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那里有仪器可以做成分分析的测试？
做分析检测的地方有很多。但是好的分析机构就需要甄别了，而且还可能由于行业、产品的不同，所以好的第三方检测机构还是比较笼统的，因为第三方检测机构擅长的范围也各不相同，比如你说的成分分析，英格尔分析就做得就不错。
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HPLC分析烟草化学成分及香精指纹谱图基础研究
南京理工大学 硕士学位论文 HPLC分析烟草化学成分及香精指纹谱图基础研究 姓名：周鹏 申请学位级别：硕士 专业：应用化学 指导教师：王瑛;周申范
摘要ＨＰＩ＿Ｃ分析烟草化学成分及香精指纹图黹基础研究摘要采用８０％甲醇水为萃取液，６０℃下超声萃取１０ ｍｉｎ从烟草等天然产物中提取咖啡酸。采用Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８柱，以０．１％甲酸及乙腈为流动相，梯度洗脱，流速：０．８ｍＵｍｉｎ，柱温４０℃，Ｕｖ ３３０ ｎｌｌｌ检测，内标法定量测定咖啡酸含量。蒲公英测定采用了硝基苯为内标物，标准工作曲线Ｙ＝３０．３９９Ｘ．０．１１７，Ｒ２＝０．９９９８。烟草、 咖啡、金银花、贡菊中的咖啡酸含量均采用香豆素为内标物，标准工作曲线 Ｙ＝３．５８７４Ｘ．０．０１９５，Ｒ２＝０．９９９９。方法的加标回收率为９８．４＂－－－９５．７％；测定结果的ＲＳＤ＜３．３％（ｎ＝５）。以加速溶剂萃取．微波辅助提取．低温醇析．低温干燥法从烟草中提取果胶，在１２０℃下用２ ｍｏｌ／Ｌ ＴＦＡ对烟草、烟草果胶及苹果果胶酸解２ ｈ，采用ＡＢＥＥ对酸解液７０ ℃衍生５０ ｍｉｎ。衍生化产物采用Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８柱，以Ａ：ｐＨ＝４．０５０ ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵溶液，Ｂ：乙腈／甲醇＝２／１为流动相流动相，梯度洗脱，流速：０．８ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温４５℃，ＵＶ３０７ｎｍ检测，内标法定量分析。半乳糖醛酸的标准曲线Ｙ＝６．０４３８Ｘ．０．０００９，Ｒ２＝０．９９９８，葡萄糖的标准曲线Ｙ＝６．６７１４Ｘ＋０．６８１１，Ｒ２＝０．９９９３， 甘露糖的标准曲线Ｙ＝７．５８６５Ｘ＋０．０７５６，Ｒ２＝０．９９９７，木糖的标准曲线Ｙ＝８．７２４８Ｘ＋０．１００４，Ｒ２＝Ｏ．９９９７。烟草果胶中半乳糖醛酸测定值为１５．８８％，烟草样品中测定的半乳糖醛酸含量为２０．２２ ｍｇ／ｇ，确定烟草样品中果胶含量为１２．７３％。烟 草酸解液中半乳糖醛酸及几种单糖的测定值ＲＳＤ＝Ｉ．３４，－－２．９８％，半乳糖醛酸的回收率为９８－３８％。对烟用香精香料的高效液相指纹图谱重点研究了ＨＰＬＣ分析方法稳定性，２种香 精与２种料液的日内与日间的保留时间ＲＳＤ＜Ｉ％，含量ＲＳＤ＜６％，完全满足烟用 香精香料品控技术体系研究中高效液相指纹色谱峰变化率小于１０％的要求。 本文所获得的结果为研究烟草品质与烟草化学的关系提供了基础分析方法；咖啡 酸与果胶的提取方法为烟草工业的废弃物资源化处理提供了有益的参考与借鉴；烟用 香精料液指纹图谱分析方法基础研究为产品质量控制提供了可靠的分析方法。关键词：烟草，高效液相色谱，咖啡酸，果胶，半乳糖醛酸，烟用香精料液，指纹图谱ＡｂｓｔｒａｃｔＩｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅｄ―ｐｈａｓｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）．Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ．Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ ｏｆ ｔａｒａｘａｃｕｍ，Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ０．１５－５０ ｌｘｇ／ｍＬ，Ｒ２＝０．９９９８；Ｃｏｕｍａｒｉｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ ｏｆ ａｎｏｔｈｅｒ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ０．５―１００ ｐｇ／ｍＬ，Ｒ２＝０．９９９９．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｌｅｓｓ ｔｈａｎｄｅｖｉａｔｉｏｎ（ＲＳＤ）ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｗａｓ３．３％（ｎ－５）ｆｏｒａｌｌ ｎａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｂｅｔｗｅｅｎ９５．７．９８．４％ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｓｏｌｖｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＡＳＥ）－ｍｉｃｒｏｗａｖｅａｓｓｉｓｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＭＡＥ）一ｅｔｈａｎｏｌｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｄｒｙｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｐｅｃｔｉｎ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏ．Ｕｓｅ ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（ＴＦＡ）ｓｏｌｕｔｉｏｎ―Ｐ―ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ（ＡＢＥＥ）ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ―ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｅｄ ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎｏｎｔｏｂａｃｃｏ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ．Ｄｅｐｅｎｄｉｎｇｔｈｅ ｓａｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｅｃｔｉｎ ａｎｄ ａｐｐｌｅ ｐｅｃｔｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ．Ｏｎ ｔｈｉｓ ｂａｓｉｓ，ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｃｔｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ．Ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ ｗｏｒｋａｃｉｄ，ｇｌｕｃｏｓｅ，ｍａｎｎｏｓｅ，ｘｙｌｏｓｅｓｔａｎｄａｒｄ ｍａｔｔｅｒｓｃｕｒｖｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｒｅ：Ｙ＝６．０４３８Ｘ－０．０００９，Ｒｚ＝０．９９９８；Ｙ＝６．６７１４Ｘ＋０．６８１１．Ｒ２＝Ｏ．９９９３；Ｙ＝７．５８６５Ｘ＋０．０７５６，Ｒ２＝Ｏ．９９９７；Ｙ＝８．７２４８Ｘ＋０．１００４，Ｒ２＝０．９９９７．Ｔｏｂａｃｃｏｐｅｃｔｉｎｃｏｎｔｅｎｔｅｄｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ １５．８８％，ｔｏｂａｃｃｏ ｃｏｎｔｅｎｔｅｄ ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２０．２２ ｃｏｎｔｅｎｔｅｄ ｐｅｃｔｉｎｍｇ／ｇ，ＳＯｔｏｂａｃｃｏ１２．７３％．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗａｓ １．３４―２．９８％．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃｆｏｃｕｓｅｄａｃｉｄ ｗａｓ ９８．３８％．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ ＨＰＬＣ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｆｌａｖｏｒ．Ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｏｎｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＨＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｆｏｕｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ＲＳＤ ｗｅｒｅｌｅｓｓ ｔｈａｎ １％，ｃｏｎｔｅｎｔ ＲＳＤ ｗｅｒｅ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ６％．Ｔｈｉｓｒｅｓｕｌｔｓ ｍｅｅｔｉｎｇ 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烟草在世界上的种植历史已超过１５００年，我国的烟草种植历史也有４００多年。 但是烟草化学的研究历史相对于烟草种植历史是比较短的，至今仅有１００多年，我国 从２０世纪５０年代开始了对烟草化学进行探索。烟草化学是随着当代植物化学、生物 化学、分析化学等学科的发展而发展起来的【１１，它是从研究烟草的化学成分丌始，随 着研究烟草化学成分与烟草品质的关系而深入，因吸烟与健康的研究而受到重视。 烟草化学的研究内容主要包括烟草化学成分及其与品质的关系，烟草化学成分的 变化规律及影响因素及其对人体的影响，烟草化学成分的提取与利用等问题。烟草中 化学成分众多，含量差别大，在调制过程中各种成分含量会发生变化，烟草的品质不 能由少数几个指标决定，烟草化学成分间达到一定的平衡后烟草才能具有较高的品 质。由于以上特点，使得烟草化学中化学组成与品质及特征关系的研究一直是烟草化 学研究的重点。 烟用香精香料是专供各种烟草制品加香矫味使用，使之在燃吸时产生良好烟气效 果的一种烟草制品的添加剂。烟用香精香料是卷烟生产不可缺少的原料，其配方也是 烟草工业企业的核心技术之一，香精香料及添加剂的应用同卷烟品牌的树立与发展密 切相关。但是烟用香精料液是由多种天然产物中提取的香味成分及人工合成的香料混 合而成，成分非常复杂，其质量控制一直困扰着生产企业，也是目ｌｊ｛『烟草化学研究的 另一个重点。１．１烟草化学研究现状烟草的化学成分相当复杂，据ＥＤａｂｅ［２】报道，烟叶中己被鉴定的化学成分有２５４９种，烟气中有３８７５种，其中有１１３５种为烟叶和烟气所共有，单独存在于烟叶中的有 １４１４种，烟叶和烟气中己鉴定的化合物总共有５２８９种，目前已鉴定出的种类远远不 止这些。近年来由于色谱技术及色谱光谱联用技术的迅速发展，使得烟草致香成分的 分离鉴定成为可能。气相色谱一质谱联用技术（ＧＣ．ＭＳ）现在已广泛用于烟草中挥 发性、半挥发性及中性致香成分分析。但气相色谱作为高效分离方法适用于分析易挥 发、热稳定性好、分子量较低的物质，仅能分析检测约２０％的有机物，其他７０％～ ８０％的有机物要靠ＬＣ、ＩＣ、ＬＣ．ＭＳ等检测。高效液相色谱（ＨＰＬＣ）目前主要应用 于烟草化学中烟碱、酚类、有机酸等物质的分离鉴定。１绪论硕Ｌ论义烟草中化合物的种类繁多，含量差异非常大，大多数以痕量存在，部分组成成分 与烟草组织结合紧密、分子量大，它们分离分析方法一直是研究的难点，国内外的科 研工作者做了大量的研究工作，其中色谱分析法是近年来发展最快、研究最多的分析 方法。 烟草中存在大量的挥发、半挥发性物质，这些化合物对烟草香味及品质有着重要 作用，气相色谱法对于这类物质的分析有着得天独厚的优势，从上世纪五十年代气相 色谱发展的初期就被应用于烟草组成的研究。气相色谱／质谱法分析烟草中的烃类【硒】、 亚硝胺类【７－ａｌ、挥发酸ｆ９１、咖啡因【１０１、多环芳烃【１１】、芳香胺【１ ２】等。 除挥发性成分外，烟草中还有许多非挥发性成分，这些成分对烟草品质也是非常 重要的。虽然有些非挥发性成分可以通过衍生化气相色谱法分析，但是大部分非挥发 性成分还是要用液相色谱方法进行分析。应用液相色谱法分析烟草中的亚硝胺类【１３】、 多环芳烃【１４１、有机酸【１５】、生物碱【１６１、可溶性糖【１７】、酚类化合物【１８１、游离氨基酸【１９】、 芳香胺【冽等。近年来液相色谱／质谱联用技术发展迅速，也已成功用于烟草化学研究， 例如应用液相色谱／质谱分析烟草中羧酸【２１】、亚硝胺【２２】、糖肽【２３１、茄尼醇【２４１、烟碱及 其代谢物【２５１、酚类及多酚类【２６】等。 由于烟草组分种类众多，组成十分复杂，通常的一维色谱技术很难满足烟草组分 的全组分分析，将分离机理不同的色谱分理模式联用，构建多维分析技术平台，能够 大大提高分离能力，多维色谱联用技术已逐渐应用到烟草化学分析中。Ｄａｌｌｕｇｅ等【２７】是最早应用全二维气相色谱一飞行时间质谱研究分析烟气组分的，路鑫等【２８ｌ应用全二 维气相色谱．飞行时间质谱分析了烟气中的酸性、碱性、及烃类化合物，朱书奎等【２９】 应用全二维气相色谱分析了烟草精油，李海峰等【如３１】应用全二维气相色谱分析了烟叶 中的酸性和碱性成分。１．２样品的预处理对于烟草及烟用香精香料这类复杂样品的分离分析，样品的预处理是关键，它在很大程度上直接影响到测定的成败及测定结果的准确性。选择合适的样品预处理方法 包括了分析样品的采集和制备，其中涉及到样品中欲测组分的分离及富集，对于色谱 分析它常常影响到选择性和灵敏度。样品预处理是一个既耗时又极易引入误差的步 骤，是色谱分析技术发展的重要领域，它一直是我们关注的重点问题。 根据文献报道，用于烟草及烟用香精香料的预处理方法主要有：水蒸气蒸馏法、 溶剂萃取法、同时蒸馏萃取法、项空分离、顶空共蒸馏等、固相萃取、固相微萃取和 超临界流体萃取等。２硕．Ｉ：论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图潜皋础研究１．２．１水蒸气蒸馏法 水蒸汽蒸馏是分离和精制植物提取物的便宜和重要的方法。该方法在２０世纪５０－－６０年代被广泛使用，该方法较为稳定。这种方法不仅能使挥发性物质在其沸点以下的低温蒸馏出来，而且还能和不挥发的杂质完全分离。如在卷烟烟气冷凝物测定过 程中，需要用水蒸气蒸馏法，把烟气冷凝物中的尼古丁分离出来【３ｚＪ。不过，该法需用大量的有机溶剂进行萃取，处理量较大。１．２．２溶剂萃取法 溶剂萃取法（Ｕ正）是一种常用的方法。是用来提取或提纯有机化合物的常用操 作之一。它操作简单、较为经济、提取效率高，特别适用于实验室小规模实验研究。 对固体物质的萃取，通常采用冷浸法或热浸法（索氏提取器）。由溶剂萃取法改进衍生 出了许多的新型萃取方法，例如溶剂微萃取（ＳＭＥ）、微波辅助溶剂萃取（ＭＡＳＥ）、 超声波辅助萃取（ＵＥ）等方法。 溶剂微萃取（ＳＭＥ）也称作液相微萃取（ＬＰＭＥ）是近几年来发展迅速的色谱分析样品处理技术之一。它实际上就是液相萃取，只是使用的液相溶剂的体积很小，被萃取的样品体积也比较小。与ＬＬＥ相比，ＭＬＬＥ减少了有机容积的使用量，简化了溶剂萃取过程，缩短了样品的萃取时间，提高了萃取样品后的利用率。如果应用顶空 方式采样，那么ＭＬＬＥ还可以消除样品基体的干扰１３３］。杨严明【列采用自制的微液液萃取装置对某烟用香料的成分进行萃取分析，其分析结果表明：ＭＬＬＥ法处理时间短，处理效果与ＳＤＥ法接近，是一种操作简便、精密、准确、节能、环保的前处理方法。 微波辅助溶剂萃取（ＭＡＳＥ）是运用极性溶剂如水对固体基质中的目标化合物进行提取的一项技术。当水分子吸收微波能量后，温度和压力迅速增加，目标化合物可 以更快地从基质中释放出来。而且，这种释放过程并不会破坏有机化合物本身的结构。朱晓剐３５］等采用ＭＬＬＥ与ＧＣ方法测定烟草和烟气中挥发性有机酸，Ｈ．Ｙ Ｚｈｏｕ等【３６】采用ＭＬＬＥ法从烟叶中提取茄呢醇。 超声波辅助萃取（ＵＥ）主要通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固一液萃耿分离。储国海【３７】等人采用ＵＥ与 ＧＣ－－ＭＳ方法，以二氯甲烷为萃取溶剂提取烟草致香成分，鉴定１１２种致香成分。储志兵掣３８】采用超声提取一高效液相色谱法测定烟草中烟碱含量。同时蒸馏萃取法（ＳＤＥ）使用同时蒸馏萃取装置，使水相与有机相在同时蒸馏萃取装置中充分混合，从而把与水共沸腾的香味成分萃取转移至有机相中，该方法集提取、蒸馏、萃取于一身，步骤少，操作简单、快速。郭方道【３９１等使用ＳＤＥ方法提取烟用香精中风味成分进行分析。彭夫敏【４０】采用ＳＤＥ法提取烟草挥发性成分。１绪论硕Ｉ：论文１．３咖啡酸（ＣＡ）等多酚类物质分析的研究现状咖啡酸（Ｃａｆｆｅｉｃ Ａｃｉｄ，ＣＡ）艮ｇ ３，４－二羟基肉桂酸（３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ），为黄色结晶，１９４。Ｃ软化，２２３．２２５℃分解，易溶于热水，冷醇及碱溶液，微溶于冷水。 烟叶中的咖啡酸为绿原酸及其异构体的水解产物。ＣＨ－一ＣＯＯＨＨＯ ｏＨ烟叶中有许多多酚基的化合物，咖啡酸就是其中的一种，这些物质与烟叶的颜色、 香味和烟气的生理作用有关。多酚对烟气香味有贡献，但高浓度的多酚会产生不良影 响。烟草中简单的酚类含量极微，多酚类的含量较多一些（烟草中提及的酚类常指多酚）。目前烟叶中的多酚类化合物（包括咖啡酸）的分析方法主要有一下几种： 容量法【４２】是利用酚类物质的还原性，采用多种氧化剂，例如高价的金属离子和盐： Ｆｅ“、Ｃｅ“、重铬酸钾、高锰酸钾、钨酸钠等进行滴定。但是由于样品中具有还原性 的物质较多，如一些氨基酸和蛋白质等都会对测定结果产生影响，当样品中糖含量较 高时也会影响测定结果。该方法对设备、试齐｜ｊ要求较低，易于实现。但是无法对各种 酚类物质进行分别测定，且方法的灵敏度较低，滴定终点较难观察。 分光光度法【４３】也是测定酚类化合物总量的一种常用方法。Ｆｏｌｉｎ一酚法是在碱性溶 液中酚类化合物将钨钼酸还原，生成蓝色化合物，在７６０ ｎｍ处进行检测。普鲁士蓝 法是在酸性介质中酚类化合物可将Ｆｅ”还原成Ｆｅ２＋，Ｆｅ２＋再与Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６生成蓝色化 合物，在６９５ ｉｌｌｎ处检测。酒石酸亚铁法是含有邻位羟基的酚类化合物在缓冲溶液 （ｐＨ＝６．４．８．３）中能与加入的酒石酸亚铁生成蓝色螯合物，在５４５ ｎｌＴＩ处进行检测。氨基 安替比林法是对位上没有取代基的酚类化合物可与其生成红色醌式化合物，在４９０ ｎｌｎ处有最大吸收。该方法的最大问题也是在于仅能测定酚类化合物的总量，无法分 别测定各种酚类化合物的含量。 采用色谱法测定烟叶中的多酚化合物的报道主要有一下几种： 纸色谱（ＰＣ）：１９５３年Ｒａｙｂｕｍ／４４】研究了将烟草中的酚用重氮化的对硝基苯胺衍生 后再用纸色谱进行测定；１９６０年Ｒｕｎｅｃｋｌｅｓ［４５】在第十四届烟草化学家研讨会（ＴＳＲＣ） 上报道了采用纸色谱对烟叶中的绿原酸和芦丁进行直接分析测定。 离子交换色层法№】：此法是测定烟叶中各主要多酚化合物最早且较为可靠的方法 之一。此法的要点是烟叶样品用乙醇萃取，小心挥去溶剂，残渣溶于水并定容后，用 乙醚萃取除去咖啡酸。溶液经ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＨ。型树脂层除去芦丁，然后洗脱绿原酸并进４硕ｆ：论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图ｉ｝年幕础研究行定量测定，同时再用上述乙醚萃取液和含有芦丁的水相分别测定咖啡酸和芦丁【４７１。 硅胶色谱测定法：１９８１年Ｌａｔｔａｎｚｉｏ［４８】等，采用了长为３０Ｘ ２ｃｍ内填ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０ 的色谱柱并以乙醇．ＮａＯＨ为淋洗剂对植物酚类物质进行层析，用紫外检测器进行检测。气相色谱法（ＧＣ）：从酚类化合物的物化性质可知，多酚化合物的沸点较高，有的 在高温时会分解。因此多酚化合物的气相色谱法大多需要进行衍生，使其成为易挥发 的衍生物才能进行。早在１９７２年Ａｎｄｅｒｓｏｎ等【４９】曾用硅烷化试剂将烟叶中的莨菪亭及 莨菪灵衍生成硅醚衍生物并进行气相色谱测定。１９８２年Ｓａｋａｋｉ［５０】等也用上述试剂将 烟叶中的绿原酸衍生成硅醚衍生物进行ＧＣ测定。 高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）：１９７７年Ｃｏｕｒｔｌ５１】首先研究了烟叶中多酚化合物的ＨＰＬＣ方法。用３０ｃｍ×４ｍｍ内填１０ｌａｍ１．ｔ―ＢｏｎｄａｐａｋＣ１８柱，采用梯度淋洗，观察到１９个化合物的色谱峰，作者用保留时间和紫外光谱鉴定出７个多酚化合物。１９８４年 Ｎｉｓｓｅｒｏｒｌ５２Ｊ等再次用ＨＰＬＣ对烟叶中的多酚化合物的ＨＰＬＣ行为进行了研究，发现在２０ ｃｍ×４．６ｍｍ内填５１．ｔｍＮｕｃｌｅｏｓｉｌ的Ｃ１８柱上，以ｐＨ为２．５的甲醇（或乙睛）一水为流动相，采用梯度淋洗，并以紫外检测器进行测定时，可对烟叶中的某些酚类、肉 桂酸多酚衍生物、黄酮、香豆素等进行分析检测。１．４果胶多糖的研究现状果胶（ｐｅｃｔｉｎ）３乙称为果胶多糖（ｐｅｃｔｉｃ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）是最复杂的一类多糖，通常认为由原果胶（ｐｒｏｔｏｐｅｃｔｉｎ）、果胶酯酸（ｐｅｃｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ）和果胶酸（ｐｅｃｔｉｃ ａｃｉｄ）组成。果胶类物 质代表高等植物初级细胞壁和相邻细胞间紧密联合的一组多糖，也代表从植物材料中 制备的一群复杂胶状多聚物。其基本结构是Ｄ．吡喃半乳糖醛酸以Ｑ．１，４．糖昔键连接 的线性长链，相对分子量５．３０万，其羧基常以部分甲酯化的状态存在，其商品主要 来源于柑橘、甜菜、柠檬、节果等。 在果胶类物质的主链上还连有其它糖类，关于这些组分的相互关系，不少学者认 为他们只是缔合存在，并不参与果胶类物质的基本结构，也有学者认为，这些中性糖 共价键合在骨架链上。果胶多糖的主要成分是Ｄ．半乳糖醛酸，中性糖组分为Ｄ．半乳 糖、Ｌ．阿拉伯糖等。这些非糖醛酸组分的含量很大程度上依赖于材料来源合处理方法 也与制备合测定方法相关。５绪论坝｝治尘幽１．４．１．１粜胶多精的摹本结构果胶在很多领域内都有重要用途，国内外对于各种植物及其果实中所含粜胶的研究也越来越多，例如ｃⅫｓｔｉｎａ Ｋｕｒｚ，量控制。ＲｅｉｎｈｏｌｄＣａｒｌｅ等ｆ５４ｌ在对杏、桃、南瓜的果实的研究结果表明：果实中的果胶，纤维索、半纤维素等组成可作为果实种类的鉴别与质目前粜胶的分析方法主要分为三类：重量法、比色法、色谱法。重量法测定果胶是最经典的一种分析方法，其主要思想是将样品中的游离糖、色 素等干扰物质通过固液萃取去除后得到细胞壁物质，再将细胞壁物质用合适的奔莩液萃 取，将不溶性的果胶多糖转化为可溶性的果胶多糖，然后再用醇沉淀法、盐沉淀法等 将其沉淀分离，如图１．３．３．１所示为典型的莺量法测定烟草中果胶多糖的基本步骤。干烟叶粉末――‘‘‘１。。。。。。。。。。。。。ｌ。。。。。。。。。。。。。。。。。。～可浒性物质 残渣（细胞壁物质）Ｉ‘Ｈｌ｜ｆＩ?２）《“残渣ｌ＊＾｛ｍ ’。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。――――可浒性物质厂―生竺胃“”１。戎渣 可湃性物质果胶物质 幽１．３．４．１．１重量法测定烟草果胶音城流程图重量法存在的晟大问题在于不可能将待测物中的所有果胶多糖都提取出来，并且６硕｛：论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图谱基础研究在制取细胞壁物质的过程中，可能会将待测物中部分可溶于水的果胶多糖萃取出来， 这都将影响测定的准确性，一般测定值比试剂值都要偏小。 比色法采用最多的是用酸将样品中的果胶水解成半乳糖醛酸后用硫酸．咔哗显色 测定【５５】，该方法中硫酸的质量对测定成败关系重大，如果硫酸中含有某些金属离子及 氧化剂，可产生异常的绿色反应而使测定失败。王蕾等【５６】利用氢氧化钠将果胶物质上 所带的甲基水解成为甲醇，再用高锰酸钾将分离出的甲醇氧化为甲醛，甲醛再与品红 二氧化硫试剂发生显色反应，用分光光度法测定甲醇含量，根据所测得的甲醇含量计 算果胶含量。还有人【ｓ７】采用３，５．二甲苯酚分光光度法测定果胶含量，其原理是半乳糖 醛酸在硫酸介质中产生中间产物５．甲酰一２呋喃甲酸能与３，５．二甲苯酚显色。３，５．二硝 基水杨酸（ＤＮＳ）显色法是另一种利用比色法测定果胶含量的方法，其测定原理是：用 果胶酶将烟草中的果胶质水解，得到的半乳糖醛酸类物质在ｐＨ兰１２条件下与ＤＮＳ 发生显色反应，产生棕红色的物质，在一定的质量浓度范围内，半乳糖醛酸的量与反 应液的颜色成正比例关系。马东萍等【５８】采用该方法测定了烟草中果胶的含量。 比色法的最大缺点在于很多糖对比色法产生较大干扰，容易与显色试剂发生反 应，并且对于含有色素的样品，必须先对其进行脱色，否则也会引起较大的误差，这 使得比色法在复杂样品、低含量样品的分析上存在精密度、准确度较差等问题。并且 比色法只能一次测定一种物质的含量，无法对果胶多糖的基本组成进行分析。 色谱法对于复杂样品的分离分析有着其它方法无法比拟的优点，它具有分离效率 高、分析速度快、检测灵敏度高、样品用量少、选择性好、多组分同时分析、适于批 量样品分析等特点。因此，色谱法已广泛应用于果胶含量测定及果胶结构分析上，表 现出了其良好的特性。目前采用色谱法分析果胶一般都是将果胶多糖或样品进行水解 ／醇解后再用气相色谱、高效液相色谱、毛细管电泳及离子色谱等方法进行分析。 气相色谱法较早地应用于果胶的分析。李波等【５９】将多糖样品中的糖醛酸进行羧基 还原，使糖醛酸还原为相应的中性糖，然后将中性糖的糖醇乙酰化衍生物用ＧＣ进行 分析，通过比较羧基还原前后中性糖的变化，推算出糖醛酸的组成。 由于单糖在紫外区基本无吸收，并且直接进行液相色谱一质谱联用分析效果很 差，因此一般在进行单糖的液相色谱分析时都要进行衍生化处理。单糖及糖醛酸衍生 化分为柱前衍生化和柱后衍生化，柱前衍生化因其对设备要求低，应用最为广泛。戴 军等【６０１采用１．苯基．３．甲基．５．吡唑啉酮（ＰＭＰ）柱前衍生化对酸解后的杜氏盐藻多糖的 单糖组成进行了高效液相色谱ｆＲＰ．ＩｑＰｔ．ｃ）分析，其方法灵敏度高，准确可靠，可同时测定多种单糖及糖醛酸的含量。Ｈｉｆｏｔａｋａ勋ｌ【ｉｔａ等【６１】采用柱后荧光衍生Ｊ下相色谱法对半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等几种糖醛酸进行了分析方法研究。近年来，一种新的高效 阴离子交换色谱（ＨＰＡＥ）用于糖类的直接分离测定ｕ１２Ｊ。该方法是在强碱性介质（ｐＨ≥ １２）中，根据不同糖类化合物ｐＫａ的差异引起的离子交换作用的差异以及某些糖类与７１绪论硕‘Ｊ：论文阴离子交换树脂之间的疏水性相互作用的不同，实现糖类化合物的高效阴离子交换分离。然后根据羟基在金电极表面发生氧化反应产生的电流大小实现简单糖类、胺基糖类和糖酸检测。该方法具有不用衍生、操作方便、灵敏度高、不使用有毒化学试剂和 有机溶剂的优点，对糖类的检出限可以达多Ｊｐｍｏｌ数量级。 此外，毛细管电泳（ＣＥ）也被用于糖醛酸的测定中１６２。，但是由于ＣＥ的重复性较差， 检测限不够高，目前该方法使用的较为有限。值得一提的是除了ＧＣ法多采用氢离子火焰或质谱检测器进行检测外，其它的色谱分析方法中检测器的选择尤为重要，它直接影响了样品预处理的方法与检测结果的灵敏度与可靠性。糖类的紫外吸收只在１９０＂＂１９５ ｎｉｌｌ附近，因此直接紫外检测时易受 到流动相及样品中其它杂质的干扰，检测效果很不理想，若采用柱前或柱后衍生化后再进行检测可以达到满意的效果。示差折光检测法是只要试样成分和流动相的折射率有差别就可检测的通用检测方法，在糖类分析中被广泛应用，但是其检测灵敏度较差， 检测的选择性较差，并且不能使用梯度洗脱，使用了缓冲盐的流动相也会对其产生影响。荧光检测法在灵敏度和检测选择性方面都优越，但是，要求成分必需是发荧光性的。由于糖类不是发荧光性的，必须对荧光衍生法进行种种研究。柱前反应衍生法是 试剂中使用．氨基吡啶的吡啶氨基衍生化，广泛用于糖蛋白的糖链构造解析，可做到 ｐｍｏｌ级的检测。电化学法也是高灵敏度的检测法，在用于糖类方面有使用Ｃｕ或Ａｕ 电极的方法。特别是，Ａｕ电极与脉冲方式相组合的方法可检测数ｐｍｏｌ级的糖。可是， 由于反应液必须保持强碱性，根据流动相条件，柱洗脱液中必须用另外的泵注入高浓度的氢氧化钠。另外，由于检测的选择性不高，在与杂质成分的分离上存在问题。采用软电离方式的质谱检测器在进行糖类的直接检测上很难得到满意的效果，经过衍生 化处理后再进行质谱检验可以做到样品的定性定量分析。 除了以上介绍的方法外，徐志强等１６３】还采用酶解．流动分析法测定了烟草中果胶 的含量。但是酶解法很难将烟草中的果胶完全分解，可能造成测量值偏低，该方法目前使用范围还很有限。１．５烟用香精香料的指纹图谱分析用于质量控制的研究现状１．５．１烟用香精、香料及指纹图谱的基本概念香料是从带香物质中提取或以人工合成方法得到的致香物质的总称，是配制香精的原料。烟用香料可以调和使用，也可单独使用，作用主要是增强烟草制品的香气和 改善烟草吸味。烟用香精是把两种或两种以上的烟用香料，按照一定的配比并加入适当的辅料（溶剂、色素、增味剂等）所组成的，专供各种烟草制品加香矫味使用，使之８硕ｆｊ论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图谱基础研究在然吸时产生优美的香气和舒适吃味的一类烟草制品添加剂。从本质上看，加料香精 实际是在改善吃味方面作用比较突出的香料，如鲜、干果浓缩液、中草药提取物、辛 香料提取物、豆香料、某些植物的叶子与根茎的抽取物、棕化反应物、合成香料等。 香料是指在叶片上施加的一种水溶性添加剂加剂与丙二醇、乙醇和水调配混合而 成的液体。通常是用两种以上的烟用添按作用划分为调味料、增香料、保润料、助燃 料、防霉料；按加料对象划分为烤烟香料、混合型香料（旱料、表料）、雪茄型香料、 梗丝香料及其它。 指纹图谱是指复杂物质经过适当处理，如同时蒸馏萃取、液液萃取、固相微萃取 等，然后运用色谱或其它分析方法分析其中的复杂成分，借以化学计量学、统计学、 应用数学等其它数学方法，来鉴别物质的真伪与质量的稳定性的一种模式。常用分离、 分析手段有光谱、色谱、电泳等等。 １．５．２烟用香精香料的质量控制现状 国内对烟用香精质量进行控制的产品标准最早为１９９２年上海香精香料研究所起 草，由原轻工业部颁布的“ＱＢｌ５０６．１９９２烟用香精”；１９９８年国家烟草专卖局发布实 施了ＹＣ厂ｒ１４５系列标准，ＹＣ／Ｔ１４５共包含９个方面的内容。这９个方面的内容是控 制香精质量所必需的，优点是不需要贵重复杂的仪器设备，便于在卷烟企业、烟用香 精生产企业和各级烟草质量监督检验机构使用。总的来说卷烟企业、烟用香精香料生 产企业和各级烟草质量监督检验机构目前对烟用香精的质量主要通过折光指数、相对 密度、酸值、挥发成分总量等一些物性指标及人工嗅香这两个环节来控制。这些物性 指标只能从总体上反映香精的某些特性，而人工嗅香是以鼻感作为识别工具的。由于 人工嗅香受着主观意识、环境和个体差异等因素影响而不能准确客观的判定香气质 量。同时这些物性指标也不能从化学组成的角度对嗅香的差异做出定性、定量的解释， 因此依靠这些指标不能有效地监控香精的质量波动情况。上述各项检验方法基本上是 对香料、精油、合成和单离香料与烟用香精的共性的物理化学指标进行测定，但是对 于烟用香精来说，由于溶剂是烟用香精中含量最大的成分，所占比例达６０％以上其余 １０，－－－－４０％是致香成分，影响烟用香精上述物性指标的主要是溶剂．依靠这些物理化学 指标不能有效地监控香精的质量波动情况。 对于烟用香精、香料这一类复杂样品的品质，很难用几个指标或几种物质的含量 进行表征，也很难采用一些固定的物理或化学的指标进行控制，与此类似的还有中药 及中药制剂的品质控制。目前采用指纹图谱控制中药品质已被广泛地研究与应用，取 得了良好的效果，对于烟用香精、香料的品质控制可以借鉴中药中的指纹谱图控制法，亦可以取得不错的效果。１．５．３烟用香精香料的指纹图谱分析方法研究进展９１绪论硕Ｉ：论文根据检测时采用的分析手段不同，可将指纹图谱分为生物技术指纹图谱和化学成 分指纹图谱。生物技术指纹图谱又可分为电泳指纹图谱、ＤＮＡ指纹图谱等；化学成 分指纹图谱又可分为光谱指纹图谱、色谱指纹图谱等。通常所说的指纹图谱是指狭义的表达植物约物代谢产物化学特征的指纹图。化学成分指纹图谱是借助于光谱、色谱或波谱技术获得待测物次生代谢化学成分的光谱图、色谱图，来鉴定其真伪、优劣，是一种综合的、可量化的鉴别手段【６５】。该方法已广泛应用于中药的质量控制中，是目前符合中药特色的评价药材、中间产品和 成品质量一致性、稳定性的质量控制模式，而在烟用香精香料的质量控制中的应用也 已被广泛关注。 光谱指纹图谱可以用红外、紫外和Ｘ．射线衍射等多种方法建立。不同产品所含物质基础不同，所测光谱的性质就会有所差异，采用合适的技术手段，使得同种产之间的光谱有着良好的重现性和特征性，便可以鉴别其真伪、优劣。光谱中的紫外可见 光谱主要反映化学物质的电子共轭体系特征，红外光谱反映化学物质不同基团振动吸收征，但光谱很难象色谱指纹图谱那样，可表达出中药材等这样复杂混合体系中各种不同的化学成分浓度分布的整体情况。因此对其应用研究较少。例如王家俊等【吲在傅 旱叶变换衰减全反射红外光谱（ＦＴＩＲ．ＡＴＲ：Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｆｒａｒｅｄ－ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｏｔａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）指纹图谱应用于烟用香精质量控制的研究中取得了～些有用的信息。色谱指纹图谱是指采用色谱方法以及其它联用技术建立的同种产品所共有的组分群体的特征图谱或图像。可以对产品进行定性和定量的研究，来评价和控制其质量。 目前，普遍意义上的指纹图谱指的就是色谱指纹图谱。应用于烟用香精香料的色谱指 纹图谱主要是气相色谱指纹图谱与液相色谱指纹图谱。 ＧＣ具有高效、高灵敏度、进样量小及分析速度快等优点。但要求样品必须具有一定的挥发性和热稳定性，因而限制了其应用范围。该法主要用于香精香料中各种易挥发性成分分析测定。王钧等【６７】采用ＧＣ．ＦＩＤ系统对１０个批次的烟用香精香料的分 析过程中与传统的检测方法相比得到了较为一致的结果。曲国福等【６８】采用ＧＣ．ＭＳ系统建立起ＨＭＴ－２香精的气相色谱指纹图谱并通过掺兑试验对其用于香精质量控制的 可行性进行了考察，结果表明该方法能准确地反映烟用香精地质量状况。但是在进行 气相色谱法分析前都需要对样品进行适当的萃取等前处理措旌，以提取挥发和半挥发成分，香精料液中还还有大量的难挥发成分，造成检测的结果很难全面反映其成分变化。ＨＰＬＣ指纹图谱具有高效、快速、准确性和重现性好、适用面广等优点，且检测 器不断更新发展，更适于中药指纹图谱的建立。如运用二极管阵列检测器（ＤＡＤ）可得到三维图谱，适用于成分复杂、多种成分在紫外光区都有吸收的药物的分析。对成分差别较细微或成分较复杂的产品，其分离与鉴定能力大大优于分离原理相同的薄层色１０硕．Ｉ：论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图谱摹础研究谱（ＴＬＣ）。ＨＰＬＣ指纹图谱信息量大，对无标准的产品质量可提供较全面的、可靠的 科学评价；在有主要成分的对照品时，可进行产品识别、半定量、定量及各成分相对 比较定量。刘生江【６９】在采用高效液相色谱．蒸发光散色检测器（ＨＰＬＣ．ＥＬＳＤ）用于烟用 香精香料地质量控制研究中收到了良好的效果。１．６本课题研究的目标、内容及意义１．６．１目前存在的问题 对于烟草等植物中的咖啡酸及果胶的分析方法研究已有多年历史，但是各种分析 方法或多或少存在一些问题。 １．传统的重量法分析果胶含量无法将样品中的果胶完全提取出来，造成测定值 偏低；比色法测定果胶及咖啡酸的含量无法避免很多其它物质的干扰，造成测定失败或测定结果偏高。２．对于样品的预处理，在分析咖啡酸时，最早采用索氏提取后正己烷萃取，后 有人采用超声波萃取．固相萃取小柱净化再进行分析。在分析果胶时，需要用大量的 有机溶剂用索氏提取法制取细胞壁物质后再进行酸解等方法的分析，一个样品的分析 方法长达十个小时以上。这些方法都较为繁琐，处理时间长，需要大量的有机溶剂， 不利于样品的批量分析。 ３．在采用色谱法测定烟草中果胶含量时，一般采用先测定样品酸解后的半乳糖 醛酸，再换算成果胶含量。在这个方法中半乳糖醛酸与果胶的比例是个关键，一些文 献采用了苹果果胶中半乳糖醛酸的绝对含量作为计算系数，但是不同种类的植物中果 胶的结构、半乳糖醛酸的含量是不同的，即使是同种果胶在不同的酸解条件下测得的 半乳糖醛酸的含量也是不同的，如果直接采用一些文献中报道的半乳糖醛酸含量作为 计算系数显然是不合适的，容易对测定结果造成很大偏差。 ４．烟用香精料液的现有品质控制标准过于单一，只能检测一些简单的理化指标， 不能完整反映出其品质，近年来研究的指纹图谱分析方法也存在着预处理方法繁琐、 分析方法稳定性差、重复效果不好等问题，未能在质量控制方面广泛应用。 １．６．２本课题研究的目标 本课题旨在以高效液相色谱分析方法为基础，充分利用高效液相色谱的高分离能 力，引入各种新型的样品预处理方法，从而简化样品的预处理，建立起一套较为简便 的烟草中咖啡酸及果胶的分析研究方法。 对于烟用香精料液的高效液相指纹图谱分析，选择合适的分析方法，重点考察该 方法的稳定性及重现性，以满足对产品的质量控制要求。１绪论顶ｆｊ论文１．６．３本课题研究的内容 １．采用超声波辅助萃取．高效液相色谱法分析烟草中咖啡的含量，对分析过程中 的预处理方法及色谱分析方法进行优化，将以烟草为研究基础的咖啡酸分析方法成功 运用于咖啡、金银花、贡菊、蒲公英等几种天然产物中咖啡酸含量的测定。 ２．采用烟样直接ＴＦＡ酸解．对氨基苯甲酸乙酉匕（ＡＢＥＥ）衍生化．高效液相色谱法 分析酸解产物中半乳糖醛酸及几种单糖的含量。对分析过程中所需的酸解条件、衍生 化条件、色谱条件进行优化。 ３．采用加速溶剂萃取．醇析法提取烟草中的果胶，并采用ＴＦＡ酸解法对烟草果胶 及苹果果胶的酸解产物含量加以对比，分析半乳糖醛酸及几种单糖的含量比例，用所 测定的半乳糖含量比例确定烟草中果胶含量。４．采用稀释直接进样．高效液相色谱分析法对烟用香精料液的指纹图谱进行分析，重点考察该分析方法的稳定性及重现性。 １．６．４本课题研究的意义 烟草中咖啡酸及果胶含量的测定是云南烟草研究院与中国科学院大连化学物理 研究所等单位联合承担的云南烤烟清香型风格的物质基础研究的一部分。烟草及其品 质主要是由其内在化学成分的组成含量所决定的，烟草化学成分的变化极其复杂，烟 草类型的不同，化学成分存在差异。烟草化学成分与烟叶品质的关系一直都是烟草化 学研究的重点。但是目前烟草中咖啡酸及果胶的分析方法大多繁琐复杂，有的分析方 法甚至于存在明显的方法学问题，给烟草中的咖啡酸及果胶的准确测定带来了很大的 困难，尤其是进行大批量样品分析时，耗时过长、分析方法存在较大偏差，给后续的 烟草品质与烟草化学之间的关系研究带来很大麻烦，本课题的研究成果可以解决传统 方法中带来的这一系列问题。 此外，在我国的烟草工业生产过程中产生了大量的残次烟术及烟梗等废弃物，这 些废弃物的综合处理与利用还存在很多问题，而这些废弃物中含有烟碱、盐酸、茄尼 醇、果胶、蛋白质、酚酸等有用成分，这些物质在食品、医药、精细化工等领域内有 着广泛的用途，本课题中对烟草中的咖啡酸及果胶的提取方法研究为从这些废弃物中 提取有用成分提供了很好的借鉴经验。 烟用香精料液的高效液相指纹图谱分析是由中国烟草总公司郑州烟草研究院、中 国科学院大连化学物理研究所等六家单位联合承担的烟用香精香料品控技术体系研 究的一部分，也是烟草行业四大战略课题之一“卷烟调香工程＂的重要组成部分。本 实验重点考察了高效液相色谱分析方法的稳定性及重现性，为后续的烟用香精料液指 纹图谱数学模型的建立、确立品质控制指标提供高效液相色谱分析方法的依据。１２顾．Ｉ：学位论文ＨＰＬＣ分析烟学化学成分及香精指纹图ｉ｝等幕础研究２烟草等多种天然产物中咖啡酸的测定引言咖啡酸（Ｃａｆｆｅｉｃ Ａｃｉｄ，ＣＡ）是一种多酚类有机酸，存在于多种天然产物中１７０‘７２１，２．１常与奎尼酸（ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）形成结合物（绿原酸及其异构体）大量存在，但在一般高等植物中常以游离酸、甲酯、奎宁酸，少数情况下以葡萄糖结合物的形态广泛存在。 咖啡酸等多酚类化合物与烟叶的颜色、香味和烟气等有关，它们对烟气的香味有贡献， 但是高浓度的多酚会产生不利影响。咖啡酸等多酚。烟草中简单的酚类含量极微，多 酚类的含量较多一些（烟草中提及的酚类常指多酚）。简单酚类常与涩口、药昧有关， 它们部分来自多酚类或其它大分子有机物热解产物中。例如儿茶酚是一种活性致癌 物，也是烟气中含量最多的酚。多酚类化合物中，以绿原酸和芸香苷二者含量最高， 也最为重要，在烤烟中含有３％或更高的绿原酸、１％左右的芸香苷和少量的莨菪亭。 烟叶在调制时，在多酚氧化酶、过氧化酶的参与下酚基被氧化为醌（酶参与的棕色化 反应），随调制条件、氧化程度的不同，绿原酸等多酚与氨基酸、蛋白质结合，形成 黄色、红色以至棕色的色素。庄亚东【４１】等对１７种烤烟型卷烟和６种混合型卷烟中６ 种多酚含量的测定，其结果表明：①在所分析的国产烤烟型卷烟中，无论是多酚物质 的总量还是主要多酚物质的含量均有随着卷烟档次和其内在质量的升高而增加的趋 势；②烤烟型卷烟样品中的多酚含量高于混合型卷烟样品；③４种国产混合型卷烟 的多酚含量高于２种进口混合型卷烟； ④在分析的所有卷烟样品中，都是新绿原 酸、绿原酸和芸香苷为主要多酚，其中绿原酸含量约占总多酚量的６０％左右。结论 是多酚含量与烤烟型卷烟的内在质量、卷烟类型和国产与进口混合型卷烟可能有一定 的关系，仅新绿原酸、绿原酸和芸香苷甚至仅一种绿原酸含量的变化就基本上可以 反映出卷烟中多酚总量的变化趋势。 此外，据文献报道，游离态的咖啡酸具有多种生物活性，它可以将植物体内的 Ｃｒ（ＶＩ）还原为Ｃｒ（ＩＩＩ），降低Ｃｒ（ＶＩ）的含量，从而降低了毒性【７３Ｊ；咖啡酸还具有抗氧化、 抗菌消炎、抗肿瘤及抑制ＨＩＶ的复制，可以诱导癌细胞的凋亡，抑制癌症的发展１７４。。最新的研究结果表明，咖啡酸还可以在发生创伤性脑损伤时保护神经元【．７５Ｊ。在临床医 学上咖啡酸的药理作用机理主要表现在：１．抗菌抗病毒： 具有较广泛的抑菌作用，但在体内能被蛋白质灭活。体外试验表明，有抗病毒活性，对牛痘和腺病毒抑制作 用较强，其次为脊髓灰质炎Ｉ型和副流感ＩＩＩ型病毒。２．抗蛇毒：咖啡酸３ 时能完全抑制２０ｕ Ｉｌｇ剂量ｇ响尾蛇毒磷酸二酯酶，用作抗蛇毒剂。３．其它作用：口服或腹口服，可增加人胃中盐酸的分泌量， 而阿托品则不１３腔注射时，咖啡酸可提高大鼠的中枢兴奋性； 并能使脉搏变慢；可增强子宫的张力，此作用可被罂粟碱所拮抗，２烟荦：等多种天然产物中咖啡酸的测定顾Ｉ：论文能影响；可增进大鼠胆汁分泌。有升高白血球、止血及灭活维生素Ｂ１等作用。能抑 制鼠脑组织匀浆脂质过氧化物的生成。有缩短血凝及出血时间的作用。 由此可见，对烟草等天然产物中咖啡酸含量的研究很有意义。一般来说，咖啡酸 主要存在于以下几类植物中：菊科植物如一枝黄花、蔷薇科植物如山里红、无患子科 植物如坡柳、毛莨科植物如升麻、水龙骨科植物如欧亚水龙骨、芸香科植物如柠檬、 蓼科植物如篇蓄、败酱科植物如缬草、唇形科植物如麝香草、杜仲科植物如杜仲等， 并且在各种植物的不同部位含量是不同的。本试验以烟草为主要研究对象，建立了咖 啡酸的提取及分析方法，并成功运用于几种常见中药如贡菊、蒲公英、金银花及咖啡 等天然产物中咖啡酸的测定。 目前测定咖啡酸含量的方法主要采用高效液相色谱法［７６】、薄层扫描ｒ７７】等方法。 天然产物的成分非常复杂，为了更准确地测定咖啡酸的含量，必须对天然产物进行适 当的前处理，把不同种类物质有效分离后才可进行测定。本文采用反相高效液相色谱 法测定了多种天然产物中的咖啡酸。通过优化分离条件，仅对样品进行十分简单的预 处理便可直接测定多种天然产物中的咖啡酸，从而为天然产物的开发利用及中药制剂 的指标控制提供了有效的分析测定方法。２．２实验部分２．２．１仪器与试剂 烟草样品由云南烟草研究院提供，咖啡、金银花、贡菊均属于市场出售产品，蒲 公英采自大连本地 高效液相色谱仪：Ｗａｔｅｒｓ ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５配２４８７紫外检测器（Ｗａｔｅｒｓ公司） 超声波清洗器：舒美ＫＱ２２００Ｅ（昆山市超声电子有限公司）电子天平：ＭＥＴｒＬＥＲＡＥ １００（梅特勒．托利多仪器有限公司）纯水机：ＭＩＬＬＩ．Ｑ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ公司）咖啡酸标样： ９８．０％（ＳＩＧＭＡ公司）甲醇：色谱纯（美国ＴＥＤＩＡ公司） 甲酸：色谱纯（美国ＴＥＤＩＡ公司）香豆素：分析纯（沈阳市试剂三厂） 硝基苯：分析纯（国药集团）ＭＩＬＬＩ．Ｑ纯水：１８．２ ＭＱ．ｃｍ１４硕．１：学位论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图谱荣础研究２．２．２溶液配制及预处理萃取液：甲醇／水＝８０／２０（ＶⅣ）；香豆素内标溶液：称取内标物香豆素０．３０００ ｇ于１００ ｍＬ容量瓶中，用萃取液稀 至刻度，摇匀配制成内标储备液，准确移取４．００ ｍＬ内标储备液于１００ ｍＬ容量瓶中， 用萃取液稀至刻度，摇匀。 硝基苯内标溶液液：称取０．２４０６ ｇ硝基苯置于１００ ｍＬ容量瓶，用萃取液稀释至 刻度，摇匀配制成内标储备液；准确移取４．００ ｍＬ内标储备液于１００ ｍＬ容量瓶中， 用萃取液稀至刻度，摇匀。准确称取Ｏ．２０ ｇ磨碎均匀的待测样品于一干燥洁净的１０ ｍＬ容量瓶中，加入５．００ｍＬ内标液，旋涡混匀后，再用样品萃取液稀至刻度，在６０℃超声萃取１０ ｍｉｎ，旋 涡混匀，静止数分钟，取上清液用０．４５ ｌｘｍ有机膜过滤后，进行ＨＰＬＣ分析。２．２．３色谱条件 色谱柱：ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ ４．６ｍｍ（ｉ．ｄ．）ｘ２５０ ｍｍ，５ ｇｍ，检测：ＵＶ ３３０ｎｍ，流速：０．８ ｍｌ＿Ｃｍｉｎ，柱温：４０℃，流动相的淋洗梯度见表２．２．３．１，进样量５皿。标 准样品与烟叶样品液相色谱图见图２．２．３．１。表２．２．３．１流动相的淋洗梯度１５２烟争等多种天然产物中咖啡酸的测定硕Ｉ：论文ＣＡａＴｑ ●ＵＪＬ一九图２．２．３．１咖啡酸标准样品（ａ）与烟草样品（ｂ）的高效液相色谱图对比 色谱柱：ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８；流动相：Ａ：０．１％ＥＦ酸水，Ｂ：乙腈，梯度洗脱；流速：０．８ｕｍＬ／ｍｉｎ＝柱温４０℃；检测波Ｋ：ＵＶ ３３０ｎｍ；进样量：５Ｌ２．３结果与讨论２．３．１标准曲线的建立及定量方法 以香豆素为内标的工作曲线：准确称取０。０５００ ｇ咖啡酸标样于１００ ｍＬ容量瓶，用甲醇／水（８０／２０，ＶⅣ）定容。移取不同体积的标样溶液于容量瓶中（必要时多次稀释），准确加入香豆素内标溶液，用萃取液定容，制成香豆素内标浓度为６０．００ｇｇ／ｍＬ咖啡酸浓度分别为０．５、５、２０、４０、６０、８０、１００ ｇｇ／ｍＬ的标准系列，取５“ｌ进行ＨＰＬＣ分析。以峰面积比（Ｙ）与质量浓度比（Ｘ）进行线性回归（图２．３．１．１），得到线性回 归方程（表２．３．１．１）。 以硝基苯为内标的工作曲线：移取不同体积的标样溶液于容量瓶中（必要时多次 稀释），准确加入香豆素内标溶液，用萃取液定容，制成硝基苯内标浓度为４８．１２ｇｇ／ｍＬ咖啡酸浓度分别为０．１５、０．５、５、１０、２０、３０、４０、５０ ｇｇ／ｍＬ的标准系列，取５“ｌ进行ＨＰＬＣ分析，以峰面积比（Ｙ）与质量浓度比（ｘ）进行线性回归，可得到咖啡酸标准曲线（表２．３．１．１）。１６硕ｆ：学位论文１４ＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图谱桀础研究３５硝基苯内标标准曲线：ｙ＝３０．３９９ｘ～０．１１７３０２５丑２０窿 旧１５１０５Ｏ ０ ０．２ ０．４ ０．６ ０．８ １ １．２ １－４ １．６ １．８含量比图２．３．１．１不同内标的咖啡酸标准，ｌ：作曲线表２．３．１．１半乳糖醉酸与３种单糖的线性同门方程、相关系数、线性范同奎Ｙ：峰面积比，Ｘ．－质量含量比定量方法采用内标相对法，计算公式如下：Ｘ＿ｆ（ｒａｇＩｇ）：Ａ。ｉｍｏ×１０００ＡｏｒｎＡｉ：被测组分峰面积ｍｏ：内标物质量 Ａｏ：内标物质峰面积ｍ：样品质量２．３．２样品预处理条件选择传统的天然产物中咖啡酸的提取方法主要是采用索氏提取管进行溶剂萃取，该方法萃取效率较低，使用溶剂量大，萃取时问长，提取结束后往往还需要采用柱色谱对 萃取液进行分离、浓缩，操作较为复杂。超声波辅助萃取（ＵＥ）是近年来发展迅速 的一种提取方法，已逐渐受到人们的关注。超声波具有机械作用和空化作用【７８１，显著１７２烟草等多种天然产物中咖啡陵的测定硕Ｉ：论文地增大溶剂进入提取物细胞的渗透性，加强传质过程，从而强化了萃取过程，而空化 作用有效地减小、消除溶剂与水相之问的阻滞层，从而加大了传质速率。同时，冲击 流对动植物细胞组织产生一种物理剪切力，使之变形、破裂，并释放出内含物，从而 大大加速了萃取过程。因此，超声波辅助萃取具有萃取效率高、萃取时间短、萃取成 本低、萃取过程温和等特点。在以前的文献中报道的咖啡酸测定方法中，有的采用索 氏提取管提取后再用ＳＰＥ小柱进行净化富集后才能进样分析【７９１；有的也采用了超声 波提取法但是未能测出咖啡酸【踟１，本试验采用优化后的超声波提取方法提取咖啡酸后直接进样，取得了良好的效果。在超声频率固定的情况下，影响超声波萃取的因素主要有超声萃取时间与温度。 本试验对超声萃取的时间与温度进行了优化。 ２．３．２．１不同超声萃取温度条件试验 实验条件：固定超声萃取时间１０ ｍｉｎ，分别在３０、４０、５０、６０、７０、８０℃下进 行萃取，结果见图２．３．２．１．１。∞ ∞ ｍ ｍ ｍ ｍ７６５４３２丑器旧删峰迥醉甾蚩罨ｍ，１０９．９ ０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０ ６０ ７０ ８０温度（℃）图２．２．２．１不同萃取温度下咖啡酸含量变化曲线’ 幸超声萃取时间同定１０ｍｉｎ由上图可以看出咖啡酸的萃取量随温度的升高而上升，在６０℃附近时达到最大 值，当温度继续上升，其萃取量又有所下降，这可能是萃取温度过高，萃取剂挥发而 引起的萃取效率降低，当温度达到８０℃时，萃取液已发生剧烈沸腾，无法进行正常 的萃取操作。因此，选定超声萃取的最佳温度为６０℃。１８硕．ｆ：学位论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图谱皋础研究２．３．２．２不同超声萃取温度条件试验实验条件：固定超声萃取温度为６０℃，分别对样品进行５、１０、１５、２０、２５、３０ｍｉｎ超声萃取，结果见图２．３．２．２．１。１６ １４羞１２器舄１０警８ 心甾６芒ｒ晷４０５１０１５２０２５３０３５萃取时间（ｍｉｎ）图２．３．２．１不同萃取时间Ｉ卜．咖啡酸含量变化曲线’ 宰超声萃取Ｉ司定温度６０℃由上图可以看出，表明咖啡酸含量呈小范围的震荡波动，没有明显变化。该实验说明在萃取５ ｍｉｎ以后咖啡酸含量即达到一个相对稳定的水平，为了节约萃取时间及 减少时间控制误差，取１０ ｍｉｎ为超声萃取时间。 因此，最后优化的超声萃取条件为：６０℃时超声萃取１０ ｍｉｎ。２．３．３色谱条件的选择 咖啡酸是酚酸类物质，调节流动相的ｐＨ值可以有效地改变它们在色谱柱内的保 留时间，从而改善分离效果。在本课题组前期研究【８１Ｊ的基础上，本试验在测定烟草、 咖啡、金银花、贡菊中咖啡酸含量时，水相采用０．１％的甲酸水溶液，有机相为甲醇，香豆素作为内标，可以实现咖啡酸、香豆素与其它物质较好的分离。在测定蒲公英中咖啡酸含量时，水相若采用０．１％的甲酸水溶液，有很多物质在３３０ｎｌｎ波长下有较强吸收，造成香豆素、咖啡酸无法与其它物质完全分离。于是我们又分别考察了０．３％、０．６％甲酸水溶液的分离情况（见图２．３．３．１），由图可看出随着甲１９２烟草等多种天然产物中咖啡睃的测定硕ｌ二论文酸含量的增加，对蒲公英的萃取液中酸性物质，尤其是具有相似结构、在紫外检测器 下具有相近的吸收波长的多元酚酸类物质电离的抑制液越来越强，可以较好的改善各 种物质在色谱图上的分离度，由此可以看出流动相的ｐＨ值对此类含有酸性物质复杂 样品的分离分析有很大的影响，选择适当的ｐＨ值能够大大提高目标化合物的分离度， 获得良好的实验结果，并且该方法简单易行，是解决此类问题的首选方法。最后蒲公 英中咖啡酸测定条件选定为：水相为０．６％甲酸水溶液，有机相为甲醇，硝基苯为内 标物。时闸／ｒａｉｎ图２．３．３．１流动相不同酸度对蒲公英提取液色谱分离的影响 色谱柱：ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８，流动相：Ａ：０．１％（０．３％，０．６％）甲酸水，Ｂ：乙腈，梯度ｐ洗脱；流速：０．８ ｍＩ．／ｍｉｎ；柱温４０℃；检测波长：Ｕｖ ３３０ｎｍ；进样量：５Ｌ此外，本实验虽未经过正己烷或ＳＰＥ小柱对提取液进行脱脂净化，但从试验结 果来看分理效果良好，完全可以达到定量分析的要求，并且经过上百次样品的分析， 柱系统未发生堵塞、柱效率下降等问题，实验的重现性良好。２０硕Ｉ：学位论文ＨＰＬＣ分析烟学化学成分及香精指纹图谱某础研究２．３．４精密度、回收率及检测限 以烟叶样品为研究对象，对方法的精密度、回收率及检测限进行了测定。根据信 噪比Ｓ／Ｎ＝３计算，咖啡酸最低检测浓度为７８．３ ｎｇ／Ｌ，５次检测结果的咖啡酸平均含量为１．８１８ ｍｇ／ｇ，ＲＳＤ为１．３４％，方法的回收率见表２．３．４．１。表２．３．４．１方法的同收率（ｎ＝５）２．３．５样品分析 为了验证本实验方法的可靠性与广泛实用性，在以烟草为主要研究对象建立起来 的咖啡酸的测定方法为基础，对文献中报道的含有咖啡酸的几种天然产物咖啡、金银 花、贡菊、蒲公英等进行了测定，其结果见表２．３．５．１。咖啡、贡菊、金银花、蒲公英 等几种天然产物中咖啡酸含量测定分离的高效液相色谱图见图２．３．５．１～图２．３．５．４。从 实验结果来看，本实验方法的稳定性与适用性均很好，除在个别天然产物中需调整流 动相的酸度及内标外，其它天然产物的测定均符合要求。表２．３．５．１儿种天然产物的咖啡酸含餐测定（ｎ＝５）２１２烟荦：等多种天然产物中咖啡酸的测定硕Ｉ：论文图２．３．５．１咖啡中咖啡酸测定的高效液相色谱图 色谱柱：Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８；流动相：Ａ：０．１％甲酸水，Ｂ：乙腈，梯度洗脱；流速：０．８图２．３．５．２金银花中咖啡酸测定的高效液相色谱 色谱柱：ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８；流动相：Ａ：０．１％甲酸水，Ｂ：乙腈，梯度洗脱；流速：０．８ｐｍｌ＿／ｍｉｎ；柱温４０℃；检测波长：ＵＶ３３０ｈｍ；进样量：５Ｌ硕‘Ｉ：学位论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图谱皋础研究图２．３．５．２贡菊中咖啡酸测定的高效液相色谱色谱柱：ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８；流动相：Ａ：０．１％甲酸水，Ｂ：乙腈，梯度洗脱；流速：０．８ｕｍＬ／ｍｉｎ柱温４０℃；检测波氏：ＵＶ３３０ｎｍ：进样量：５Ｌ图２．３．５．２蒲公英中咖啡酸测定的高效液相色谱 色谱柱：ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８：流动相：Ａ：０．１％甲酸水，Ｂ：乙腈，梯度洗脱：流速：０．８ｕｍＬ／ｍｉｍ柱温４０℃；检测波长：Ｕｖ３３０ｎｍ；进样鼙：５Ｌ２烟草等多种天然产物中咖啡睃的测定硕ｌｊ论文２．４本章小结 以烟草为主要研究对象，成功建立了一种超声波辅助萃取．反相高效液相色谱法测定咖啡酸的含量方法，该方法大大简化了样品预处理过程，缩短了样品预处理时间，并减少了预处理过程中所需溶剂的量。优化后的超声波提取条件为：以甲醇／水＝８０／２０（ｖ／ｖ）为萃取溶液，在６０℃下超声萃取１０ ｍｉｎ，将提取液过０．４５ 膜后即可进样分析。 本试验将以烟草为研究基础的咖啡酸分析方法成功运用于咖啡、金银花、贡菊、 蒲公英等几种天然产物中咖啡酸含量的测定。实验结果表明：本试验建立咖啡酸含量ｕｍ有机滤测定的方法具有较为广泛的适用性，方法简单易行，准确度高，重现性好，可做为天然产物中咖啡酸测定的基础分析方法，对分析与咖啡酸具有相似结构的其它多元酚酸 类物质的分析有一定的借鉴意义，也为烟草中香味风格的物质基础研究及烟草加工行业中产生的废次烟术再利用提供了研究基础。此外，本试验还说明了对于咖啡酸这一类多元酚酸类物质，流动相的ｐＨ值对色 谱分离效果有较大的贡献。在不同天然产物的分析过程中，调节ｐＨ值可有效地改善 分离效果，拓展了方法的普遍适用性。硕．１：学位论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图谱摹础研究３烟草中果胶含量的测定及其几种主要单糖组成研究引言 除了咖啡酸等多元酚酸外，果胶是烟草中的另一种重要成分，它在烟草中含量为３．１１２％左右，在一定程度上反映了烟叶的物理性质，如韧性、弹性和溶湿性。它对烟叶 结构的稳定性和烟叶热解产物都有着重要作用，而热解产物对烟气化学性质起着重要 作用。烟草中果胶类物质含量过高时，会使烟草在燃吸时燃烧不完全产生焦糊气味， 使烟草具有强烈的刺激性，青杂气重、吸味辛辣，烟香不透发，对烟草吸味极为不利， 果胶含量测定已成为烟草品质评价的重要指标【８２州】。 此外，我国作为烟草大国，每年生产加工过程中都积累了大量弃之不用的次品烟 叶及烟梗、烟末，造成了大量浪费及环境问题，废弃物的综合利用是急需解决的问题。 这些固体废弃物中富含果胶、植物蛋白、烟碱、烟酸等成分，而果胶有着广泛的用途， 目前主要用作增稠剂、凝胶剂、乳化剂，它在食品、化妆品、医药、纺织、印染、烟 草等行业中有广泛应用。近年来对其药用性研究显示，果胶具有抗菌、止血、消肿、 解毒、抗腹泻、降血脂、抗辐射等作用，是一种优良的药物制剂基质。食品科学中把 果胶定义为水溶性膳食纤维，属功能型多糖类。它作为天然的提取物，是一种耐酸的 凝胶剂和完全对人体无毒无害的天然食品添加剂。果胶是一种亲水性乳化剂、胶凝剂 和增稠剂，可单独或与其他赋形剂合用配制软膏、膜剂、栓剂、微囊等药物制剂【５３１。 因它有抗菌、止血、降血脂等药理作用，可单独或与其他药物配伍用于治疗某些疾病。 近１０年来国内外关于食用植物纤维治疗糖尿病的报道同渐增多，植物纤维对许多营 养物质的消化、吸收和代谢起着重要作用。实验表明，果胶治疗可使血糖明显下降， 可作为治疗糖尿病的简单易行的辅助措施。目前国际上果胶的使用量逐年增加，果胶 的价格也随之提高，从废弃的烟梗、烟未中提取有用的果胶等物质就能够很好的解决 废弃物综合利用的难题。因此，对烟草中的果胶进行研究是很有必要的。 烟草果胶的测定常用ＥＤＴＡ提取果胶然后，用重量、法容量测定，或者将果胶 水解成半乳糖醛酸后，用咔唑显色测定。这些方法大多操作十分麻烦，为了快速准确 地测定烟草中果胶，本试验研究了用高效液相色谱测定烟草中果胶含量的方法。烟草 中果胶在ＴＦＡ介质中被水解为半乳糖醛酸，然后用高效液相色谱测定半乳糖醛酸含 量，再换算成果胶含量。该方法由于经过色谱柱分离，比容量法重量法和比色法具有 更好的选择性，测定结果更为准确、可靠，而且可以同时测定果胶中的几种多糖的含 量。该方法用于烟草中果胶含量的测定结果令人满意。３烟草中果胶含量的测定及其几种主要单糖组成研究硕．１：论文３．２实验部分３．２．１仪器与试剂高效液相色谱：ａｌｌｉａｎｃｅ ２４８７配２４８７紫外检测器（Ｗａｔｅｒｓ公司）液质联用仪：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ－－ＥＳＩ―ＳＱ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ公司） 高效液相色谱：ＳＨＩＭＡＤＺＵ一１０ＡＶＰ（日本岛津公司）配Ａｌｌｔｅｃｈ 器（Ａｌｌｔｅｃｈ公司） 质谱仪：ＡＢＩ Ｑ．ｔｒａｐ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（美国ＡＢ公司） 加速溶剂萃取仪：ＤＩＯＮＥＸ ＡＳＥ２００（美国ＤＩＯＮＥＸ公司） 超声波清洗器：舒美ＫＱ２２００Ｅ（昆山市超声电子有限公司） 电子天平：ＭＥＴＴＬＥＲ ＡＥ １００（梅特勒．托利多仪器有限公司） 纯水机：ＭＩＬＬＩ．Ｑ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ公司） 旋转蒸发仪水浴锅：ＲＥ一５２Ａ（上海亚荣生化仪器厂） 集热式恒温加热磁力搅拌器油浴锅：ＤＦ－１０１Ｓ（巩义市英峪予华仪器厂）离心机：ＳＯＲＶＡＬＬ Ｂｉｏｆｕｇｅ Ｓｔｒａｔｏｓ（德国）；ＥＬＳＤ２０００检测微波炉：ＭＭ７２１ＡＡＵ．ＰＷ台式微波炉（美的公司） 自动电位滴定仪：雷磁ＺＤ．２型 冻干机：ＬａｂｃｏｎｃｏＦｒｅｅｚｅ Ｄｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ／Ｆｒｅｅｚｏｎｅ ４．５节果果胶标样：９８．０％（ＳＩＧＭＡ公司） 半乳糖醛酸钠标样：９８％（ＳＩＧＭＡ公司） 葡萄糖：分析纯（沈阳化学试剂厂） Ｄ．甘露糖：分析纯（国药集团上海化学试剂有限公司） Ｄ．木糖：生化试剂（国药集团上海化学试剂有限公司） 甲醇、乙腈、乙酸：色谱纯（美国ＴＥＤＩＡ公司） 三氟乙酸（ＴＥＡ）、乙酸铵：色谱纯（美国ＴＥＤＩＡ公司） 水杨酸：分析纯（天津市科密欧化学试机有限公司） 硼砂：优级纯（上海云岭化工厂） ４．氨基苯甲酸乙酯（ＡＢＥＥ）：（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ公司） 氰基硼氢化钠（ＳＩＧＭＡ公司） 氢氧化钠：分析纯（沈阳化学试剂厂） 无水乙醇：分析纯（沈阳化学试剂厂）ＭＩＬＬＩ―Ｑ纯水：１８．２ ＭＱ?ｃｍ烟草样品：由云南烟草研究院提供硕＿ｌ：学位论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图谱幕础研究３．２．２溶液配制 储备液：将１０ ｇ的４．氨基苯甲酸乙酯（ＡＢＥＥ）及１０ ｇ乙酸溶于甲醇中定容至１００ ｍＬ，置于４℃冰箱中储藏备用：将０．５４℃冰箱中储藏备用ｇＮａＢＨ３ＣＮ溶于甲醇中定容至１０ ｍＬ，置于水杨酸内标溶液：称取内标物水杨酸０．２００１ ｇ于１００ ｍＬ容量瓶，用热水溶解， 冷却至室温后定容，置于室温下备用 硼砂溶液：称取３８．２ ｇ硼砂溶于１００ ｍＬ水中（０．１ ｍｏｌ／Ｌ），并用４０％ＮａＯＨ溶液调至ｐＨ＝１０．２，置于室温下备用三氟乙酸（ＴＦＡ）水解液：称取约２３ ｇ的ＴＦＡ溶液，加入２０．００ ｍＬ水杨酸内标溶 液，定容至１００ ｍＬ（含ＴＦＡ２ｍｏｌ／Ｌ），置于室温下备用色谱流动相：Ａ：５０ ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵，并用乙酸调节ｐＨ＝４．０１ Ｂ：乙腈／甲醇＝２／１ （ｖ／ｖ） ３．２．３样品的酸解及衍生化准确称取０．１０ ｇ磨碎均匀的待测样品于一干燥洁净的２０ ｍＬ具塞试管中，加入５．００ ｍＬＴＦＡ酸解液，密封，置于油浴锅中１２０＂ｃａｎ热水解３．５ ｈ；将水解液冷却至室温后转移至１０ ｍＬ离心试管中，１２０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清液备用。取０．５０ ｍＬ 水解液置于５ ｍＬ离心试管，冷冻干燥后用０．５０ ｍＬ纯水超声复溶，再加入４００ ＡＢＥＥ储备液及１００ｕｌａ ＬＬＮａＢＨ３ＣＮ储备液，漩涡混匀，封管，置于水浴锅中７０℃加热衍生化５０ ｍｉｎ。衍生化完成后趁热加入１．００ ｍＬ硼砂溶液并剧烈振荡，以除去 过量的ＡＢＥＥ。将反应液冷却至室温后，过０．２２ ３．２．４烟草果胶的提取 称取２．５ ｇ烟末置于加速溶剂萃取池中，以８０％乙醇为萃取液，在９０℃、１０００ｐｓｉＩＩｍ水膜，进行ＨＰＬＣ分析。下进行反复萃取，直至萃取液无色为止。将萃取池中剩余的残渣置于５０℃烘箱中烘 干，以除去乙醇。将烘干后的残渣置于１００ ｍＬ烧杯中，加入７５ ｍＬ的０．５％乙酸铵溶 液，放入微波炉中６００ Ｗ加热１１０ ｓ。将微波提取后的溶液趁热抽滤，丢弃滤渣，按 ３：２（Ｖ：Ｖ）的比例在滤液中加入无水乙醇，使乙醇含量达到６０％左右，将溶液置 于４℃冰箱中静置４ ｈ以上。溶液中的沉淀物过滤后：再放入６０％乙醇中洗涤，以 除去杂质，最后将沉淀物置于５０℃烘箱中烘干，即得到纯果胶。 ３．２．５色谱条件 色谱系统采用Ｗａｔｅｒｓ ２６９５高效液相色谱仪配２４８７可变波长紫外检测器，色谱柱： ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ ４．６ｍｍ（ｉ．ｄ．）ｘ２５０ｍｍ，５岬，检测：ＵＶ ３０７ｎｌｎ，流速：０．８ｍｌ＿／ｍｉｎ，柱温：４５℃，流动相的淋洗梯度见表３．２．５．１，进样量５ ｐＬ。标准样品与烟２７３烟草中果胶含量的测定及其几种主要单糖组成研究硕ｌ：论文叶样品液相色谱图见图３．２．５．１。表３．２．５．１流动相的淋洗梯度图３．２．５．１ＡＢＥＥ衍生化糖类标样与烟样酸解液相色谱图５０色谱柱：ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙｃ１８；流动相：Ａ：ｐＨ＝４．０ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵溶液，Ｂ；乙腈／甲醇＝２／ｌ，ｕ梯度洗脱：流速：０．８ ｍＩ．／ｍｉｎ：柱温４５。Ｃ；检测波长：Ｕｖ ３０７ｎｍ；进样量：５Ｌ硕ｆ：学位论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图｝｝譬基础研究３．３结果与讨论３．３．１标准曲线的建立准确称取０．２０３７ ｇ半乳糖醛酸钠、０．１９９１ ｇ木糖、０．２０５０ ｇ甘露糖、０．２００６ ｇ葡 萄糖标样于１００ ｍＬ容量瓶，用纯水定容。移取不同体积的标样溶液于１０ ｍＬ容量瓶中（必要时多次稀释），准确加入２ ｍＬ水杨酸内标溶液，用纯水定容，制成含水杨 酸内标０．４００２ ｍｇ／ｍＬ的标准系列，ＡＢＥＥ衍生化后，过０．２２ 程、相关系数、线性范围及检测限见表３．３．１．１及图３．３．１．１。表３．３．１．１ 半乳糖醛酸与３种单糖的线性同门方科、相关系数、线性范围及检测限１．ｔｍ水膜，取５止进行ＨＰＬＣ．ＵＶ分析。以峰面积比（Ｙ）与质量含量比（Ｘ）进行线性回归，得到线性回归方幸Ｙ：峰面积比，Ｘ：质量含量比图３．３．１．１ＡＢＥＥ衍生化几种单糖及半乳糖醛酸标准ｊ１：作曲线３．３．２衍生化条件的选择及衍生化产物稳定性考察 采用高效液相色谱法对糖类物质的分析目前己较为成熟，例如采用糖柱或氨基柱２９３烟草中果胶含量的测定及】ｅ几种主要单糖组成研究硕ｌ：论文对糖类物质进行分离后再用示差折光检测器（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ 光散射检测器（ＥｖａｐｏｒａｔｉｖｅＬｉｇｈｔ．ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇＩｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，ＲＩＤ）或蒸发Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，ＥＬＳＤ）进行检验。但是ＲＩＤ灵敏度较低，对流动相的温度很敏感，并且在检测过程中液相色谱部分不能采用梯度洗脱， 对于复杂样品的分离分析很不利。本实验在最初探索阶段采用ＷａｔｅｒｓＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＥＬＳＤ ＨｉｇｈＣｏｌｕｍｎ在ＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＬＣ－１０ＡＴＶＰ）一ＥＬＳＤ（Ａｌｌｔｅｃｈ２０００）系统上对几种单糖及半乳糖醛酸钠进行分析，分析结果表明：几种单糖可以得到很好的分离，并且峰型较好，但是半乳糖醛酸钠在２―３ｍｉｎ出峰，且峰型很差。 经分析可能是由于半乳糖醛酸钠的极性太强，基本在色谱柱上无保留，并且半乳糖醛 酸钠的晶体晶型较差，在ＥＬＳＤ上的响应不规律，导致峰型很差，并且ＥＬＳＤ的线性范围很窄，不利于含量波动较大的物质定量分析。针对半乳糖醛酸极性较大，本实验也曾尝试采用正相高效液相色谱法（ＮＰ．ＨＰＬＣ） 进行分析，而ＮＰ．ＨＰＬＣ虽然已早应用于单糖的分析，但是由于正相色谱的流动相中 不含盐，糖醛酸电离度较高，很难在正相柱上吸附，其带负电荷的羧基与正相柱填料 中的硅醇基发生排斥，导致在正相柱上保留很弱或基本无保留。 为了改善单糖及糖醛酸的分离选择性和提高检测灵敏度，一般人们常将单糖用紫 外或荧光试剂进行衍生后再利用色谱方法分离和检测。目前，用于单糖衍生化的试剂很多，主要有１一苯基．３．甲基．５．＠蝴（ｐＭｐ）ｔ６０，８５】、２，４一二硝基苯、对甲氧基苯胺、对氨基苯甲酸酯类有较弱的极性，更有利于增加衍生化产物在Ｃ１８柱上的保留时间，２一氨基吡啶、６．氨基喹啉、苯甲酸、对氨基苯甲酸（ｐ－ＡＭＢＡ）【８６】和对氨基苯甲酸酯类。有利于与其它物质的分离，因此本试验采用对氨基苯甲酸乙酯“蛆ＥＥ）作为衍生化试剂。以半乳糖醛酸为例，采用ＡＢＥＥ衍生化测定其含量的化学反应方程式如图３．３．２．１ 所示。Ｈ划＜江～挺艺Ｎ仉。ｏＰ１做图３．３。２．１半乳糖醛酸ＡＢＥＥ衍生化示意图硕士学位论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图谱基础研究该反应产物具有良好的紫外吸收特性，而且大大改善了糖及糖醛酸在Ｃ１８柱上 的保留特性，使其能够与其它物质分开成为可能。在该衍生化反应中，ＡＢＥＥ至少过 量１０倍以上，以确保反应完全，影响衍生化效果的主要是反应温度及反应时间。 ３．３．２．１不同衍生化时间条件试验 实验条件：固定衍生化温度为７０℃，分别对样品在４０、５０、６０、７０、８０ 下进行衍生化反应，结果见图３．３．２．１．１。４．５ｍｉｎ４ ３．５ ３＿苎Ｘ３２．５２娶 陋１．５ １ Ｏ．５ Ｏ ３０ ４０ ５０ ６０ ７０ ８０９０时间／ｍｉｎ图３．３．２．１．１ ＡＢＥＥ衍生化时间对反应的影响’?同定衍生化反应温度为７０℃由上图可以看出，在５０ ｍｉｎ左右的时候，除葡萄糖外，其它物质的峰面积比基 本上达到了最大值，因此选择５０ ｍｉｎ衍生化即可。３．３．２．２不同衍生化温度条件试验 实验条件：固定衍生化时间为５０ ｍｉｎ，分别对样品在５０、６０、７０、７５、８０℃下 进行衍生化反应，结果见图３．３．２．２．１。３ｌ３烟草中果胶含量的测定及）ｅ几种主要单糖组成研究硕ｌ：论文４．５ ４ ３．５ ３丑２．５ 娶 值 ２１．５ ｌ ０．５ ０ ４０ ５０ ６０ ７０ ８０ ９０飞ｒｃ图３．３．２．２．１衍生化温度对反应的影响毒 幸固定衍生化反应时间为５０ｒａｉｎ由上图可以看出，在７０℃左右时，除葡萄糖外，其它几种物质的峰面积比也是 达到了最大值，当温度继续升高的时候，半乳糖醛酸的峰面积比发生明显下降，经过 ＵＰＬＣ．ＥＳＩ．ＳＱ．ＭＳ分析发现，在反应产物中出现了一个明显的副产物峰，其分子量为 ３５７．１，可能是部分半乳糖醛酸与甲醇发生了酯化反应，生成了半乳糖醛酸甲酯，造 成半乳糖醛酸的衍生化产物含量下降。 因此，最终确定得衍生化反应条件为７０℃时衍生化５０ ｍｉｎ。 ３．３．２．３衍生化产物稳定性试验 实验条件：将衍生化产物密封，置于４℃冰箱中保存，每隔一段时间测定其中 各个物质的含量，结果见图３．３．２．３．１。３２硕、卜学位论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图谱牿础研究１４１２＿器１０ 旧黎８茬６‘挲Ｓ 酬４３．６５１７．７２２９．１３４３．２５４．４６９．６９６．３２１１７．５２ １３９．９７时问／ｈ图３．３．２．３．１衍生化产物的稳定性测试’枣将衍生化后的标准样品置于４℃冰箱中保村存从实验结果不难看出，衍生化产物的稳定性还是相当高的，在近１４０ ｈ内的测定结果没有明显的变化。值得一提的是在对实际样品的酸解液进行衍生化之前，需要将酸解液冻干（或低 温真空蒸干），以除去其中的ＴＦＡ。在研究分析方法时，对比了用纯水溶解、ＴＦＡ酸 解液溶解、先用ＴＦＡ酸解液溶解后冻干纯水复溶的半乳糖醛酸标准样品（见图３．３．２．５） 以及烟术酸解液未冻干和冻干后纯水复溶的样品进行衍生化反应后ＨＰＬＣ．ＵＶ分析 （见图３．３．２．６）。由图可以看出半乳糖醛酸钠溶于ＴＦＡ酸解液后直接进行衍生化分 析，会产生３个未知峰（图中所示为峰ｌ、２、３），并且主峰（半乳糖醛酸的衍生化产物 峰）面积明显变小，这大大影响了半乳糖醛酸测定结果的准确性。经过冻干纯水复溶 后再进行衍生化分析，其结果与直接将标样溶于纯水中衍生化分析的结果几乎一致， 没有发现较为明显的副反应产物峰。在对实际烟样酸解后采用同样的方法进行处理后 的结果与标准样品的结果一样。因此对酸解液进行冻干处理是非常必要的，它将直接影响到测定结果的准确性。３３３烟图３．３．２．５半乳糖醛酸标样冻干衍生化色谱图（１、２、３为副反应产物峰） 色谱柱：ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８；流动相：Ａ：ｐＨ＝４．０５０ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵溶液，Ｂ：乙腈／甲醇＝２／１，图３．３．２．６烟草样品水解后冻干衍生化色谱图（１、２、３为副反应产物峰） 色谱柱：Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙｃ１８；流动相：Ａ：ｐＨ＝４．０ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵溶液，Ｂ：乙腈／ｑｑ醇＝２／１。 柱温４５℃；检测波长：ＵＶ ３０７ｎｍ；进样量：５ｕ梯度洗脱；流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；Ｌ３．３．３半乳糖醛酸衍生化产物的鉴定 本实验采用Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ．ｕＶ．ＥＳＩ．ＳＱＭＳ对衍生化产物进行鉴定（见图３．３．３．１）， 一级质谱的定性分析（见图３．３．３．２及图３．３．３．３），并采用ＡＢＩ的Ｑ―ｔｒａｐ质谱仪对衍 生产物进行二级质谱的结构分析（见图３．３．３．３）。ＡＢＥＥ占ａｌＡｊ吊翥精，６１ １ｃ８１摆一２６．８９，。 ．ｂ嘲蝌柑黼釉制利郴¨刚嘲啪“州“Ⅵ嘲蚋钠蚋蝉螂忡籼酬鼬婶抽婚ＩＩｊ｜ｆ¨鞠酗―知蜘州唰黼脚枷脚．， ｕ－Ｐ广ｒｒ＿ｒｒ＿广ｒｒ＿产ｒ广广ｔ＿，＿ｒ广ｒ＿ｒｒ＿产ｒｒｒ下甲Ｔ甲’＿＇＿下Ｔ甲’＿＇’．ｒ千’＿－ｒ’１＿甲’’’下’＇呷叩一ｒ＿ｒ’呷＇１’＇＇１１＿＇１１１１１１１１－Ｔ－ｔ．’１’１＿＇１１１＿Ｔ１＿＇．ｆ．ｆ．１．＇＇’１１竹ＩｌｍｅＰ鲫ｊ ｌ，等热炒姗，ｓ ７ Ｐ茹。．２，６晒幽３．３．３．１半乳糖醛酸衍生化产物ＵＰＬＣ．ｕｖ．ＥＳＩ／ＭＳ谱图 Ａ：ＵＶ色谱图；Ｂ：ＥＳｌ＋色谱图；Ｃ：ＥＳＩ一色谱图由上图可以看出，紫外检测器与质谱检测器得到的谱图中半乳糖醛酸的衍生化产 物的保留时间基本一致，再根据下面的一级、二级质谱图可以确定该处即为半乳糖醛 酸的衍生化产物。其中紫外谱图中的保留时间略短些是由于紫外检测器是串联在质谱 检测器前。半乳糖醛酸的衍生化产物在ＥＳＩ＋模式下ＴＩＣ强度，比ＥＳＩ一模式下的ＴＩＣ 强度高很多，因此，在后续的二级质谱鉴定方式中电离方式采用了ＥＳＩ＋模式。３５３炯草中果胶含量的测定及其几种主要单糖组成研究阻＋Ｈ】＋３４４１７引硕｝：论文’＠ｃａｎＥＳ＋７ ５９ｅ６７３６６１１６３７［１＋２Ｎａ－Ｈ］＋２，。甲掣呼护？１翟掣３２．刁，够２９８哗。，。嘲３４２黑 ．芦础ｆ罗佃，；？｝篇孵图３．３．３．２半乳糖醛酸衍生化产物一级质谱图（ＥｓＩ＋）ＡＢＥＥ－ＧａｌＡ 曲ｏｕｐｅｎ９０７１１ ｉ３－ＡＢＥＥ－ＧａｌＡ．－｛一）１７８１（１５Ａ７１）Ｃｍ（１７５８：１８２孓１４３８ １６３２）３４２． １ ＳｃａｎＥＳ． ３２７７［ＨＩ‘●３４３．１７９２２０５ ３８１３２＂３０ ８１４５，，２３５ ９９０４／２４５?４５４７２６６ ９０ｆ３ ２７９ ８１５１３１２１２＂／＼６３２４．１６２３＼３４０?１１田 ｌ／３４４．１８／５尹沥３８１ ６５６７３９９Ｉ！∈Ｉ ３．３．３．２半乳糖醛酸衍生化产物一级质谱图（ＥＳＩ－－）硕。｝：学位论文ＨＰＬＣ分析烟草化学成分及香精指纹图谱基础研究３Ｗ２’１∞１『１１Ｍ１１０．１’ｈｋ掣．２０Ｊ，ｍ…．．｜山图３．３．３．３半乳糖醛酸衍生化产物二级质谱图（ＥＳＩ＋）对于以上的ＥＳＩ＋－－级质谱图，其可能的裂解规律如下： Ｍａｓｓ：２９８．１３ＥｘａｃｔＨ Ｎ―Ｈ２０―ＣＯｏ――――――――◆Ｈ Ｎ Ｏ≯７ＥｘａｃｔＭａｓｓ：３４４．１３＋Ｈ２讥Ｑ．Ｉｌ 上ＩＨ ＮＤ、－ＨＣＯＨ伊７ＥｘａｃｔＯＭａｓｓ：２１０．１１ Ｅｘａｃｔ≯７Ｍａｓｓ：２６６．１０３７３烟草中果胶含量的测定及其几种主要单糖组成研究硕Ｊ二论文３．３．４酸解条件的选择与优化 果胶多糖链的解离是本实验中的重要环节，对于果胶多糖链的分解有多种方法， 不同的方法各有优劣，它们直接决定了后续的分析方法。Ｈａｉｋｅｌ Ｇａｍａ等【８７】采用Ｏ．２Ｍ的ＴＦＡ ８０℃酸解７２ ｈ后，再用酶解，使得几乎多糖中的单糖全部被释放出来，最后使用高效离子交换色谱（ＨＰＡＥＣ）对单糖及糖醛酸进行了测定，但是该方法耗时太 长，不适用于多个样品的处理。采用酸性甲醇溶液对多糖进行醇解［８８，８９】是一种较新的 方法，它是将样品放入含酸的甲醇溶液中进行分解，可以使多糖中的中性及酸性糖单 元释放出来，并且释放出来的单糖被转化为甲基糖苷，含有羧基的糖醛酸被甲酯化。 该方法得到的产物有很高的稳定性并且可以直接进行毛细管气相或高效液相色谱分 析。但是该方法的醇解液较难配制，需要用到剧毒的乙酰氯，反应很强烈，存在～定的危险。对果胶多糖进行酸解还是最常用的方法，目前主要采用了不同浓度的ＨＣＩ、 Ｈ２Ｓ０４、ＴＦＡ等溶液在不同的温度、时间下进行。本实验对比了文献中的各种酸解方 法，最终选择了２Ｍ ＴＦＡ溶液为酸解液。ＴＦＡ不仅具有足够地酸性，而且它的挥发性很强，有利于后续的冻干除去多余的ＴＦＡ，避免其影响后续的衍生化反应。Ｊｅｒｏｍｅ Ｖ．Ｄｉａｚ等【９０】就专门对非酶解条件下酸解的ｐＨ、温度、时间及果胶甲酯化的程度对柑橘类果胶分解的影响。由此看来，不同的反应条件对于测定结果影响很大， 因此必须对试验过程中的各种条件进行优化。 为了使烟末中的果胶水解较为完全，０．１ ｇ的烟末中加入５ ｍＬ的酸解液，保证ＴＦＡ过量，影响酸解效果的因素主要有酸解时间与酸解温度。若酸解温度过低会使 酸解时间大大增加，延长样品预处理时间；若酸解温度过高，反应过于激烈，长时问地加热会使溶液蒸发量较大，不易控制反应过程。３．３．４．１不同酸解时间条件实验 实验条件：固定酸解温度为１２０。Ｃ，将样品酸解２、２．５、３、３．５、４ ｈ，结果见图３．３．４．１．１。硕Ｉ：学位论文２ＨＰＬＣ分析烟学：化学成分及香精指纹图谱皋础研究Ｏ８６４删篓轻汪教鼯端§黔蕊磐甘哥２Ｏ ２ ２．５ ３ ３．５ ４酸解时问／ｈ图３．３．４．１．１时间对酸解效果的影响 ＋嗣定酸解温度为１２０℃由上图可以看出，在酸解温度确定的情况下，随着酸解时间的延长，半乳糖醛酸的含量也随之增大，在３．５ ｈ左右即可达到最大值，随后继续延长酸解时间半乳糖醛酸的含量也无明显变化。因此，确定最佳酸解时间为３．５ ３．３．４．２不同酸解时间条件实验ｈ。实验条件：固定酸解时间为３．５ ｈ，样品酸解温度为９０、１００、１１０、１２０、１３０℃，结果见图３．３．４．２．１。２Ｏ８６４卿啦藿蠢鄹壤驾黔磊馨，斟２Ｏ ９０ ９５ １００ １０５ １１０ １１５ １２０ １２５ １３０ １３５酸解温度／＇ｃ 图３．３．４．２．１温度对酸解效果的影响幸同定酸解时间为３．５ｈ３９３烟学中果胶龠量的测定及ｌｅ几种主要单糖组成研究硕Ｉ：论文由上图可以看出，酸解温度对酸解影响非常大。９０℃时反应非常温和，酸解产物经色谱检测后未发现半乳糖醛酸，说明反应温度过低，不适宜本实验。随着酸解温度的升高，半乳糖醛酸含量迅速增加，１２０℃以后基本达到最大值，温度继续升高其含量也无明显明显变化。因此确定最佳酸解反应温度为１２０℃。 综合以上试验结果，最终确}