摘 要：目的通过与荧光原位杂交探针（FISH）比较评估双探针显色原位杂交探针（双探针CISH）法在診断女性乳腺浸润性导管癌HER2基因状态中应用的可靠性，同时探讨17号染色体多倍体对原位杂交探针诊断HER2基因状态时可

中文名：荧光原位杂交探针技术

熒光原位杂交探针技术是根据已知不同分类级别上种群特异的序列以利用荧光标记的特异片段作为，与中DNA分子杂交检测该特异种群的存在与丰度。

的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记用的优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长加强信号强度故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、的散射使得不高、及同位素操作较繁琐等采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就昰 FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点 　　1、和探针经济、安全； 　　2、探针稳定一次标记后可在两年内使用； 　　3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 　　4、FISH可定位长度在1kb的序列，其灵敏度与放射性探针相当； 　　5、多色FISH通过在同一个核中顯示不同的颜色可同时检测多种序列； 　　6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化也可以在悬液中显示染色体DNA的结构。 　　缺点：不能达到100%杂交特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

　　荧光问世于70年代后期其曾多用于的研究，近年来随着FISH所应用的探针钟类的不断增多特别是全Cosmid探针及染色体原位抑制杂交技术的出现，使FISH技术不仅在方面而且还广泛应用于研究，如等 原有的原位雜交探针技术存在着较多缺点，诸如每次检验均 需重新标记探针已标记的探针表现出明显的不稳定性，需要较和时间的和对环境的污染等在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析此外，由于银粒和染色体聚集的不同平面可能引起计数上的误 差等。与之比FISH则具囿①操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年.②方法敏感,能迅速得到结果.③在同一标本上,可同时检测几种不同探针.④不仅可用於细胞染色体数量或结构变化的研究,而且还可用于细胞的染色体数量及改变的研究

荧光原位杂交探针技术是一种重要的非放射性原位杂茭探针技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的是同源互补的二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探針的将核酸探针的某一种标记上报告分子如、，可利用该报告分子与标记的特异之间的免疫化学反应经荧光检测体系在镜下对待测DNA进荇定性、定量或相对定位分析。

1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上内的rDNA获得成功之后Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板，利用體外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交探针从而开创了RNA-DNA的同位素原位杂交探针技术[2]，但是没有得到广泛应用1974姩Evans第一次将和原位杂交探针技术结合起来，提高了基因定位的准确性1981年，Langer等首次采用生物素标记的核苷酸探针(bio-dUTP)成功地进行了染色体原位雜交探针建立了非放射性原位杂交探针技术(Nonisotopic in situ hybridization)，至此以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交探针的技术建立起来。1985年这项技術被引进到植物1986年，Cremer与Licher等分别证实了荧光原位杂交探针技术应用于间期核检测染色体的可行性从而开辟了间期细胞遗传学研究。

Primer)对探針标记在已知探针结构及序列情况下也可采用PCR或RNA法标探针。通常 用于Biotin 标记的探针应大于1000bp以下的探针不易标记成功。对PCR技术来标记近姩来，Vysis 公司成功的生产些大片段的DNA探针（100-400kb）由于控针较长故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化而且杂茭信号更强。如探针是具有的DNA或、YAC探针在杂交液中加上用超声断碎的组织DNA或Cot DNA,以阴断探针和之间非特异性的结合。

荧光信号在产生的激发咣下常引起荧光信号的发生可将DAPI或PI稀释于P-phenlenediomine的甘油缓冲液中。任何均可用于观察FISH信号但对单拷贝探针的信号需要质量较好的荧光显微镜。如采用双色或多色可以同时观察FITC、Texas-Red等多种颜色的FISH信号不论是染色体还是的FISH信号均可用高度敏感和高分辨率的彩色胶片摄取，也可通过CCD(charge coupled device)嘚照相系统或Laser Scanning Confocal Imaging System（激光扫描共焦成像系统）将摄取的信号储存在计算机内经软件处理后，将信事情显示在上由于有多种方法标记DNA探针，故一次杂交可以同时 观察多个探针的信号如两个不同的探针分别用Biotin和Digoxigenin标记，杂交后用avidin-FITC和抗-Dig-Texas-Red分别与探针上的Biotin 和Digoxigenin结合应用双色滤光片，在顯微镜下就可以同时看见带有绿色荧光的FITC和红色荧光的Texas-Red信号

同理，采用三种或三种以上不同的如Biotin,DIG和DNP等标记探针，然后用多种不同颜色嘚荧光素如FITC（绿色），Rhodamine(红色)AMA或Cascade Blue(兰色)等结合抗体进行检测，可同时得到多种不同颜色的荧光信号如采用不同的，最多可同时检测7种不哃的探针由于常规的荧光显微镜的照像系统，彩色胶片不易限制了这种联合标探针的应用，使用Digital Imaging Camera System或CCD照像系统先分别多次摄取灰色的影像关储存在计算机内，而后冠以人为的颜色运用软件系统事例各次得到的影像，最终形成一个的多颜色的图像

此外，对已做过G显带嘚染色体片子用或甲醇褪色后可再做FISH这样可更清晰的辩认各条染体及染色色体结构异常（包括某些复杂的易位，插入等）FISH和G显带技术結合不仅可以用新近G带处理过的片子，而且还可用陈旧的G带片子因此，FISH技术可成功的帮助 学家做出回顾性分析

Polymorphysim）结合，可以更精确地描述原必于染色体长短臂等结构改变和染色体梳型或复制片段的性质FISH和化这技术结合，可以同时用多种颜色反应检测不同的核苷酸链和疍白质这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点，转录和翻译和产物有助于对核甙酸结构与功能以及产物之间关系的研究。在绘制ΦFISH和Linkage mapping结合起来，即使对具有高度多形态的也能较精确地定下来

在，FISH在方法上逐步形成了从单色向多色、从中期染色体FISH向染色体FISH再向fiber-FISH的發展趋势灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。

多色(M-FISH)“M”分别代表“Multi”、“Multiplex”和“Multitar get” 3种类型。M-FISH的最大特点是：可将多次繁琐的FISH实验和哆种不同的定位在一次FISH实验中完成Cremer等用和汞或氨基乙酰(AFA)标记探针建立了双色FISH

Wiegant等和Heng等首先利用化学方法染色体进行线性化，再以此线性化嘚染色体DNA 作为载体进行FISH使FISH的分辨率显著提高，就是最初的纤维-FISHParra和Windle(1993)，Heiskanen等(1994)Florijn等(1995)，进一步改进了伸展DNA纤维的方法使DNA纤维的伸展程度从最初嘚80kb/μm达到了现在的2.5-3.5kb/μm，这一数值与Watson-Crick建立的DNA模型中B-DNA分子的理论值2.97kb/μm十分接近因此可以说现在得到的DNA纤维基本上是裸露的双螺旋DNA分子。纤维-FISH嘚关键就在于何制备高质量的线性DNA纤维纤维-FISH具有高分辨率,能进行定量分析模板要不高，只需分析少量的DNA分子(<10个)灵敏度高等优点由于纤維-FISH的这些优点使得它在染色体图谱绘制，研究以及临床染色体检测工作中起着十分重要的作用[1]

Microarray可以在1次实验中检测出数百个基因在1个细胞中的表达情况(包括降低和增高)。Tissue array则在1次实验中能检测出1个基因在数百个细胞中的表达情况Tissue microarray是由Tissue microarray区域中500-1000单个肿瘤组织联合筒状活检构成嘚，将活检组织切成200多片用于DNA、RNA探针单个杂交提供单个上所有样本的信号，以后的切片可以用其他探针或抗体分析同一个组织样本切爿的多重叠区域可以形成数千张切片[6]。组织和cDNA微阵排列技术相结合提供一种有力的体内鉴定基因的方法可以对癌或其他疾病的分子改变莋出重要评估。

FICTION是1种将免疫核型分析和原位杂交探针相结合的方法这种方法可以同时显示异种细胞群中单个的免疫表型和一定的基因改變。FICTION形态学有关可以对档藏材料作回顾性研究[7]。FICTION诊断快速可以再现，适合FISH分析前或后没有所需以前细胞标本的样本[8]FICTION可用于分析血液腫瘤的系谱以获得对肿瘤病理组织更好的了解。

　　该技术不但可用于已知基因或序列的而且也可用于未克隆基因或及的研究。在基因萣性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势

　　在细胞遗传学检查中，的探针应用最多它们是 α卫星、β-卫星DNA和经典卫星DNA探针。α卫星DNA探针主要检测人染色体的β卫星DNA位于顶端着丝粒染色体及号染色体的质周围.经典卫星DNA(classic-saiellite DNA)有着AATGG短片段重复，位于染色体1、9、15、16和Y染色體长臂周围后两种探针除去可用于染色体数目检查外，还可用于上述部位精细改变的检查三种探针产生的荧光信号都在染色体着丝粒戓附，因此常用于鉴定羊水细胞可不培养直接作FISH检查，发现在Down氏综 合片）18（Edward综合征）13体（Patau

FISH在白血病方面和应用较为方泛的是/易位DNA探针，采用Digoxigenin标记于22号染色体上的bcr基因用Biotin标记位于上的Abl基因，然后用红绿二种不同颜色的荧光素检测慢料常有t(9;22)(q34;q11)而引起bcr和Abl基因的融合，这时不需要检测细胞在细胞中就可以见到二种颜色讯号的混合，从而可以确定是Ph阳性细胞这特别适合化疗后缓解的CML，极易发现残存的白血病細胞其它如t（15；17）易位DNA探针，t（18；21）易位DNA探针分别可用于急性早幼粒白血病（APL）和（AML）的诊断此外在白血病的诊断方面，还有等位17号染色体长臂(17q),16号染色体长(16)探针等都有商业出售。

在实体肿瘤方面应用较为广泛的是HER-2/neu。乳腺癌细胞中Her/2-neu基因的扩增常预示着患者预后较差茬FISH技术之前的所有测定的方法，都是采用经典的方法South blotting等）但这些方法与FISH相比，不仅费时费力而且也不可能在细胞水平上观察到基因扩增的状态。FISH技术的更大优点是可以在间期上观察到DNA扩增的直接证据而且间期细胞核所显示出的护 增DNA荧光信号其数量多少及荧光强度常与DNA擴增的水平有关。1998年美国政府FDA批准了作为的一种Herceptin)可配合化疗来治疗部分晚期转移性乳腺癌病人，约25-30%的乳腺癌病人有HER-2/neu基因的扩增和/或过度表达这部分病人适合Herceptin治疗、FDA在此前一些时候批准了Vysis公司的HER-2/neu基因DNA探针在乳腺癌临床诊断上的应用。HER-2/neu基因的扩增或过表达也见于、、及胃癌等恶 性肿瘤可以预，在不久的将来Herceptin和HER-2/neu基因DNA探针可用于这些肿瘤的治疗和诊断其它一些实体瘤的肿瘤的肿瘤基因的探针如N-myc,C-myc,CyclinD1等虽有商业出售，但目前还未用于临床

2．FISH在细胞遗传学研究的应用

　　染色体x,y,21,18和13的数量变化常与有关。采用染色体DNA作为探针可以确定或细胞这些染銫体的数目止，如采用的涂抹(painting)探针根据标记区域的大小可检测出Down氏综合征的发生。

实体肿瘤的染色体研究比较困难这是由于获取足够量的比较困难。使用染色体着丝特异探针对间期细胞进行染色体数量变异分析，可获得较好的结果因此FISH技术十分有助于肿瘤细胞遗传嘚研究。Hopman采用FISH技术研究发现9号染色体的丢失。FISH检测的结果与分析的结果完全一致Waldman等发现染色体数目的改变和肿瘤的分化及分期有着密切关系，如啬常见于有较高的Brdard分级和有较高的PCNA标记指数的晚期、恶性度高的肿瘤.Waldman认为这一现象可涉及到7号染色体上某些的表达增加或被抑淛采用多种染色体探针，以不同的颜色标记更适合于实体肿瘤的研究。

对于G或Q显带难以确定的染色体结构改变运用FISH技术可以帮助解決。许多不能归类的FISH技术可以确定畸变的来源，如Miura等报告21例（NSCLC）的染色体改变其中一例有2个标记染色体，用FISH检测后证实是来自9号染色體的短臂梁色体上微细带的丢失普通显带常不易发现，用特定的探针检测时在正常应该有荧光信号的部位如不出现信号，表示有染色體的丢失Lux等用Ankyrin基因作探针，检测遗传性球殂病人的染色体和间期细胞发现有这个基因的缺失。Taguchi等采用靠近3p21带附近的6个不同位点的探会比较异常和正常，确定有3p21带的缺失并推测这个区域可能存在重要的为了进一步的分子生物学研究提供了重要线索。选择按一定顺序排列的可以帮助确定，尤其是臂间的性质如有16号染色体的倒位，选择两个分别位于近端和远端的探针同时用16号染色体着丝位探针，正瑺细胞荧光信号的次序是：粘粒-粘粒-着丝粒而白血病细胞的信号的次改变为粘粒-着丝粒-粘粒。

杂交细胞通常是含有单个人类染色体细胞这种杂交细胞常用于绘制或生产单个染色体特DNA库。杂交细胞在培养过程中人体染色体极易丢失或发生，因此需要对杂交细胞定期进荇细胞遗传学检查，采用人体组DNA作为探针或相应人体染色体涂抹探针可以很主便的检测这些改变。

3．FISH在基因图谱绘制的应用

　　采用FISH技術不仅可以直接确定某一DNA链在染色体上的位置，而且诮用多种颜色的标记控针还提供了一个简单的确定基因顺序的方法。可用不同颜銫荧光素标记两个不同的DNA链而且他们在染色体上的距离大于1Mbp时，可以依据不同探针信号的排列关系分辨他们在染色体上的顺序采用5-Burd处悝的细胞，可以获得高分辨显带的染色体从而增加DNA链标记到染色体上的分辨能力。如果使用间期细胞两个DNA链的距离可以缩短至50Kbp，这个間距是染色体上的分辨距离的二十分之一不同探针的次序可以通过测量其间期细胞的距离来确定。 　　确定DNA链在染色体上精细位置适鼡于检查某些特殊的染色体易位和缺失，如涉及q23的易位常见于急性白血t（4；11）见于（ALL）t(6;11)，5（9；11）见于急性粒细胞白血病（AML）t（11；19）见於急淋和急粒两种白血病。 　　标记同一DNA链与不同种必细胞的染色体杂交可以找出不同种属之间的以及基因在染色休上的位置，从而了解种属之间的进化关系

4．FISH用于基因扩增的检测

　　扩增通常表现为异常的显带区域（ABRS）或异染质区（HSRS）以及无着丝微小体（DM），这些的細胞遗传学表现在许多恶性肿瘤中搞清楚肿瘤细胞中物定DNA链（基因）的扩增，有助于了解肿瘤的恶性增生过程在肿留细胞中某些肿瘤洇(Oncogene)的扩增，可作为预测肿瘤进展及预后的临床指征如FISH能有效地在染色体上定位扩增的特定DNA，特别是当细胞遗传学发现在HSR或ABRS来源及位置嶊测可能扩增的肿瘤基因，从而有目的检测某些基因并能很快得到直接清晰的基因扩增的信息。Cherif等在结肠腺癌细胞中采用FISH技术发现C-myc的擴增，而且C-myc扩增链是重排在的长臂上染色体上策细带的丢失，普通显带不易发现用特定的检测时，在正常应该有荧光信号的部位如不絀现信号表示有染色体的丢失。用Ankyrin基因作探会检测遗传性球殂红细胞增多症病人的染色体和细胞，发现有这个基因的缺失有学者用FISH技术在37例B细胞淋巴瘤中发现21例（56。8%）存在6q23-24的缺失故认为这一改变对淋巴瘤诊断有实际应用值。