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应用母血中胎儿游离DNA进行无创产前诊断的研究进展
作者：梁珥宏，任晨春， 王文靖，张海霞&单位：天津市中心妇产科医院检验科&来源：继续医学教育&编者：
应用母血中胎儿游离DNA进行无创产前诊断的研究进展&&&&& 目前孕期对胎儿染色体进行检测的方法包括有创性和无创性两大类，有创性检查主要是通过早、中、晚孕期采集胎儿标本经过体外培养对染色体进行核型分析，是诊断染色体异常的金标准，但是培养周期长，有培养失败的可能，且有发生流产、死胎、感染等风险[l]，部分孕妇存在心理负担；无创性检查主要包括产前筛查和近些年发展起来的胎儿染色体非整倍体无创基因检测(non―invasive fetal trisomy，NIFTY)[2]，前者通过对母亲体内血清标志物的分析间接对胎儿进行风险评估，而后者是通过对母血中胎儿游离DNA(cell free fetal DNA，cffDNA)进行直接分析，对胎儿染色体病诊断起到辅助作用，其流程简便，且无流产、感染等风险，易于为孕妇接受，是产前诊断未来的发展方向。&1 cffDNA的来源&&&& 1997年Dennis Lo[3]发现母体血浆中存在胎儿游离DNA，从妊娠第5周开始即可通过定量PCR的方法检测，随着孕周的增加母体中游离DNA浓度相应增加[4-5]，分娩后2小时即检测不到cffDNA，其半衰期为4―30min[5]，因此本次妊娠不会受到既往妊娠的影响。&&& 对于cffDNA的来源，一般认为有以下3种可能：(1)进入母体循环的胎儿细胞。胎儿细胞进入母体循环后发生凋亡，从而释放出cffDNA[6]。(2)胎盘滋养层细胞凋亡后释放DNA至母体循环中，有研究发现在胎盘循环建立后80％ 的孕妇血浆中可以检测到胎儿DNA[7] 。(3)胎儿DNA直接跨膜转运。羊水中存在大量胎儿细胞凋亡后释放的DNA，其浓度远远高于母体循环中胎儿DNA的浓度，这种浓度梯度促使DNA分子通过胎盘和膜发生跨膜转运。&2 通过c竹DNA进行胎儿非整倍体检测&&&& 研究发现，母体血浆中的胎儿游离DNA片段大小在193～313 bp之间，而母体的DNA片段多在1 000 bp左右[8]。有学者利用琼脂糖凝胶电泳收集母血中胎儿DNA，但是效率低下且易受母体DNA污染；也有学者针对母胎之间甲基化程度不同位点、胎儿特有的SNP位点进行量化分析，从而对胎儿非整倍体进行诊断。后来Lo等通过对cffDNA测序绘制出胎儿全基因组图谱，表明cffDNA涵盖了胎儿的全部基因组信息[9]。&&& 2008年，有学者应用大规模并行基因组测序技术(massively parallel genomic sequencing，MPGS)检测cffDNA[10]。MPGS具有所需样本量较少、高通量、检出率高、无创性等优点。母体血浆样品中存在母源性和胎源性DNA分子，通常母体均为正常二倍体，所以母血浆样品中DNA分子的微小改变只能是由胎儿非整倍体导致。应用MPGS对母体血浆样本中cffDNA进行测序检测，通过对cffDNA微量变化的捕捉，来判断2l号染色体的cffDNA是否增加，从而诊断胎儿是否为21 三体[11]。白2011年投入临床，全世界已完成超过3万例的检测，其敏感性和特异性均超过99％[12]，是一项比母体血清学筛查准确许多而接近于诊断的产前非整倍体检测技术。研究表明，如果早孕期联合筛查结果为高风险，通过cffDNA检测结果为阳性者，胎儿为21 三体的几率为7／8[13]。&&& 当该方法应用于检测18 三体和13 三体时，敏感性却大大降低 ，原因是13号、18号染色体靶位点的GC含量分别为38.5％和39.8％ ，而21号染色体的GC含量是40.9％ ，高于或低于41％的GC含量会影响测序的覆盖率，进而影响其准确性[15-16]。&3 通过cffDNA进行单基因疾病检测&&&& 由于母体血浆中母源DNA远远多于cffDNA，很难摆脱母源DNA的影响，所以目前主要诊断对父系等位基因进行检测，如RhD阳性胎儿、父系致病等位基因、Y染色体测序等[171~有学者应用MPGS对45 392个SNPs位点进行检测，得到大于90％的SNP位点信息，通过相对变异剂量(relative mutation dosage，RMD)方法获得胎儿基因型信息 ，此法已应用于β一地中海贫血、镰状细胞性贫血和血友病的非侵入性检测[19-20]。&&& 总之，无创伤性产前诊断在临床上有着广泛的应用前景，高通量、自动化、低成本、高准确性的MPGS技术显著&&& 促进了无创产前诊断的发展，对cffDNA的理化性质，富集提取及其实验方法的研究必将进一步推动无创伤性产前诊断在临床的应用。&参考文献[1] 边旭明，戚庆炜．染色体异常产前筛查和产前诊断工作任重而道远[J]．中国实用妇科与产科杂志，201 0，26(1 2)：889-890．[2] 吴清明，周瑾．出生缺陷产前筛查及产前诊断研究进展[J]．中国优生与遗传杂志，)：129―131．[3] Lo YM，Corbetta N，Chamberlain PF，et al．Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J]．Lancet，76)：485-487．[4] Devaney SA，Palomaki GE，Scott JA，et al．Noninvasive fetal sex determination using cell-free fetal DNA：a systematic review and meta―analysis[J]．J Am Med Assoc．，)：627―636．[5] Lo YM，Zhang J，Leung TN，et al．Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma[J]．Am J Hum Genet．，)：218―224．[6]Chim SSC，Tong YK，Chiu R WK，et a1．Detection of the placental epigenetic signature of the m aspin gene in maternal plasma[J]．Proc Nat Acad Sci USA，(41)：1．[7]Alberry MS，Maddocks DG，Jones M，et al．Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies：confirmation that the origin is the trophoblast[J]．Prenat Diagn．，)：41 5―41 8．[8]Chan KC，Zhang J，Hui AB，et al．Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma[J]．Clin Chem．，)：88―92．[9]Lo YM，Chart KC，Sun H，et al．Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome―wide genetic and mutational profile of the fetus[J]．Sci Trans Med．，201 0，2(61)：61-91．[10]Chiu RW ，Chan KC，Gao Y，et al．Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma[J]．Proc Natl Acad Sci USA，(51 1：．[11]Sehnert AJ，Rhees B， Com stock D，et al．Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell― free fetal DNA from maternal blood[J]．Clin Chem．，201 1，57(7)：．[12]Chiu RW ，Lo YM． Noninvasion prenatal diagnosis empowered by high―throughput sequencing[J]．Prenat Diagn．，201 2，32(4)：401―406．[13]Palomaki GE，Deciu C ，Kloza EM ，et al．DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 1 8 and trisomy 1 3 as well as Down syndrome：arl international collaborative study[J]．Genet Med．，)：296―305．[14]Chen EZ，Chiu RW ，Sun H，et al．Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 1 8 and trisomy 1 3 by maternal plasma DNA sequencing[J]．PLoS One，2011．，6(7)：e21791．[15]Jiang F，Ren J，Chen F，et al．Noninvasive Fetal Trisomy(NlFTY)test：an advanced noninvasive prenatal diagnodsis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies[J]．BMC Med Genomics，201 2，5(1)：57．[16]Fan HC，Quake SR．Sensitivity of noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy 什0m maternal plasma using shotgun sequencing is limited only by counting statistics[J]．PLoS One，)：e10439．[1 7] Fan HC，Gu W，Wang J，et al．Non―invasive prenatal measurement of the fetal genome[J]．Nature，2012，(487)：320―324．[1 8] Lam KW，Jiang P，Liao GJ，et al Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by targeted massively parallel sequencing of maternal plasma：application to[beta]一thalassemia[J]．Clin Chem．，201 2，58(1O)：．[1 9] Barrett AN，McDonnell TC，Chan KC，et al．Digital PCR analysis of maternal plasma for noninvasive detection of sickle cell anemia[J]．Clin Chem．，201 2，58(6)：1 026―1032．[20] Tsui NB，Kadir RA，Chan KC，et al．Noninvasive prenatal diagnosis of hemophilia by microfluidics digital PCR analysis of maternal plasmaDNA[J]．Blood，)：&
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无创dna游离dna不够怎么回事
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孕周与胎儿游离DNA含量有关，孕周太小游离DNA会少。无创DNA检测最佳孕周是12-26周。还有孕妇本人过胖或者过瘦也是会有影响的。优.孕.亲.仁.答
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香港近年来，利用无创DNA产前检测筛查胎儿的染色体非整体，已得到广泛的运用。并有望从高危孕妇扩展到一般风险的孕妇。我们都知道内地的上海与深圳也是有开设DNA产前检测技术，但经历了不断的波折，内地与香港的无创DNA产前检测技术之间的差距，也在不断的扩展之中···
染色体疾病逐渐成为新生儿出生缺陷中较为常见的一类疾病，据统计，约160例新生儿中就有一例染色体疾病患儿。无创DNA产前检测主要检测：21-三体综合征（唐氏综合症）、18-三体综合征（爱德华式综合征）、13-三体综合征（帕陶氏三体综合征）。当然，这是在内地。
香港无创DNA产前检测除了检测以上三项外，还能检测X单体综合征、三倍体综合征等。如今，香港的无创DNA产前检测更是已经上升到检测23项染色体异常疾病。当然香港从未限制过DNA鉴定的发展，这也是香港无创DNA产前检测如此迅速发展的主要原因。
同时，说到唐氏综合症。大家的记忆里：唐氏综合症是和高龄产妇挂钩的。年轻孕妇可能很少或是根本不曾注意这个问题。
可惜，日前有医疗检测数据显示：唐氏综合症母亲已经出现低龄化趋势。医学上将35岁及以上年龄怀孕的孕妇称之为：高龄产妇。可是如今已经出现多起23岁以下的孕妇生下唐氏儿的情况，因此美亚预约网专家提醒广大孕妇：不要因为不是高龄产妇就放松警惕。只要有生育，宝宝就有患畸形的危险。
因为无创DNA产前检测主要是筛查染色体异常的疾病。而染色体异常疾病的发生具有偶然、随机性。事先并无征兆，没有家族史。发病率随着孕妇年龄增高而升高（并不代表低龄孕妇的宝宝就不会发生染色体异常疾病）。所以每个孕妇其实都有生育染色体疾病患儿的风险，建议所有孕妇都及早进行产前胎儿染色体疾病筛查。
无创DNA产前检测通过抽取母体静脉血，提取其中游离的胎儿DNA片段，利用最新一代的高通量测序技术，结合生物信息分析，得出胎儿患染色体非整体的风险率。
目前香港无创DNA产前检测可准确检测以下胎儿染色体疾病：21-三体综合征（唐氏综合症）、18-三体综合征（爱德华式综合征）、13-三体综合征（帕陶氏三体综合征）X单体综合征、三倍体综合征等23项染色体异常疾病。
香港无创DNA产前检测优势：
孕早期检测：B超确认妊娠九周或以上即可进行检测。
准确率高：利用DNA基因技术，准确率99.9%以上
检测周期短：抽血后2周内出检测报告。
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以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。唐筛新方法：无创胎儿DNA检测
●无创胎儿DNA检测是近年来在临床开展的最先进的产前诊断技术，通过检测母体血液中的DNA来评估胎儿出现唐氏综合征的风险
●优点：准确率达99%以上，比传统唐氏筛查手段高;缺点：价格贵，每次检查费用要3000多元
今年36岁的赵女士怀孕13周之后接受唐氏综合征筛查，结果显示“高风险”。面对医生“穿绒毛进一步诊断”的建议，赵女士陷入了两难：做吧，绒毛穿刺是侵入性检查，有流产风险;不做吧，万一真生出个“唐宝宝”可咋办?
不少女性，尤其是高龄生育的女性，在怀孕过程中都有过与赵女士类似的纠结经历。记者最近在采访中了解到，目前开展了“无创胎儿DNA检测”的非整倍体产前筛查项目，准确率能达到99%以上，关键还是“无创”的。但是，这个检查也有缺点，就是贵——3000多元的检查费几乎是整个孕期普通检查费用的总和。那么，这项新技术的高科技含量到底在哪里?花高价做这个检查到底值不值?面对各种唐氏检查“准妈妈”该如何选择呢?记者带着这些问题采访了有关专家。
原理：检测妈妈血液中的胎儿DNA
37岁高龄妊娠的罗女士也曾有过类似经历。她回忆说，当年通过血液生化和超声NT做唐氏筛查，两个结果都是“低风险”。然而，筛查报告中偏偏有这样一句话：特别提醒，根据年龄显示胎儿21—三体综合征高风险。罗女士咨询了有关专家，给出的建议是最好再做个羊水穿刺。罗女士为此也是犹豫不决。后来听朋友介绍说，有一种抽血就能做的DNA检测，准确率很高，可惜当时罗女士问遍了所有医院都没有这个检测项目，最后只好跑到香港去做。
罗女士当年大费周章才能做的这项DNA检测全称为“无创胎儿DNA检测，这项技术近几年才逐渐在临床上开展，如今已相当成熟。
据了解，这项检查的做法是女性怀孕12周之后，抽取母体5毫升左右的静脉血液，从中分离出胎儿的DNA进行测序和比对，从而计算出染色体异常的风险。
无创检查Vs传统唐筛
准确率达99%，漏诊率低于1%，但价格贵
与传统的血液生化和超声NT筛查唐氏综合征相比，无创胎儿DNA检测的优势在于准确率非常高，“无创检测测的是胎儿游离在母体血液里的DNA，并使用先进的分子生物技术，结合生物信息学分析，分辨出胎儿是否患有唐氏综合征。而且整个检测环节的质量控制非常严格，例如为了避免染色体受到干扰，一线检测人员均要求为女性等。所以这项检测的准确率一般能达到99%以上，漏诊率低于1%。”
而传统的血液生化筛查唐氏综合征，只是根据孕妇的年龄、孕周、激素水平以及体重等参数进行计算得出结果，其假阳性率较高，也存在漏检的风险。此外，血液生化检查的标本还常常受运输、保存等因素的影响，每个环节都会使各种指标发生降解，影响准确性。
至于NT，对超声医生的技术要求和超声机器的配置要求均很高，国内真正获得英国胎儿医学基金会NT认证的医生并不多。检查时还取决于宝宝的位置，如果宝宝的位置不好，无法获得最佳检测平面，NT的测量就不准确了。
从国内目前开展血液生化和超声NT筛查唐氏综合征的情况来看，孕早期唐筛的检出率在80%左右，假阳性率在5%~7%左右，孕中期唐筛的检出率在55%左右，假阳性率在5%~8%。正是由于“早唐”和“中唐”假阳性率较高，所以常常让不少孕妇陷入两难，既担心生下“唐宝宝”，又怕自己其实是假阳性，但却要冒着流产的风险去做羊水穿刺。
“可以这样理解，如果说‘早唐’和‘中唐’是标清技术，那么无创胎儿DNA就是高清技术。”不过，无创胎儿DNA检测也有一个最大的缺点，就是价格贵，一次检查要花3000多元，而传统的唐筛大概只需五六百元。
如何选择：
经济许可，无创检查是首选
对于广大“准妈妈”来说，最关键的问题来了：传统唐氏筛查、无创胎儿DNA检测和羊水穿刺，到底该如何选择?
陈敏认为，如果经济许可，对于所有女性来说，在怀孕12周之后做一个无创胎儿DNA检测是最优选择。“打比方说，如果你正怀孕12周，又打算买台iPhone6，建议你先把买手机的钱用来做检查。”如果经济状况不允许，那就选择传统的唐筛项目。“虽然传统唐筛，尤其是孕中期唐筛的检出率并不令人满意，但做还是比什么检查都不做要好得多。”
问题又来了：如果已经做了传统的唐氏筛查，还需要做胎儿无创DNA检测吗?
传统唐筛显示为低危的孕妇仍然可以进行该项检测，以排除血清学筛查可能存在的漏检。如果传统唐筛显示一项或几项为高危的孕妇，则更应该先做无创DNA检测，以排除血清学筛查的假阳性，最大程度地减少羊水穿刺等有创性产前诊断给孕妇和胎儿所造成的风险和伤害。“如果DNA检测结果正常，那就可以安心养胎。如果结果还是高风险，那还是要通过羊水穿刺予以确诊，因为羊水穿刺才是产前诊断的‘金标准’，只有它的检出率能达到100%。”
值得一提的是，凡是经过无创胎儿DNA检测发现高风险的孕妇，再做羊水穿刺是免费的。
那35岁以上的高龄孕妇呢?
以往对于年龄大于35岁的孕妇，医生会建议直接进行产前诊断(如羊水穿刺等)来确诊是否怀有唐氏综合征患儿。但不代表35岁就不能做唐筛了，高龄孕妇在充分认识唐筛的检测价值之后，仍然可以做唐筛。“不过我会建议这些孕妇直接做无创DNA检测。”
还有孕妇会问：“我们夫妻都正常，家族里也没有唐氏综合征，为什么还要做唐筛?”95%左右的唐氏综合征患者父母均正常，且家族中也没有唐氏综合征患者，其发生是受精卵早期细胞分裂错误或生殖细胞(精子或卵子)分裂错误导致的。仅有5%以下的唐氏综合征的发生与父母染色体结构异常有关。“所以理论上讲，不管是否有家族史，所有怀孕的人都应该进行唐氏筛查。”
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&无创DNA检测胎儿游离DNA的原理、检查的合适孕周
无创DNA检测胎儿游离DNA的原理、检查的合适孕周
一、技术背景：基于母血浆胎儿游离DNA的发现
1、母体外周血含有的cffDNA（胎儿游离DNA：cell-free fetal DNA），几乎全部来源于胎盘滋养层胞；
2、怀孕4周可检出，8周后含量上升并稳定存在；
3、母体外周血中的cffDNA含量在5%-30%之间；
4、孕周越大cffDNA含量越高，且与母亲体重有关。
注释：无创DNA检测不分离母体血液中胎儿的游离DNA，只是看母体和胎儿一起的DNA比例是否符合正常人比例，当母体和胎儿都是正常核型时，比例符合正常人群标准。当胎儿为21三体时，21号染色体比值增高，超出正常人群标准，故无创DNA检出阳性结果。同理，当母亲为核型异常患者，比值同样高出正常人群，无创检测结果依旧是异常，是受母体干扰。
无创DNA不能检测平衡易位型21三体，嵌合体。
二、无创DNA检测假阳性的原因是什么？
无创DNA检测的是由胎儿胎盘释放在母体中的游离DNA，故在极端情况下会有胎盘和胎儿核型不同的情况，这也是无创DNA假阳性的原因之一。
无创DNA检测不分离母体血液中的胎儿游离DNA，是和母体血液一起检测，故当母体本身有染色体异常时，同样会被检出显示阳性，这也是假阳性原因之一。
三、为什么无创DNA在孕12周后做比较好？
虽然胎儿游离DNA在怀孕4周即可检出，8周后含量上升并稳定存在；但是胎儿在母体血液中游离DNA含量岁孕周增大而增大，在12周可以保证达到检测标准，早于12周检测可能出现DNA含量较低无法出具结果的情况。
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