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求教关于 跨外显子 设计引物的问题
我设计引物从来是按照引物设计原理（网上随便找的一大堆东西），但是我现在很纳闷，关于跨外显子设计引物，这到底是为什么呢？
网上的答案是 可以避免基因组DNA污染，我在想，污染什么了？如果跟的基因组DNA结合的话，如果跨了外显子，肯定是结合不上去的，如果没跨外显子，结合上去了，那么，尽管是基因组DNA扩增，扩增出来的仍然是我需要的序列啊（因为没有含内含子，就没有内含子的序列来捣乱了），跟结合在mRNA上有差么？
而如果我扩增的是 RACE，那么下/上游是通用引物，要扩全mRNA,不管在SP设计在哪，都是一样的
也就是说，跨外显子设计引物，实际上我认为只是在 实时定量里才需要的，因为他们确实要了解，目标基因的mRNA在样本中的表达量，而对于要扩增单基因全长，为克隆基因而的话，是不必跨外显子的，
不知道说的对不对？
应该就是这个意思吧
应该是跨内含子。
做real time-时一般是跨内含子，避免与基因组污染。普通克隆基因不避跨。
但做做real time-时，如果增加了DNAseI 消化这一步，也不用设计跨内含子引物，
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如何设计针对基因特定外显子的引物
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存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域,所以对于延伸反应其引物的位置很难设计.Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术、DNA修复基因.CG二核苷酸是最主要的甲基化位点,它在基因组中呈不均匀分布,DNA的甲基化会抑制基因的表达,去甲基化又可恢复其表达.但是目前研究手段的局限,在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％.一般说来.DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用.CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一,而在基因组的某些区段如何设计针对基因特定外显子的引物一种全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技术DNA甲基化是一种表观遗传修饰,在肿瘤发生时,肿瘤细胞全基因组低甲基化是一个重要特征.肿瘤细胞基因组甲基化的程度与正常细胞相比仅为20-60% ,同时伴有局部区域基因的高甲基化,包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因,限制了DNA甲基化的广泛研究.近年来,研究者不断探索定性及定量检测单个或多个甲基化位点的方法,但由于甲基化多态性区域存在的密度很高,对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测.CpG甲基化的研究在肿瘤的研究中有着非常主要的地位,约有60％以上基因的启动子含有CpG岛,为甲基化研究提供了新的途径,它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase,Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应,在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基、血管形成抑制基因等,能够快速地检测甲基化的频率.DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达.通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达,从而引起相应基因沉默,CpG保持或高于正常概率,这些区段被称作CpG岛.CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域
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