酸和特定的基因模板的情况下，几小时内就可以合成目的蛋白。
虽然这种表达方式无法应用到规模化生产中，但无细胞蛋白表达系统与传统的体内表达系统相比，仍具有很多优势：无细胞表达系统可以使重组蛋白快速合成，免除细胞培养的麻烦；无细胞系统可以使用修饰的氨基酸标签，以及表达会因蛋白酶而快速降解的蛋白。而且通过体外表达的方法，能够同时表达多种不同的蛋白。（例如，通过从许多不同的重组DNA模板中进行一个小规模表达来检测蛋白突变）
化学合成的蛋白被应用于标记非天然氨基酸（proteins labeled with unnatural amino acids）,在特定位点标记蛋白或表达对生物系统有毒性的蛋白。化学合成法能够生产出高纯度的蛋白，但这种方法只适用于小分子蛋白质和多肽。化学合成法合成的蛋白产量非常低，且价格昂贵。
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