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【求助】细胞爬片免疫荧光
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这个帖子发布于5年零302天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
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向各位老师求助：各位老师，我目前在做免疫荧光，用的是santa cruz公司的一抗二抗，一抗是兔源，做的是Actin和定位于核的ARNT的荧光，其中Actin是用来做对照的，细胞爬片，干预之后结束培养，用冷丙酮-20℃固定10分钟，室温风干，保存于-20℃冰箱，荧光步骤如下：1.0.5%tix-100 透膜 10min，PBS洗 3minx3次2.5%牛血清白蛋白封闭20min，倾去3.PBS稀释的一抗（稀释比均为1:100 santa cruz，说明书上建议的是1:50-500）37度孵育1H，PBS洗，5minx3次4.PBS稀释的荧光（FITC标记）二抗（稀释比为1:100，说明书上建议的是1:100-400）37度孵育45min，PBS洗 3minx3次5.甘油封片，拍照。同时也用冰冻组织切片作为对照，结果非常悲剧的没有荧光，我也不知道是怎么回事，荧光显微镜的曝光已经调到500，只能看到细胞和组织的形态，都是褐黄色，一点荧光都没有，请教下是什么原因，我是觉得肯定是有哪些步骤出现了重大的错误才导致完全没有荧光，但是现在不知道问题出在哪里，请大家帮帮我！另：荧光显微镜是病理科的，一般不让别人用，都是病理科的人帮我们看，我们就在边上电脑上看！
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yuqianyuqian 向各位老师求助：各位老师，我目前在做免疫荧光，用的是santa cruz公司的一抗二抗，一抗是兔源，做的是Actin和定位于核的ARNT的荧光，其中Actin是用来做对照的，细胞爬片，干预之后结束培养，用冷丙酮-20℃固定10分钟，室温风干，保存于-20℃冰箱，荧光步骤如下：1.0.5%tix-100 透膜 10min，PBS洗 3minx3次2.5%牛血清白蛋白封闭20min，倾去3.PBS稀释的一抗（稀释比均为1:100 santa cruz，说明书上建议的是1:50-500）37度孵育1H，PBS洗，5minx3次4.PBS稀释的荧光（FITC标记）二抗（稀释比为1:100，说明书上建议的是1:100-400）37度孵育45min，PBS洗 3minx3次5.甘油封片，拍照。同时也用冰冻组织切片作为对照，结果非常悲剧的没有荧光，我也不知道是怎么回事，荧光显微镜的曝光已经调到500，只能看到细胞和组织的形态，都是褐黄色，一点荧光都没有，请教下是什么原因，我是觉得肯定是有哪些步骤出现了重大的错误才导致完全没有荧光，但是现在不知道问题出在哪里，请大家帮帮我！另：荧光显微镜是病理科的，一般不让别人用，都是病理科的人帮我们看，我们就在边上电脑上看！第一次做石蜡切片的免疫荧光，给大家分享一下我的步骤：1. 脱蜡、水化。---PBS洗两次各<font style="color:#分钟。-----<font style="color:#%H2O2（直接在病房拿的），室温封闭<font style="color:#分钟，PBS洗<font style="color:#次。---柠檬酸抗原修复。---PBS冲洗3次2. 山羊血清封闭30分钟，室温，买的即用型。3. PBS冲洗3次/5min。4. 加一抗（BSA稀释的，Abcam抗体，1:50）5. 4度过夜。6. PBS冲洗3次/5min。7. 加荧光二抗（BSA稀释，bio的 1:100），室温避光1小时。8. PBS冲洗，3次/5min。9. DAPI染色。10. 甘油封片，观察荧光。
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希望大家帮帮忙，急需求助！！！
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不要直接做免疫荧光，先做免疫组化确定是否阳性，同时也可以摸索一抗的浓度
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关于丁香园低糖培养基的配制 免疫荧光(配制,免疫荧光,培养基,血清) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 低糖培养基的配制 免疫荧光(配制,免疫荧光,培养基,血清)
摘要: [低糖培养基的配制 免疫荧光(配制,免疫荧光,培养基,血清)] 1用高糖和低糖DMEM只能配制大于7 5mmol L的，低于此浓度怎么配制？2如果培养基中需加血清，糖浓度指最终浓度吗?必须是最终浓度吗？3做细胞的免疫荧光可以用96孔板直接操作吗？而不用6孔板内放盖玻片或细胞爬片，否则二者哪个更好，有什么区别。
刚开始养心肌细胞，谢谢 关键词:[配制 免疫荧光 培养基 血清 养心 肌细胞 盖玻片]……
1用高糖和低糖DMEM只能配制大于7.5mmol/L的，低于此浓度怎么配制？2如果培养基中需加血清，糖浓度指最终浓度吗?必须是最终浓度吗？3做细胞的免疫荧光可以用96孔板直接操作吗？而不用6孔板内放盖玻片或细胞爬片，否则二者哪个更好，有什么区别。
刚开始养心肌细胞，谢谢
回复有谁可以指点一下，等待回复我们在实际操作中使用的培养基是血清另加的，而且浓度较低，一般是在
2%--10%，所以就不用考虑因加血清引起的糖浓度的变化。如果做免疫荧光，是要用正置的荧光显微镜来观察结果的，96孔板是不行的，没法看正置显微镜。所以一定要爬片。爬片一般就是在六孔板内放盖玻片的。如果做荧光转染，可以用96孔板，看活细胞，用倒置荧光显微镜。回复如果用，做间接免疫荧光没有必要做细胞爬片。要得到好的图片，必须将盖玻片处理好，这是比较麻烦的。我在96孔板做过间接免疫染色，是FITC标记的，比爬片细胞方便多了，而且结果也不错！不过如果你要做confocal，就必须爬片了。
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上海延慕：细胞免疫荧光步骤
来源:生物谷
浏览人数: 1491
提供：上海延慕 &仅供参考！
标签： 细胞 免疫荧光
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
试剂、试剂盒
多聚甲醛 & &70%甲醇 & 丙酮 & &PBS & &Triton & BSA & DAPI染液 & DABCO & &Tris & 甘油
仪器、耗材
细胞爬片免疫荧光实验步骤
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min&4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。&
基本实验步骤：
（1） 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（2） 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3&5 min.
（3） 通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3&5 min.
（4） 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.
（5） 一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min.
（6） 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
（7） 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
（一）细胞准备
用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
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