第七章　诊断酶学
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第七章　诊断酶学
本世纪初临床就开始测定体液中的酶来诊断疾病，如Wohlgemuth早在1908年就测定尿液中淀粉酶（AMY）以诊断急性胰腺炎；30年代临床测定碱性磷酸酶（ALP）用于诊断骨骼疾病，随后发现不少肝胆疾病特别在出现梗阻性黄疸时此酶常明显升高。这些酶成为当时临床实验室的常规测定项目，直到60年代ALP仍是世界上测定次数最多的酶。但在50年代以前，酶测定在检验科常规工作中只占很少一部分。诊断酶学的真正发展还是从50年代用分光亮度法建立了连续监测酶活性浓度方法开始，它可以测定不少用旧的“固定时间法”不能测定的酶，并用于诊断疾病。结果发现乳酸脱氢酶（LD）、天冬酸氨基转移酶（AST）和α-羟丁酸脱氢酶（HBDH）在诊断急性心肌梗死（AMI）上的灵敏度远远超过其他诊断方法。在60年代初又肯定了肌酸激酶（CK）在诊断AMI比上面几个酶更早出现增高，特异性也高，目前此酶已取代ALP成为世界范围内测定次数最多的酶。同时发现丙氨酸氨基转移酶（ALT）、AST对肝炎诊断不仅敏感度高，而且早在肝炎黄疸前期就明显升高。这些成就引起了当时临床和实验室工作者广泛的兴趣和注意，先后进行了大量临床和实验工作，尝试和评价过成百种酶测定的临床意义，其中十种左右酶已成为目前检验科常用的重要测定项目。酶测定约占目前临床化学总工作量的1/4到1/2。随着广泛地应用和研究，也发现总酶活性浓度测定对疾病诊断的特异性远不如人们所开始预期的那样高。从70年代开始，学者逐渐将注意力集中到同工酶测定上来，发现CK-MB和LD1诊断AMI比上述总酶特异性更高，CK-MB已成为公认的诊断AMI的“金指标”，此二项同工酶测定也成为各大医院检验科必测项目。80年代以来，发现组织中同工酶进入体液后，有可能出现变化。如Ck-MM可进一步分为Ck-MM1、MM2和MM3，Ck-MB可分为MB1和MB2。在诊断AMI上优于CK总酶和同工酶，成为目前临床酶学上的一个研究热点。从70年代起，随着免疫学和技术方法的发展，用抗原抗体反应有可能直接测定微量的酶蛋白，为酶学在临床医学上的发展开拓了一个新的领域。本章将以血液中酶变化为重点，首先研究其变化的总规律，其次将从临床角度来探讨这些酶测定在临床诊断疾病、判断疗效和疾病预后中的价值。第一节　概述长期以来临床将血清酶变化的机制理解得很简单：即病变细胞将其细胞中高浓度的酶释放到血液中，二者间酶浓度梯度越大，则血清中酶升高程度越大。这种理解远不能解释各种各样的临床现象，例如肝中AST绝对量约是ALT的4倍，但在急性肝炎时ALT增高程度远大于AST，而在慢性肝病特别是肝硬化时血中AST又比ALT高，单从上述浓度梯度理论显然很难说清。必须全面了解各种影响血清酶变化的因素。首先要了解血清酶的分类，因为不同类型酶变化模式将是不一样的。一、血清酶的分类虽然绝大多数血清酶含量极低，在血液中没有任何功能，但也确有一小部分酶在细胞内合成后分泌到血液中，并行使一定功能。其典型例子就是一些与凝血过程有关的酶，如凝血酶原、Ⅹ因子、Ⅻ因子等，还有与纤溶有关的酶如纤溶酶原、纤溶酶原活化因子等。它们一般以失活或酶原状态分泌入血，在一定情况下被活化，引起一系列病理或生理变化。它们在血中浓度往往很高，甚至超过大多数器官细胞内浓度，因此在血中的变化常不是升高而是下降。它们大都在肝脏合成，并以恒定速度释放入血，肝实质病变时，血中浓度明显下降，常作为肝功能试验的一部分。这类对临床有价值的酶还有胆碱酯酶（CHE）、铜氧化酶、脂蛋白脂酶等，在血中含量都以mg％计，人们将此类酶命名为血浆特异酶。表7-1　临床常用的酶*EC编号推荐名简写1.1.1.27乳酸脱氢酶LD、LDH1.1.1.37苹果酸脱氢酶MD、MDH1.1.1.41异柠檬酸脱氢酶ICD、ICDH1.4.1.3谷氨酸脱氢酶GDH、GLDH2.3.2.2γ-谷氨酰基转移酶GGT、γ-GT（GGTP）2.6.1.1天门冬酸氨基转移酶AST、GOT2.7.3.2肌酸激酶CK（CPK）3.1.1.3脂肪酶LPS3.1.1.8胆碱酯酶CHE3.1.3.1碱性磷酸酶ALP（AKP）3.1.3.2酸性磷酸酶ACP3.2.1.1α-淀粉酶AMY（AMS）3.4.11.2氨基酸芳香酰胺酶LAP4.1.2.13果糖二磷酸醛缩酶ALD2.1.3.3鸟氨酸氨甲酰基转移酶OCT3.1.3.55′-核苷酸酶5′-NA（5′-NT）*EC：国际酶学委员会其它酶可归为非血浆特异酶，它们在血中浓度很低，常以微克计算，并且无何功能。可进一步分为分泌酶和代谢酶，一些外分泌器官分泌的酶可有小部分入血，如α-淀粉酶（AMY）、脂肪酶（LPS）、胃蛋白酶原等等，它们在血中一般也以失活状态存在，疾病时可以升高，但是如分泌细胞破坏，血中浓度也可下降，往往将ALP、酸性磷酸酶（ACP）也归到此类，认为ALP由骨细胞分泌，ACP由前列腺分泌。其余绝大多数酶都参与细胞内代谢，随正常细胞的新陈代谢，极少数进入血液，细胞内外浓度差异悬殊，病理情况下极易升高，一般很少考虑其浓度下降的临床意义。有些书还讲一步将代谢酶分为一般酶和组织专一酶，看来无此必要，从临床观点看，单测总酶变化就要得出病变存在组织或器官的结论，显然是很困难的。二、血清酶变化的病理生理机制前面已提到不同类型的酶，其变化机制会有所不同，如把所有可能影响因素都考虑进去，可以得到一个总的酶由细胞内进入血液以及在血中变化的总的模式图（图7-1）：图7-1　血清酶变化机制式中k1，k2分别代表细胞内酶进入细胞间隙或（和）直接进入血液的速率，如某些种类细胞直接与血液接触，不需经过组织间隙就直接进入血液，则血中酶变化不仅出现早而且明显。K3和k4分别代表酶从两个不同方向通过毛细血管壁的速率，某些组织或器官中毛细血管壁很致密，这些值较低，则可能有相当一部分酶经由淋巴管才进入血液，此速率常数为k5。而k6、k7则代表了酶在细胞间隙和血液的清除速率。K8代表酶被血中细胞或网状内皮系统细胞摄入的速率常数。少数酶属于血浆特异酶和分泌酶，如细胞出现增生性病变，则酶可以产生增多，并进入血液，反之也可能产生减少，从而引起血中酶浓度下降。不同组织或器管中酶进入血中途径不一，清除方法也有差异，这就构成不同疾病酶变化的多样性，也只有在总的规律基础上，掌握各种器官疾病的特殊性，才能解释和掌握酶变化规律，正确用于临床。从临床角度，可以将上述各种因素归纳为以下四个方面加以叙述。（一）细胞酶的释放细胞靠细胞膜来维持其完整性，细胞膜代谢十分活跃，依靠膜上一系列ATP依赖的离子泵来维持细胞内外Na+、K+和Ca2+浓度的差异，这过程需要耗费大量能源，当缺氧或能量代谢障碍、ATP供应减少、离子泵功能障碍时，无法维持正常离子的梯度差，改变了细胞的内渗透压，从而引起细胞肿胀，特别是Ca2+进入细胞内，引起细胞膜的泡状突出，膜孔隙增大，酶开始从细胞内向外溢出，其速度和数量受多种因素影响。主要的有：⒈细胞内外酶浓度的差异 对于非血浆特异酶，细胞内外浓度差可在千倍以上，因此只要有少量细胞坏死或者细胞有轻度病变，血中酶浓度就可能明显升高。有人计算过只要有1/1000肝细胞坏死，所释放的酶可使血中酶增加一倍。鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OCT）在细胞内外浓度差异可达到105：1，此酶在肝脏病变时变化极为明显，可惜的是，由于测定方法不方便，临床应用不多。但对于血浆特异酶而言，由于细胞内外浓度差异小，细胞病变很少引起血中酶浓度明显升高。⒉酶在细胞内定位与存在形式 从上述酶释放的机制不难理解最容易释放入血的是胞质中游离的酶，如ALT，LD等。而在细胞亚显微结构中的酶则较难溢出，除非细胞病变进一步加重，不局限于细胞膜。特别是线粒体酶，由于有两层致密的线粒体膜，往往当细胞出现坏死病变时，才开始释放入血。在一个典型的AMI病程中，线粒体AST是最后一个出现升高的酶，而且到达峰值时间也最迟。临床通过线体酶的测定，有助于判断疾病的不良预后。又如肝细胞中AST大部分存在于线粒体，虽然其绝对量超过ALT，但在急性肝炎时，由于细胞病变较轻，胞质中含有大量ALT，故血中ALT往往超过AST。而在肝硬化时，主要病变为肝细胞坏死，线粒体中AST大量溢出，血中往往AST大于ALT。细胞膜上也含有多种酶，如γ-谷氨酰基转移酶（GGT）大量存在于肝中毛细胆管上皮膜上，当胆道梗阻、胆汁潴留在肝中时，胆汁酸盐有表面活性剂作用，可将GGT从细胞膜上洗脱下来，而此时不一定伴有细胞膜病变。正因为血中不同酶变化机制有差异，这样GGT和ALT在各种肝胆疾病时的变化常不一致。⒊酶蛋白分子量的大小 不少实验都证实酶的释放速度大致与酶的分子量成反比。由于临床上测定的十余种酶之间分子量差异不太大，此因素对血中酶浓度高低影响恐不如上述因素，但对酶在血中出现升高时间先后有相当大影响。例如在AMI时，血中最先升高的CK分子量为85000，而分子量为125000的LD出现升高明显推迟。（二）酶在细胞外间隙的分布和运送细胞中的酶经过三种途径进入血液：一种如血细胞和血管内皮细胞中的酶，不经过稀释就直接进入血液。第二种途径，细胞酶既和组织间隙也和血液直接相接触。如肝脾，它们释放的酶很快直接入血，另有小部分进入组织间隙。第三种途径，大多数组织或器官中，由于存在着结构致密的毛细血管，所释放的酶大部分进入组织液。除一小部分通过毛细血管壁进入血液外，主要经由淋巴系统进入血液。由于血液只占细胞外液的20％，淋巴液和血液一天交换量可达50％-100％，其结果通过此途径进入血液的酶量不仅增高程度较低，在血中出现增高时间也较迟。临床医师不能忽视淋巴系统对血清酶浓度的影响。在一组动物实验中，单纯肌肉损伤加以固定，血中酶浓度变化不大；如加上被动运动，则AST明显升高；如移去实验动物胸导管，即使有被动运动，AST也不升高。有作者认为在坏死病变时血中线粒体酶很少达到像胞质酶这样高的程度，也是因为坏死病灶无淋巴液或很少淋巴液流动，这样大量线粒体酶堆积在坏死区，只有少部分坏死边缘区酶通过淋巴进入血液。剧烈运动后血中酶升高与其说是由于细胞损伤引起，还不如说与酶在不同体液中重新分布有关。首先运动引起血压升高，血浆容量减少，血液浓缩；更重要的是运动加速了淋巴液回流入血，大量组织液中酶进入血液。因此即使细胞中酶无明显释放入血，血液酶浓度也可增高。不同入血途径还可引起别一种差异，通过第三途径入血的往往是一些分子量小的单纯酶蛋白，通过前两种途径入血的不仅有单纯酶蛋白、大分子量的酶多聚体和抗体的复合物，乃至一些和细胞碎片结合的酶都易进入血液，临床上所观察的巨酶血症常与肝病有关，可能原因在此。（三）血中酶的清除为了很好解释临床上复杂情况，还必须了解不同酶从血中清除率的差异以及清除机制。弄清酶的清除率有助于理解，为什么同一疾病不同酶升高持续时间有差异。一般以血中酶的半寿期来代表酶从血中清除快慢，表7-2是一些常用酶的半寿期数据。表7-2　血浆中酶的半寿期酶半寿期AST17±5hALT47±10hGLD18±1hLD1113±60hLD510±2hCK约15hCK-MM17±4hCk-MB12±4hCK-BB约5hALP3-7天GGT3-4天CHE约10天AMY3-6hLPS3-6h从表7-2中不难理解为什么在急性肝炎恢复期时AST先于ALT恢复正常，也很好解释在AMI时CK-MB持续时间最短，因其半寿期只有6小时，而LD1因其半寿期长达100余小时，持续时间最长。有关酶从血中清除的机制，可说是目前最不清楚的问题，酶虽然也是蛋白质，但它们的半寿期明显比一般血清蛋白质为短，说明酶蛋白除遵守一般蛋白质代谢规律外，还有其特殊的清除机制。目前发现对于一小部分分子量小于60000的酶，如AMY可以从肾小球滤过一部分，从尿中排出，肾脏严重疾病时AMY升高也证实此一推论。但对于大多数酶而言，这种清除机制显然是不存在的。过去曾强调，通过胆汁可能排泄一部分酶，并认为这是梗阻性黄疸时，血中ALP、亮氨酸氨基肽酶（LAP）的升高机制。而目前更多倾向认为此时升高机制是肝细胞受刺激合成更多的酶，因为如给以抑制蛋白合成的药物，虽有黄疸，这些酶也不升高。目前有人强调单核吞噬细胞系统在清除酶中的作用，它们可将酶迅速吞噬入细胞中，并进一步分解破坏。有学者用Riley病毒选择性地感染小鼠单核吞噬细胞系统，引起血中LD、AST、AMY和CK等酶升高，用其它化合物封闭单核吞噬细胞系统也得类似结果。使用乙芪酚刺激单核吞噬细胞系统可加速这些酶的清除，但是也不能过高评价这种结果，就在同一试验中，一些酶如LD1和ALT就不受影响。此外，从临床角度来看，目前，尚无任何证据显示任何人的病毒感染疾病引起酶清除机制的障碍。（四）酶合成异常对于血浆特异酶，细胞内酶合成下降是引起血中酶变化的重要因素，这些酶大多在肝脏合成，因此当肝功能障碍时，胆碱酯酶常与白蛋白同时下降。酶合成减少和变异还见于不少遗传疾病，由于酶基因变异，可引起特定的酶合成减少乃至消失，如肝-豆状核综合征患者，血中铜氧化酶活性可明显下降乃至于零。在增生性疾病如骨骼疾病时，可因为骨细胞增生，合成分泌更多的ALP，引起血中此酶升高。恶性肿瘤患者血中酶升高有一部分可能与肿瘤细胞中酶合成增加有关，如前列腺癌细胞可产生大量酸性磷酸酶。酶的诱导作用也可引起血中一些酶浓度增高，最明显例子是服用苯巴比妥后常可引起肝中GGT合成增加，血中浓度升高并不意味着肝细胞有什么病理变化，停药后GGT就会下降至正常。乙醇、巴比妥类、杜冷丁类以及双苯内酰脲类药物都有此种诱导作用，诱导的酶除GGT外还可以是ALP。（五）其它实验室所测到的酶活性浓度值主要和酶量多少相关，但还受到其它物质特别是抑制剂和活化剂的影响。在病理情况下，应考虑有无抑制作用，因为某些药物和毒物有抑制酶的作用。当使用某些药物治疗肝炎后，还应考虑此药物有无可能抑制ALT活性，此时血中ALT量不一定下降，只是活性受到抑制，使所测活性下降而已。有机磷中毒时所测的血清胆碱脂酶和红细胞中真性胆碱酯酶活性浓度可以很低，此时并不是酶含量降低，只是和有机磷结合，而有机磷是这些酶的不可逆抑制剂，使酶活性无法发挥。三、血清酶的生理变异临床医师常通过两个途径来判断血清酶的测定结果是否异常，有无临床价值。一是将所测值与同一被测对象在正常条件下所测值进行比较，二是将所测值与实验室提供的参考值进行比较。但不论用什么方法都需知道，不仅是病理因素，还有不少生理因素也能引起所测值变化，这些变异并无临床或病理意义。（一）性别大多数酶在男女之间无大差异，但少数酶如CK、GGT在男女之间有明显差异，因此不能以一个参考值作为判断标准。建议以130U/L为男性正常参考上限，100U/L为女性参考值上限。这是因为CK在肌肉收缩中起重要作用，大量存在于肌肉组织中，从总体说男性肌肉比女性发达，所以血清CK在男女之间差异较大，在衡量个体CK变化时，恐怕肌肉发达程度是一个很重要的因素。GGT是另一个男女差别明显的酶，常以GGT30U/L（30℃）为女性上界值，50U/L（30℃）为男性上界值，这可能与雌激素抑制GGT合成有关。嗜酒者可诱导GGT合成，而嗜酒者男性多于女性。（二）年龄不少酶在儿童时期与成人有所不同，例如新生儿的CK、LD、苹果酸脱氢酶（MD）、ACP和谷氨酸脱氢酶（GLD）等常为成人2-3倍，尤其前两项CK、LD是临床常用的酶。CK出生24小时内可为成年人的3倍，到婴儿时降为两倍，到青春期降到成年人值。LD在出生时也为成人两倍，逐渐下降到14岁和成年人值一致。同时LD1值儿童期也比成年人高，正常儿童也可出现LD1＞LD2，如不注意此点，简单以正常成年人参考值为诊断标准，易导致儿童心肌炎的误诊。年龄引起酶变化最明显的酶是ALP，新生儿值略高于成年人。至周岁增至成年人的2-3倍。然后逐渐下降，到10岁左右，发育长高期ALP又明显升高，可达到成人的3-5倍。这可能与该时期软骨细胞、成骨细胞代谢活跃密切相关，切勿认为有肝脏病变，必要时应测ALP同工酶以资鉴别。也有少数酶如AMY，新生儿比成年人低。当进入老年期，有些酶也可出现变化，如ALP、GGT等都有轻度升高。（三）进食大多数血清酶不受饮食影响，故测酶活性不一定空腹采血。但应注意酗酒者常引起GGT明显升高，日本学者认为可根据血中GGT升高判断酗酒程度，如未累及肝脏，戒酒后一周GGT可降至正常。此外如禁食数天可导致血清AMY下降。（四）运动剧烈运动可引起血清中多种酶升高，升高程度和运动量及持续时间有关，也与运动者是否经常锻炼相关。训练有素的运动员，其血清酶升高幅度小。升高的酶多为肌肉中含量丰富的CK、LD、AST、醛缩酶（ALD）和ALT等，这些酶变化机制和意义是运动医学的一个重要研究项目，从临床角度，抽血化验前不宜过度运动，以免引起解释困难。（五）妊娠与分娩妊娠期出现一系列生理变化，也可引起一些酶升高，如不注意有可能引起误诊。例如由于胎盘产生耐热的ALP可引起血中ALP值超过正常，LAP也会明显升高，但都无临床诊断价值。铜氧化酶在妊娠期升高，若胎儿死亡，此酶很快降至正常，有学者在妊娠期监测此酶以观察胎儿情况。分娩时，由于子宫收缩，肌肉剧烈活动，可导致CK、CK-BB、AST、LD等升高，这些变化与心肌损伤无关。四、测定方法、标本处理等对测定结果的影响除了生理条件可引起酶测定值的变化外，还有其它一些非病理因素也会引起实验室测定结果的变化。（一）酶测定方法酶测定方法大致经过三个历史发展阶段，50年代以前大都使用“固定时间法”，即让酶与底物作用一段固定时间，一般为半小时左右，然后停止酶反应，用光电比色测产物生成量或底物消耗量，从而计算出酶催化反应的平均速度。再据此按各作者自己定义的“单位”向临床报告测定结果。这些所报的单位往往在前面冠以作者的姓名命名，例如ALP根据不同测定方法就有金氏单位、鲍氏单位、国际单位等等。同一标本不同单位结果从表面数值看可以差异很大。如ALP上列三种单位参考值分别为3-13金氏单位，0-3鲍氏单位，20-80国际单位。50年代中期，国际临床实验室开始采用“连续监测法”，就是习惯上所称的“动态法”。需要使用生化分析仪，可以测酶反应的初速度，其结果远比“固定时间法”所测平均速度准确，在高浓度标本时尤为明显。这样同一疾病患者用两种方法所测酶的结果并不一定平行一致。在疾病急性期，用新法测定结果增加倍数常明显超过老法。例如在肝炎用赖氏法测ALT很少超过参考值上限的十倍。改用新法，在肝炎急性期可得到超过参考值上限数十倍乃至百倍以上的结果，由于后者结果和临床病理变化相一致，结果准确。目前在发达国家中，新法已几乎取代了老法，我国也已开始广泛应用新法。本书各论在讨论各种疾病酶变化时，将主要根据新法加以叙述。用新法也就是“连续监测法”所得结果，目前已基本统一使用1964年国际生化协会所规定的国际单位（IU）：即以每分钟能催化1微摩尔底物的酶量为1个国际单位。如表示血清中酶浓度多以U/L表示之，即IL标本（血清）中含的酶量，我国医学界对此表示方法已经熟悉习惯。我国现在规定SI制为计量的法定单位，SI制的酶单位为Katal，即每秒能催化1总分子底物的酶量为1个Katal，此单位不仅我国医学家不熟悉，国际上应用不多，如有可能可同时用两种单位报告结果，或者注明转换系数，即1U＝16.67μKatal。但即使同使用连续监测法，同用IU/L报告结果，不同实验室测定结果仍可出现较大差异。这是因为上述二法是通过测酶催化速度来间接表示酶量高低，而酶催化的速度还受很多其它因素影响。首先是温度，在国际单位定义中并未规定测定温度，而反应速度随温度升高而加速，一般说每增加10℃，反应速度将增加一倍。因此同一标本、同一方法，在37℃所得结果将显著高于30℃。虽然国际临床化学协会（IFCC）推荐30℃为酶测定温度，但临床实验室由于实验工作方便等因素，愈来愈多使用37℃。因此本书各酶测定参考值将以37℃所测结果为准，某些数据如在30℃测定将在结果后面用（30℃）表示。除温度外，测定时条件的不同也可能引起结果明显差异。最突出例子是ALP测定，用二乙醇胺为缓冲液测出ALP结果比用氨基甲基丙烷为缓冲液的高2-3倍。又如在ALT测定时，如在底物中加入磷酸吡哆醛比不加者结果可增高20％-100％。正因为如此，为防止临床医生产生错觉，认为IU/L结果在国际上应一致。目前实验室常以U/L，而不以IU/L向临床报告。总之，临床医师在分析酶测定结果（U/L）时应以给报告实验室的参考值为准，盲目套用文献结果或与其它实验室结果相比较，有可能得到不恰当的结论。前面已提到从70年代以来，随免疫技术发展，出现利用酶的抗原性，通过抗原抗体反应直接测定酶的质量。测定结果不是以U/L报告而是直接用ng/ml，μg/L等报告酶蛋白含量高低。如临床医师看到这样的报告，就可知道此时使用了最新的免疫学方法测酶，其临床意义有可能与前两种方法结果有差异。例如国外公认，同样测CK-MB，用免疫学方法所测结果诊断价值最高，此问题将在后专门叙述。（二）标本的采集、处理与贮存在实验室测定酶之前，标本还要经过采集、分离血清和贮存等一系列处理过程。而酶在血中是处于一个动态变化过程，血液离开体内后，还会有一定变化。因此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值变化。采取血液标本时最容易引起实验室误差的是抽血不当，或者实验室急于分离血清，因此体外溶血。由于大部分酶在细胞内外浓度差异明显，少量血细胞的破坏就有可能引起血清中酶明显升高。最明显例子是LD，红细胞中LD约为血清的100倍，这样，只要有轻度溶血，如1/100红细胞破坏，就足以使血清中LD升高一倍，常使原为正常的血清LD值超过参考值上限。其它如CK，虽然红细胞中无CK，但含有丰富腺苷酸激酶（AK），进入血清能使某些用“连续监测法”测定CK的值假性升高，红细胞中酶的干扰，不仅表现在溶血影响上，采血后如不及时将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清，所以采血后1-2小时实验室必须及时离心，分离血清。除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一般都不采用血浆而采用血清作为测定标本。大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，例如EDTA为金属离子螯合剂，在去除Ca2+同时也去除其中Mg2+、Mn2+等离子，Mg2+是ALP、CK和5′-核苷酸酶（5′-NA）作用的激活剂，其它如草酸盐、枸橼酸盐乃至肝素都对一些酶有一定程度抑制。有必要时，可考虑使用肝素为抗凝剂，在常用抗凝剂中它对酶影响最小的。酶蛋白不稳定，易失活，ACP是最明显的一个例子。此酶在中性或碱性环境中极不稳定，血液在37℃放置1小时，ACP活性可下降50％。大部分酶在低温中比较稳定，分离血清如不能及时测定，应放冰箱保存，表（7-3）是常用酶在不同温度情况下的稳定性。从表7-3可看出－25℃将血清冻结并没有太大优点，相反有些酶如ALD、ALT在融冻时被破坏。有文献报道用液氧在－195℃贮存血清，常用酶如ALT、AST、ALP、CK、LD、GGT和AMY，在10个月活性变化不大。个别酶如LD在低温反而不如室温稳定，即所谓的“冷变性”。表7-3　酶在不同温度储存的稳定性（活性变化小于10％）酶室温（25℃）冰箱（0-4℃）冰冻（－25℃）ALD2天2天不稳定※ALT2天5天不稳定※AST3天1周1月ALP2-3天2-3天1月GGT2天1周1月CHE1周1周1周LAP1周1周1周CK1周1周1周LD1周1-3天1-3天ICD1天2天1天AMY1月7月2月LPS1周3周3周ACP4小时￥3天§3天§亚铁氧化酶I1天2周2周（铜氧化酶）※酶不耐融化；￥　标本未酸化；§标本加枸橼酸到pH5五、免疫方法测酶质量的临床应用用免疫学方法测酶质量和经典的测酶活性方法相比，不仅灵敏度高，并可能测定一些以前不易测定的酶。但更为有意义的是：有可能为临床上的应用提供新的资料和信息。从疾病论断的角度来看，至少提供下列三个新的可能性：（一）酶活性和酶质量变化的不平行这二者的变化在不少情况下是互相平行的，但在一些情况下可以出现不一致。早在1987年Robert就提出可以用免疫学方法直接测量CK的质量，并声称：“由于RIA法是如此的敏感，并可测定血循环中无活性的CK-MB，毫不奇怪此法可比其它方法更早查出心肌梗死，一般在疼痛3小时就可升高。”此后有些学者在急性心肌梗死时比较测CK-MB活性和RIA法CK-B亚单位的结果，发现二者之间存在着不平行关系。CK-MB活性升高持续较短，3天左右；而CK-B亚单位酶蛋白升高却在7天左右。近几年来发展了用免疫学方法测CK-MB酶质量（mass）方法与测酶活性（activity）方法的结果相比较，在检测心肌坏死上，测质量方法明显优于测活性方法。国内有人报告了用单扩法测酶活性的方法，测定了在各种患者血中超氧歧化酶（SOD）含量，证实有些患者血中存在着无活性的SOD。在一些疾病情况下，甚至出现二者变化完全相反的情况。例如在狗实验性胰腺炎，用免疫学方法测弹性蛋白酶浓度，出现迅速而急剧地上升，但同时酶活性却出现平行地下降。作者解释在释放酶蛋白入血同时，有大量酶抑制剂也释放入血，以致出现相互矛盾结果。前面提到的用两种方法测前列腺酸性磷酸酶（PACP）来诊断前列腺癌的阳性率不一致，有作者也认为可能是肿瘤组织合成一些无活性或活性较低的酸性磷酸酶。如果说在这方面尚有争论，那么在遗传学方面的意义则是比较明确的，将此两大类方法结合起来可以研究酶缺陷遗传疾病的发生机制，用免疫学方法可以测出灭活的酶蛋白量。由于基因缺陷引起的酶缺陷如果仅仅影响酶蛋白合成下降，酶活性与酶蛋白量的比率即所谓的“免疫比活性”无变化；如果由于基因缺陷合成了变异的酶蛋白，则不仅总酶活性下降，免疫比活性也将变化；如果合成了一种活性正常但结构不稳定的酶，则幼稚细胞中酶活性及质量都无变化，而在衰老细胞中将出现酶缺陷。酶稳定性的变异常见于红细胞内酶缺陷症。这是由于红细胞寿命较长，成熟红细胞无细胞核不能制造新蛋白质，所以酶稳定性的缺陷容易在衰老红细胞中表现出来。在最严重的情况，变异的基因甚至能合成无活性的酶蛋白，如胆碱酯酶遗传变异中，有一类型所谓“不活动等位基因”（“silent”allele）就是典型例子。又如在Lesch-Nyhau综合征中存在这免疫活性但无催化活性的次黄嘌呤转磷酸核糖基酶。（二）以免疫方法取代测酶活性方法免疫学方法和经典测酶活性方法相比最突出的优点是：免疫学方法能测定一些不表现酶活性的酶蛋白质，这在以前是不能想象的。首先是各种酶原，还有去辅基酶蛋白（apoenzyme）以及一些灭活的酶蛋白裂解产物等等。例如已有用RIA法测胰蛋白酶原。也有用免疫学方法测定线粒体和胞质谷草转氨酶，这其中包括无酶活性的去辅基谷草转氨酶。免疫学方法另一特点是特异性高，且不受体液中其它物质，特别是抑制剂、激活剂的干扰。不少蛋白水解酶或者对基质特异性不高，或者易受血中一些蛋白质如α1-抗胰蛋白酶、α２－巨球蛋白的抑制作用。用测酶活性方法不易准确定量甚至无法测定。在近年来用免疫学方法陆续建立了RIA测胰蛋白酶、弹性蛋白酶的方法。一般说来和测酶活性相比，免疫学方法灵敏度更高一些。一些既往由于方法学灵敏度差，不易测定的酶可以尝试改用免疫学方法，脂肪酶是其中例子之一。经典测酶活性方法由于灵敏度差，酶温育时间长达24小时，几经修改仍需4小时，现已有RIA法脂肪酶试剂盒。近年来随着优生学发展，羊水中各种成分包括酶的测定日益受到重视。例如在Tay-Sachs综合征时，胚胎组织细胞中氨基已糖苷同工酶A或（和）B合成障碍，免疫学方法由于灵敏度高，可以比测酶活性方法早几周在胎儿的羊水中查出此酶的缺陷。（三）同工酶测定免疫学方法用于测定同工酶比经典的理化方法简单方便，所以愈来愈多同工酶测定改用免疫学方法，国外已逐步取代电泳或层析法。除上文已提到的CK-MB、LD1、LD5测定外，还可用免疫学方法测半乳糖酰基转移酶同工酶A和B，碱性磷酸酶的Regan同工酶。同工酶有可能作为肿瘤的标记物（tumor marker），已证实γγ-烯醇化酶或神经元特异烯醇化酶（NSE）可作为APUD系统肿瘤的一个很好标记物。用RIA测血中NSE在肺小细胞性肿瘤患者中阳性率超过80％，γγ-烯醇化酶在大细胞肺癌阳性率也超过70％。可以预期随科学技术发展，免疫学方法将成为临床上测定同工酶的主要方法。六、检测同工酶及其亚型的临床意义从50年代中期开始，临床酶学有了迅速的发展，几乎把当时能测的酶都在临床上试用过，企图通过测定某一种或某几种酶来诊断一些特定疾病或特定组织器官的病变。通过10余年广泛的研究，发现酶测定诊断疾病的特异性并不高，因为机体中各种细胞的代谢有很大的相似性，从临床角度很难说存在着所谓器官特异酶。当时曾有学者想找出一些肿瘤特异酶，但很快发现找不到一种只存在于肿瘤组织并能进入血液而正常组织又不存在的酶。在此同时，Market等通过对LD在电泳时可分为5个区带的深入研究，在1959年首先提出“isozyme”的术语来描述一类酶，它们催化同一生化反应，但在结构和理化性质上有所不同，目前广泛使用国际生化协会推荐术语“isoenzyme”。我国目前多翻译为同工酶，临床很快将此新概念、新发现用于临床，发现同工酶测定可以弥补上述测酶总活性的不足之处，因为不同同工酶在组织分布、细胞内定位、发生发育方面都可能有所差异，临床可利用这些差异来增加诊断的特异性。目前不论在诊断肿瘤，还是诊断心脏、肝等疾病上都找到一些较总酶活性测定特异性、灵敏度高的同工酶测定项目，同工酶正逐步成为酶学中一个重要分支。80年代发现某些同工酶从组织进入体液后，进一步变化分为数个不同类型即所谓同工酶的亚型（isoform）。CK-MB的亚型MB1、MB2，CK-MM亚型MM1、MM2和MM3在AMI的诊断和溶栓疗效判断上都优于总酶和同工酶。同工酶是一个复杂的生物现象，至今在分类、概念上尚有一些问题有待研究澄清。从临床诊断角度可将同工酶理解为一个包括有多种能催化相同生化反应的酶族，在这族中虽然不同酶都催化同一反应，但在理化性质上有差异，如它们对底物的亲和性、特异性不同，对抑制剂出现不同的反应，所带电荷、对热耐受性有差异等等。生化学者根据这些差异用各种物理、化学方法将同工酶分离测定，从本质上说这些差异与酶蛋白结构有关，或者是构成酶蛋白的氨基酸在组成或排列次序上出现差异，或者由于二级、三级乃至四级结构不同而造成上述不同的理化性质，同时这些结构差异又可引起酶蛋白抗原性的差异。目前正在大力发展这种用免疫方法测同工酶的技术，并取得明显进展。同工酶之所以有较高的诊断价值与下面一些因素有关：首先是某些同工酶有明显的组织分布差异，以目前临床应用最多的CK和LD同工酶而言，CK大量存在于三种肌肉组织中，单独总CK升高很难判断。CK升高的组织来源为：骨骼肌中主要为CK-MM，平滑肌中为CK-BB，心肌中虽然大多数仍是CK-MM，但却含有14％-40％的其它两种肌组织中没有或仅含少量的CK-MB，这样只要能测CK同工酶，根据同工酶变化，不难判断出释放CK的器官或组织。LD虽然几乎存在于全身各种细胞中，但其五种同工酶在体内分布情况并不相同。如LD1主要存在于心肌和红细胞中，LD5则主要存在于肝脏和骨骼肌中，正常血清中同工酶分布为LD2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5，这样虽然心脏和肝的多种疾病都能引起总LD升高，但对血清LD同工酶影响却大不相同。如AMI时，LD1明显增高以致LD1＞LD2，肝病时将出现LD5＞LD4，AMI患者在LD1＞LD2基础上，又同时出现LD5＞LD4，可怀疑是否有右心衰竭，引起肝淤血。有些酶的同工酶与上述情况不同，只是细胞内定位不同，临床上有诊断意义的主要是线粒体同工酶，线粒体中有一些酶在结构和性质上往往与细胞质中同工酶有明显差异，临床应用较多的是线粒体AST。轻度病变时，由于线粒体有两层致密的膜，此同工酶很难进入血清，但在细胞坏死病变时，血清中线粒体同工酶常明显升高。近年来发现ALT也存在着两种同工酶，肝脏疾病时ALT经常升高，ALT同工酶测定应该对肝病预后判断有一定价值。在胚胎期，和器官的发生发育一样，这一时期酶带有早期种族进化的痕迹，与出生后人体的酶往往有差异。当人得肿瘤后，肿瘤细胞可以出现返祖现象，有可能出现胚胎期同工酶，测定这类同工酶有助于诊断肿瘤，例如胚胎期CK主要为CK-BB，约有10％恶性肿瘤患者血清可查出CK-BB，又如一些肿瘤患者血中可查到胎盘性ALP等等。总之，随着科学技术的发展，测定项目的增加，测定方法的简化，同工酶测定将在诊断疾病、判断疗效和预后方面起着愈来愈大的作用。第二节　临床诊断中常用的血清酶类及其同工酶上一节介绍了血清中酶浓度变化的机制以及在判断血清中酶测定结果的意义时必须注意的一些事项，但在具体应用各种酶测定来诊断疾病时，还各有其特点。临床医师多从疾病出发，将酶测定结果和其它各种检查结果综合起来，分清主次，辨证地加以应用；对一个检验医师而言，单从这方面考虑显然是不够的，还应对具体每个酶有一个较全面的了解，这样才能为临床提供咨询，解释好各项测定的临床应用价值。本节以常用的具体酶为中心，系统介绍该酶在临床论断中的应用，包括该酶的作用、性质特点、组织分布与其临床应用价值。一、肌酸激酶（CK）及其同工酶肌酸激酶（CK）催化下列反应：以前临床常习惯将此酶称为肌酸磷酸激酶（CPK），此名称不确切，目前国外已摒弃不用。此反应逆向反应速度约为正向反应速度6倍，与大多数激酶一样，Mg2+为它的辅基，需双硫键维持酶的分子结构。测定酶活性时必须加入巯基化合物，N-乙酰半胱氨酸（NAC）是目前最常用的激活剂。CK作用生成的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源，在3种肌组织和脑组织中含量最高。CK是由两种不同亚基（M和B）组成的二聚体，这样正常人体组织常含3种同工酶，按电泳速率快慢顺序分别为：CK-BB（CK1），CK-MB（CK2）和CK-MM（CK3）。除细胞质外，在心肌、骨骼肌和脑等组织细胞的线粒体内还存在另一种结构不同的CK，它也是二聚体，常简写为CK-MiMi，电泳时速度最慢，故命名为CK4。【组织分布】CK主要存在于骨骼肌、心肌、脑组织中，此外还存在于一些含平滑肌的器官如胃肠道，子宫内。而在肝、红细胞中含量极微或者没有。骨骼肌无论在每克组织含量（328U/G湿重）还是绝对含量上都大大超过其它组织和器官。其中主要为CK-MM，不含CK-BB，仅有少量CK-MB（＜3％）。心肌中CK虽只有骨骼肌的1/10（313U/G湿重），但CK-MB占CK总量的14％-42％，这在人体中是绝无仅有的。脑组织以及其中含平滑肌器官中的CK则几乎全部是CK-BB，它同时也是人胚胎中CK的主要存在形式。【生理变异】年龄、性别和种族对CK含量都有一定影响。新生儿CK常为正常成年人的2-3倍。可能与分娩时骨骼肌损伤和缺氧有关，过6-10周可逐步下降接近成年人值。CK含量和肌肉运动密切相关，其量和人体肌肉总量有关，男性参考值高于女性可能与这点有联系。国外调查，白种男性CK均值只为黑种人的66％，可能与种族有关，但也不排除两个人种之间体力劳动的差别。【标本的采集、处理和贮存】虽然红细胞中不含CK，但含有大量腺苷酸激酶（AK），目前常用的测CK的酶偶联法的反应体系中含有ADP。AK催化下列反应：生成的ATP在指示酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下，可使NAD+生成NADH，340nm处吸光度升高，引起CK人为地升高。为去除AK的干扰，不少试剂盒中加入AK的抑制剂二腺苷-5-磷酸（DAPP）和AMP。但也有些试剂中未加入DAPP，此时溶血标本将产生明显干扰。除肝素外，其它常用抗凝剂都能抑制CK活性。如不能及时测定，可将血清放冰箱贮存，－20℃中可长期保存。【参考值范围】成年男性参考上限为180U/L（37℃），女性为130U/L（37℃）。正常血清中用电泳法查不到CK-BB，CK-MB不超过5％，如用免疫法测CK同工酶，依方法不同结果有异，可参考有关文献。【临床应用】CK及其同工酶是目前世界上临床测定次数最多的酶，80年代初期统计分别达一亿次和一千万次。这是因为CK在骨骼肌、心肌和脑疾患时常明显升高，如同时测定同工酶还有助于疾病的鉴别诊断。表7-4是各种疾病时CK的变化。此酶测定主要用于早期诊断AMI和判断溶栓治疗的疗效以及判断疾病预后，特别在无Q波型AMI，此时心电图无Q波变化，常需其它检查来协助临床医师诊断和鉴别诊断AMI。目前有些国外学者认为在诊断AMI不需要同时作许多酶，只要单测CK一项即可。这是因为：⑴心肌细胞含有大量CK：按每克组织含酶量计算，CK超过天冬氨酸转氨酶（AST，即谷草转氨酶）和乳酸脱氢酶（LD）等。所以当发生AMI、心肌细胞坏死时，释放出来的CK量超过其它酶。⑵CK由于分子量不大，而且大量存在于胞质中，所以在各种酶中最早进入血液：一般在AMI后4-8小时就可能超过参考值上限。LD由于分子量大（约为125000），故增高明显迟于其它酶。同样线粒体中的酶，如线粒体AST在血中浓度升高明显推迟。表7-4 总CK和CK同工酶在疾病时的变化疾病总CKCK同工酶急性心肌梗死（AMI）常用酶中CK增高最早（4-8h），24h达峰值，2-3d恢复正常，中度升高，常在3000U/L以下诊断AMI“金标准”（＞6％），增高稍早于总CK（？），2-3天恢复正常心肌炎（病毒性，风湿性）急性期轻度升高，可达5倍正常上限CK-MB可增高增心导管，冠状动脉造影可有中度升高一般无变化运动试验）可轻度升高CK-MB正常肌肉损伤（挫伤、手术，肌注药物、癫痫、酒精和毒素中毒，过度运动）升高程度和损伤程度有关，严重病例可达10000U/L以上，肌注药物引起CK升高，一般不超过正常上限2倍，持续不超过一天主要为CK-MM升高，CK-MB绝对值虽可升高，但百分比＜6％肌萎缩（Duchenne和Becker型）有症状患者CK可达50倍正常上限，女性携带者CK可为3-6倍正常上限，可查CK以筛选携带者有些患者也可出现CK-MB升高多发性肌炎与肌炎CK明显增高主要为CK-MM高神经性肌肉疾患CK正常无变化脑血管意外（脑出血，脑血栓）部分患者血中和CSF中CK升高CK-BB可增高恶性肿瘤约10％病例CK-BB升高甲状腺功能低下可高达50倍正常上限主要累及CK-MMReye综合征明显升高可在达70倍正常上限主要为CK-MM降卧床患者程度不等地下降主要为CK-MM甲状腺功能亢进程度不等地下降主要为CK-MM低激素治疗个别患者可下降主要为CK-MM变Ⅰ型巨CK血症电泳位于CK-MB和CK-MM之间可能是CK和IgA，或IgG复合物异Ⅱ型巨CK血症电泳位于CK-MM后面，为线粒体CK和其聚合体（3）由于CK主要存在于肌肉组织中，其它脏器如肝、肾、血细胞中含量极微：在诊断AMI时，其特异性远比一般代谢酶如LD、AST等为高，特别是溶血标本对CK测定结果影响较小。近年来国内外使用动态法测定酶活性，大大提高了CK测定的准确性和重复性，并且可以在很短时间（约5分钟）测定完毕，特别适合于急诊患者。但CK测定的局限性也很明显，由于CK大量存在于3种肌肉组织中，尤其是骨骼肌中CK含量不论按浓度含量或按全身总量计算都大大超过心肌。因此骨骼肌局部或全身疾病都很容易引起血中总CK活性升高。血CK的极度增高主要见于全身疾病。曾有一例横纹肌溶解症患者，血中CK含量高达100000U/L，而在AMI时，就是大面积梗死，血中CK含量也很少超过3000U/L。肌注某些药物也可能引起CK一过性升高，但一般不超过正常上限值的2倍，持续时间不超过1天。因此国外有些医院将CK参考值上限的2倍作为诊断AMI的判断值，以减少假阳性。尽管CK测定诊断AMI的灵敏度很高，但特异性却明显偏低，其假阳性率达15％-30％。CK在体内的半寿期明显比其它酶短，心肌组织一次梗死后，CK急剧升高并很快恢复正常（48-72小时），这样在亚急性心肌梗死时CK可能正常，但其它酶如AST，特别是LD很可能居高不下。以往对CK诊断AMI常强调下列几点：①AMI发病后8小时内查血CK不高，不应轻易除外AMI诊断，并以此结果作为基础值，和以后测定值作比较，任何怀疑AMI者应尽早抽血送检；②发病后24小时CK测定结果临床意义最大，因为此时正当CK的峰值时间，如不超过正常值上限可排除AMI诊断；③发病后48小时内应多次测CK活性，如不出现一个典型升高和下降的过程，应怀疑AMI的诊断。近年文献指出，某些AMI患者血中CK可以不超过正常值，特别是不超过参考值上限的2倍，这些病例又多见于无Q波心肌梗死。长期以来认为CK峰值高低对AMI预后判断有一定价值。CK-MB由于大量存在于心肌组织中，其它组织和器官中含量很少，所以CK-MB是目前诊断AMI的一个极其可靠的生化指标，特异性可达95％乃至更高。一般认为其灵敏度比CK总活性稍差，但也有文献报道，约有12.5％AMI患者总CK不高，但CK-MB超过正常。CK-MB测定方法和试剂盒很多，同一标本不同实验室往往结果不同。从测定原理来分，可分为测酶活性与酶质量两大类方法。第一类方法先用物理、化学和免疫等各种手段将CK-MB和其它同工酶分开，然后根据酶的催化活性测CK-MB浓度，用活性单位/升（U/L）或百分比报告结果。测酶质量方法则是利用CK-MB的抗原性，根据抗原抗体反应测CK-MB酶蛋白浓度，单位为μg/L。两者结果有时不一致，因为如酶变性失活但仍保留抗原性，此时用测酶活性的方法结果不高，但用测质量方法可以增高。80年代早期德国学者根据此结果认为AMI患者血中存在着灭活的CK。但最近用改进方法测CK-MB，发现两法差异不大。国内普遍使用测酶活性方法，目前较多使用电泳方法分离CK-MB。电泳法特点是准确可靠，当出现一些异常同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等，从电泳图谱上很容易发现，并可通过光密度计进行定量测定，不会将CK-BB和各种异常同工酶误认为是CK-MB而误诊。其主要缺点是灵敏度较差。近年来国内一些单位用免疫抑制法测CK-MB，其原理为抗M亚单位的抗血清可以和CK-MM及CK-MB中的M亚单位形成抗原抗体复合物，从而完全抑制M亚单位的酶活性，因为正常血清中几乎无CK-BB，故将此值乘以2可以认为大致代表CK-MB的活性。此法简单迅速，缺点是特异性差，如患者血清中还存在着CK-BB或者异常CK时，都将出现假阳性。故可作为过筛试验，如有疑问时用电泳法核实。另外此法正常值明显高于其它方法。如Sclavo公司试剂盒的正常值为18U/L，而电泳等其它方法都是＜5U/L。有人认为这是因为CK-MM还可以进一步分为若干亚型，一般抗MM血清对MM3抑制较好，但对MM1抑制较差，而正常情况下血中MM亚型的存在以MM1为主，故导致正常值明显偏高。AMI第一天血中以MM3为主，但第二天以后则以MM1为主，因此使用此类方法诊断AMI和解释结果时应谨慎。国外从80年代初建立了多种测CK-MB酶质量的方法。应用最多的是美国Hybriteeh公司的ELISA方法，正常人在5μg/L以下，此法结果和电泳法相关良好。缺点是测定时间长达半天，只适合成批标本。近两年来应用单克隆技术制备出特异性极高的只和CK-MB作用的抗血清，并已有多种试剂盒供应。最近Deerson以CK-MB≥10μg/L以及CK-MB指数≥3.0（μg/UCK×100）为AMI诊断标准。CK-MB单克隆抗体方法简单，特异性高，是目前重点发展的方法，近来有人认为此法有助于不稳定型心绞痛的诊断，可惜国内应用不多。CK-MB的局限性在于骨骼肌损伤时也可能释放出一定量的CK-MB。虽一般认为骨骼肌含有的CK-MB在总CK中不超过5％，但也有例外。Evans报道1例横纹肌肉瘤的CK-MB高达274U/L，占总CK的28％。因此当CK-MB增高时，临床也应考虑有无非心肌来源的可能性。骨骼肌中有大量CK，所以CK明显升高（3000U/L）大都见于肌肉疾病。此时CK测定用于鉴别肌萎缩病因，如Duchenne型和Becker型肌萎缩患者，常在临床前期血中CK就可中度和高度增加。该病是伴性遗传，在75％女性Duchenne型肌萎缩携带者和50％女性Becker型肌萎缩携带者血中也可查到CK升高。此外各种原因（病毒，细菌和寄生虫）引起的肌肉感染性疾病都能引起CK升高。但由于神经疾病引起的肌萎缩症，CK常不增高。脑中虽含有较大量CK，脑血管意义时有大量CK释放入组织间隙，但由于血脑屏障存在，只能在部分病例中查到血中和脑脊液中CK升高，以及出现CK-BB，但阳性率不高，这妨碍了CK在这方面的临床应用。人胚胎期主要为CK-BB，有人根据“癌胚”理论，提出CK-BB可作为肿瘤标记物，可惜的是阳性率不高，只占恶性肿瘤的10％左右。二、乳酸脱氢酶（LD）及其同工酶乳酸脱氢酶（LD）酶催化下列反应：不同方法测出LD结果差异较大，这是因为LD有5种不同的同工酶，每种同工酶的最适反应条件不同。例如同为催化乳酸变为丙酮酸，LD1的最适pH为9.8，而LD5的最适pH为8.8。很难找出一个测定血清总LD的最适条件，检验医师在解释测定结果时应加以注意。LD催化反应是无氧糖酵解的最终反应，广泛存在于人体各组织中，故测总酶临床意义不大，但LD是由两种不同亚基（M，H）组成的四聚体，形成5种结构不同的同工酶，其中H型亚基中酸性氨基酸较多，电泳时负电荷多，因此电泳速率较快。按电泳向阳极泳动快慢，分别命名为LD1（H4），LD2（H3M），LD3（H2M2），LD4（HM3）和LD5（M4）。【组织分布】LD虽广泛存在于人体各组织中，但是不同组织中同工酶组成有差异，大致可分为三类：一类以LD1为主，心肌为此类代表，LD可占总酶活性50％以上，此外有红细胞等。另一类以LD5为主，以横纹肌为代表，此外有肝脏等。第三类以LD3为主，脾、肺为此类代表。LD主要存在于细胞质中，线粒体中未查到。【生理变异】血清LD高低和性别关系不大，婴儿酶活性可达成年人两倍，儿童和少年活性比成年人高10％-15％，血清LD同工酶目前常用电泳法测定，由于具体方法差异，各学者报告的结果出入较大，但在成年人存在着如下规律：LD2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5，值得注意的是有学者报告，部分正常儿童血中LD1可大于LD2。【标本的采集、处理和贮存】由于血小板中也含大量LD，血清中和血浆所测LD有一定差异，一般都选用血清为测定标本，采血后应迅速分离血清，因红细胞中LD含量比血清高100倍以上，不宜用溶血血清为测定标本。LD尤其是LD4和LD5与其它酶不同，不是热变性而是冷变性，在4℃贮存活性下降快于室温25℃，一般说25℃放2-3天LD活性变化不大，有条件者最好还是在采血后24小时内测定，标本应贮存于室温。【参考值范围】根据催化反应方向的不同，有两大类测LD方法，一大类为国际临床化学协会（IFFC）推荐方法，以丙酮酸为底物，其参考值范围为80-500U/L（37℃）；另一大类以乳酸为底物，在我国应用较普遍，其参考值范围为50-150U/L。【临床应用】LD及其同工酶是临床上常用酶之一，尤其是LD同工酶和CK-MB是临床常规实验室最常测的两种同工酶。临床常用于诊断和鉴别诊断心、肝和骨骼肌的疾病。表7-5是LD及其同工酶在这些疾病时的变化情况。表7-5 总LD和LD同工酶在疾病的变化疾病总LDLD同工酶AMI常测酶中，升高最慢（8-10h），但升高时间最长（5-10d），峰值可达10倍正常上限LD1＞LD2，并可持续到两周（部分病例总LD正常）充血性心衰，心肌炎可升高达5倍正常上限LD1＞LD2增巨细胞性贫血可升高达5倍正常上限，治疗正确迅速下降LD1＞LD2病毒性肝炎部分病例可升高达5倍正常上限LD5＞LD4（部分病例总LD正常肝硬化常轻度升高LD5明显升高，LD5＞LD4高原发性肝癌部分病例升高LD5明显升高，LD5＞LD4梗阻性黄疸不定常LD4＞LD5肌肉损伤视损伤程度不同而异以LD5升高为主肌萎缩可高达10倍正常上限以LD5为主某些恶性肿瘤（白血病，结肠癌……）可升高，个别病例高达5倍正常上限以LD3为主，LD3＞LD1变异某些病倒，电泳出现LD6，常显示预后不佳实用中此酶用于诊断AMI，特别是亚急性AMI。在AMI时，LD由于分子量较大（125000），在常用酶中升高最迟，但其半寿期较长，增高持续时间可达5-10天，此时其它酶活性已恢复正常，在亚急性AMI诊断上有一定价值。可惜的是，LD总酶诊断AMI的特异性较差，很多其它疾病，此酶都升高。LD同工酶则不同，诊断特异性可达95％以上，仅次于CK-MB，甚至有学者认为，只要测此二同工酶，不需作其它酶学检查就可诊断AMI。LD同工酶的高特异性是因为人体各组织器官中LD同工酶的分布情况并不相同，除心肌外，只有少数器官如红细胞中的LD是以LD1为主，绝大多数的AMI患者血中的LD同工酶都可出现LD1＞LD2变化，即所谓的“反转”（flip）类型变化，其持续时间甚至可超过总LD升高时间，达两周之久。临床上可见部分患者在恢复期，所有酶活性都降至正常，但仍有“反转”类型的LD同工酶变化，这些患者常有复发倾向，除AMI和心肌损伤，此种“反转”类型变化还见于溶血性贫血和巨细胞性贫血，但此类疾病在临床上不难与AMI相区分。60年代临床上曾经用过所谓“α-羟丁酸脱氢酶”的测定来诊断AMI。实际上并不存在这种酶，所测的主要是LD1的活性，目前国外已较少测定此酶而改用更精确的测LD同工酶的方法。其次，LD及其同工酶常用于肝脏疾病的诊断和鉴别诊断，由于肝细胞中主要为LD1，在肝实质病变时常出现LD5＞LD4，但由于正常血清中LD5含量很少，不少病例就是出现同工酶异常LD5＞LD4时，总LD活性仍为正常，故LD同工酶检查阳性率远高于总LD，一般在胆道疾患或梗性黄疸早期未累及肝实质时，不出现LD5＞LD4，仍为LD4＞LD5。值得注意的是，在骨骼肌疾病和损伤时，也会出现类似变化，临床上诊断各型肌萎缩也常测定LD及LD同工酶，早期常为LD5升高，但在晚期LD1和LD2也升高。恶性肿瘤可由于肿瘤细胞恶性增长和坏死而引起血清LD升高，如转移到肝脏往往伴有LD4和LD5升高，此外一部分肿瘤，如白血病等常有LD3和LD4的增高。三、氨基转移酶（ALT，AST）及其同工酶氨基转移是氨基酸代谢中基本生化反应之一，在机体内存在着多达60种氨基转移酶，丙氨酸基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）是其中最重要的两种。ALT催化下列反应：AST催化下列反应：它们都需要磷酸吡哆醛（维生素B4）为辅基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白称为脱辅基酶蛋白，没有催化活性。血清除含有有活性的全酶外，还有部分不含磷酸吡哆醛的酶蛋白，如在测定前，先加入足量磷酸吡哆醛，所测血清转氨酶活性常有明显升高。AST有两种受不同基因控制的同工酶分别存在于细胞质（c-AST）和线粒体（m-AST）中，而一般认为ALT不存在同工酶，我国学者证实在人组织和血清中也存在类似AST的两种同工酶，即细胞质ALT（c-ALT）和线粒体ALT（m-ALT）。【组织分布】AST广泛存在于多种器官中，按含量多少顺序为心脏、肝、骨骼肌和肾，还有少量存在于胰腺、脾、肺及红细胞中，肝中AST大部分（70％）存在于肝细胞线粒体中。ALT也广泛存在于多种器官中，含量最多的不是心脏，而是肝，顺序为肝、肾、心、骨骼肌等，与AST相比，在各器官中含量都比AST少，肝中ALT绝大多数存在于细胞质中，只有少量在线粒体中。【生理变异】此二酶生理变异较小，性别、年龄、进食、适度运动对酶活性无明显影响，每天虽有生理性波动，但无统计学意义。表7-6 ALT和AST在疾病时的变化疾病ALTASTAST/ALT病毒性肝炎随不同病期和严重程度而异，常明显升高，可达10-100倍正常上限同ALT，但程度没有ALT明显，恢复到正常早于ALT＜1.0重症肝炎不超过20倍正常上限，出现“肝疸分离”增高程度常超过ALT＞1.0肝硬化变化不定，常轻度增高同ALT，但增高程度常超过ALT＞1.0右心衰竭合并肝溢血正常或轻度升高，个别可高达10倍正常上限增高程度常超过ALT＞1.0梗阻性黄疸变化不足，常不超过5倍正常上限同ALT不定，常＜1.0Gilbert综合征无变化无变化溶血性黄疸无变化无变化AMI正常或轻度升高明显升高，与CK和LD相比，无何优点＞1.0心肌炎正常或轻度升高急性期可轻度升高＞1.0肌肉损伤正常或轻度升高可高达2-5倍正常上限＞1.0肌萎缩明显上升，可达8倍正常上限同ALT＞1.0【标本的采集、处理和贮存】红细胞中AST和ALT分别为血清含量的15倍与7倍，所以明显溶血标本不宜测此二酶。宜采用血清为测定标本，此二酶在4℃冰箱中贮存一周，活性无明显变化，最好不要冰冻，因为在融冻时很容易破坏酶的活性。【参考值范围】一般临床使用方法中不加入磷酸吡哆醛，其参考值范围较加入磷酸吡哆醛的为低，ALT为5-40U/L（37℃），AST为8-40U/L（37℃）。【临床应用】根据此二酶在人体器官中分布情况，临床医师习惯将ALT用在诊断肝脏疾病，测定AST诊断AMI。在AMI时，不论在出现升高时间，还是升高持续时间，其变化介于CK和LD之间，无特殊价值，随诊断AMI的新试验日益增多，国外已建议不用。ALT在AMI时一般不增高或轻度增高，明显升高常说明有右心衰竭合并肝淤血，m-AST变化比总酶更慢，但其增高程度与坏死病变程度密切相关，是判断AMI预后的一个很好指标。目前转氨酶测定主要用于肝胆疾病的诊断和鉴别诊断。ALT是我国目前测定次数最多的酶，假如能同时测定AST，并计算出文献上常提到的Deritis比值，即AST/ALT之比，在诊断和鉴别诊断上将是很有用的。（一）丙氨酸氨基转移酶（ALT）以前常简称GPT，近年来国外多以ALT为此酶缩写。ALT是我国测定次数最多的酶，这是因为我国肝炎较多，而肝是含ALT最丰富的器官，且大部分存在于肝细胞的胞质中。肝炎时，细胞膜通透性增加，由于肝细胞中ALT浓度约比血清高7000倍，只要有1/1000的肝细胞中的ALT进入血液就足以使血中ALT升高1倍，故此酶是肝损伤的一个很灵敏指标。肝炎时早在黄疸前期就升高，峰值可达数千单位，为正常上限的百余倍。一般而言在急性肝炎时，血清ALT活性高低与临床病情轻重相平行，又由于ALT半寿期较长，往往是肝炎恢复期最后降至正常的酶，是判断急性肝炎是否恢复的一个很好指标。此外在慢性肝炎特别是慢性活动性肝炎ALT也经常升高。因此临床医师对急慢性肝炎患者经常检查ALT并据此诊断和判断病情。应注意两种情况，重症肝炎时由于大量肝细胞坏死，此时血中ALT可仅轻度增高，临终时常明显下降，但胆红素却进行性升高，即所谓的“胆酶分离”，常是肝坏死征兆。另一种情况是少数人血清中ALT长期持续升高，肝穿无明显病理改变，预后良好，对此现象目前仍在研究之中。肝炎时ALT常有明显变化，但不能反过来认为凡ALT升高者就有肝炎，其它肝胆疾病如胆石症、胆囊炎、肝癌和肝淤血时也可升高。由于肝脏以外不少器官也含有ALT，因此在AMI、多发性肌炎、急性肾盂肾炎等患者血中ALT也可升高，但一般而言，这些疾病ALT升高很少超过正常上限10倍，常以400U/L为界，超过此值绝大多数可诊断为肝炎。但也有例外，有人报告个别肝淤血、胆石症等患者可超过此界，但在这种情况时，ALT变化往往很快，过几天复查，ALT就可降至400U/L以下。（二）天冬氨酸氨基转移酶（AST）以前常简称GOT，现多以AST为缩称，既往认为AST主要存在于心肌中，主要用于诊断AMI。但目前由于AST在AMI时升高迟于CK，恢复早于LD，故诊断AMI价值越来越小，国外不少学者认为诊断AMI，完全可以不测AST。另一方面肝中AST含量虽低于心肌，但绝对含量（U/mg）仍高于ALT。肝中AST和ALT含量比值约为2.5：1.0。只是由于ALT主要存在于细胞质中，AST主要存在于线粒体中，病变较轻的肝脏疾病如急性肝炎时血中ALT升高程度高于AST，但在慢性肝炎，特别是肝硬化时，病变累及线粒体，此时AST升高程度超过ALT。故在国外对疑是肝炎患者常同时测AST和ALT，并计算AST/ALT比值，正常约为1.15，急性肝炎第1、2、3和4周分别为0.7、0.5、0.3和0.2。如比值有升高倾向，应注意有无发展为慢性肝炎可能，慢性肝炎时可升到1.0以上，肝硬化时可达2.0，此比值对判断肝炎的转归特别有价值。四、碱性磷酸酶（ALP）碱性磷酸酶（ALP）是指一组底物特异性很低，在碱性环境中能水解很多磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。近年为认为ALP真正作用是将底物中磷酸基团转移到另一个含羟基基团化合物上，磷酸乙醇胺有可能是ALP在体内作用的底物。ALP确切的生理作用目前仍不十分清楚，一般认为骨中ALP和骨的钙化作用密切相关，成骨细胞中的ALP作用产生磷酸，与钙生成磷酸钙沉积于骨中。ALP还广泛存在于肝细胞血窦侧和胆小管膜上、肾近侧曲管刷状缘和小肠粘膜的微绒毛，据此推测它可能还与物质的吸收和运转过程有关。各器官的ALP在理化性质都有些差异，临床上长期认为存在着肝、骨、小肠和胎盘等ALP，在病理时还可能出现“高分子”ALP，以及一些和肿瘤有关的变异ALP，如Regan、NagaoALP等。深一步研究发现这些ALP主要受3个基因位点控制，相应生成3大类ALP，即小肠、胎盘和组织非特异ALP，后者包括临床上所谓的骨、肝、肾等组织器官，它们的氨基酸结构类似，抗原性无差别，这些酶电泳速率和对不同抑制剂反应差异来自ALP中所含糖基的不同。【组织分布】ALP广泛存在于机体各组织器官中，按每克湿组织ALP含量多少排列，顺序为肝、肾、胎盘、小肠、骨等。【生理变异】总论中已经提到ALP变化与年龄密切相关，简言之，新生儿ALP略高于成年人，以后逐渐增高，在1-5岁有一次高峰，可达成年人上限2.5-5倍，以后下降，到儿童身长增高期又再次上升，第二高峰在10-15岁之间，可达成人上限4-5倍。20岁后降至成年人值，到老年期又轻度升高，可能与生理性的激素变化有关。孕妇血清ALP在妊娠3个月即开始升高，9个月可达峰值，约为正常值的2倍，ALP升高可维持到分娩后1个月，升高的ALP来自胎盘，和胚泡壁的细胞滋养层的发育程度直接相关。高脂餐后，血清ALP活性升高，尤以血型为O型或B型的分泌型（唾液中可分泌血型抗原者）人群更为突出，增高的ALP多为小肠ALP。【标本的采集、处理和贮存】为避免脂肪餐的影响，宜空腹采血，除肝素外，其它常用抗凝剂可与Mg2+作用，引起ALP活性下降。最好用血清为测定标本，红细胞膜上有ALP，明显溶血标本会干扰测定结果。ALP在室温和冰箱放置后，活性逐渐升高，可增加5％-10％。冷冻血清融冻后，其中活性开始偏低，以后慢慢升高。所以应在采血当日就测定ALP活性。目前常用的冻干质控血清，复溶后ALP活性常有一个活性升高过程，有些制品复溶24小时后，活性可升高50％-100％，使用时应加以注意。【参考值范围】ALP测定结果与所用方法种类和测定温度密切相关，就是同一底物，因缓冲液不同，其结果可有2-3倍差异，目前国内应用较多的方法中以磷酸对硝基酚为底物，2-氨基-2-甲基丙醇为缓冲液，在37℃测定时，成年人参考值范围为20-110U/L。ALP在不同年龄人群中有较大差异，在以上有关章节中已加以论述，解释结果时必须加以注意。国外文献指出ALP虽然有较大的人群差异，但是个体间差异很小。有条件应将测定结果与被测者的“正常值”进行比较。【临床应用】ALP早在本世纪30年代就用于临床，是临床医师非常熟悉的酶之一，在70年代前ALP是世界上临床测定次数最多的酶，主要用于骨骼和肝胆系统疾病的诊断和临床鉴别诊断，可参见下表：表7-7 碱性磷酸酶在疾病时的变化（缺）ALP和骨化过程密切相关，很多骨骼疾病如变形性骨炎（Paget病）、副甲状旁腺功能亢进、佝偻病、软骨症、原发性和继发性骨肿瘤、骨折和肢端肥大症的患者血中ALP都可升高，尤其是变形性骨炎，增高非常明显，可达正常上限值的50倍。此病在我国少见，我国常用于早期诊断佝偻病和软骨病，ALP升高早于血钙、磷变化以及X线检查，是一个很灵敏的诊断指标，但应注意骨质疏松患者血中ALP一般都在正常范围内。目前ALP测定主要用于黄疸的鉴别诊断，阻塞性黄疸时血清ALP常早期明显升高，甚至可达正常上限值的10-15倍，在完全阻塞性黄疸病例中，80％病例血中ALP超过正常上限5倍。一般而言血清ALP持续低于正常上限值2倍时，阻塞性黄疸可能性较小，肝性黄疸时ALP轻度升高，一般不超过正常上限的2-3倍，约有半数原发性肝癌血中ALP升高，升高程度也常较明显，甚至可达正常上限值的15-20倍。如在无黄疸肝脏疾病人血中发现有ALP升高应警惕有无肝癌可能。ALP升高还可见于其它疾病，如急慢性胰腺炎、慢性肾衰、肠梗塞、肺梗塞等疾病，但无太大临床价值，某些药物如孕激素、雌激素、胎盘白蛋白等也可引起血中ALP升高。血ALP下降见于甲状腺功能低下、恶性贫血和遗传性碱性磷酸酶减少症等。五、γ-谷氨酰基转移酶及其同工酶γ-谷氨酰基转移酶（GGT）是一种底物特异性不高的酶，可作用于一系列含谷氨酰基的化合物。在体内可能催化下列反应：由于有多个多肽参与反应，历史上曾命名为γ-谷氨酰基转肽酶，简写为GGTP。本酶为含SH基的糖蛋白，其生理功能尚不十分清楚。Meister认为细胞外游离氨基酸需通过γ-谷氨酰基循环的一系列生化反应方能进入细胞，位于细胞膜上的本酶起关键作用，与组织中氨基酸和肽的分泌吸收，合成过程有关。不同器官GGT的理化性质有差异，用琼脂糖电泳可将GGT分为四个区带。但目前认为控制GGT的基因位点只有一个，上述差异是由于酶蛋白中糖基组成不同而引起。【组织分布】人体各器官中GGT含量按下列顺序排列：肾、前列腺、胰、肝、脾、肠、脑等。大部分酶与细胞的膜结构结合，例如在肝细胞胆管侧的细胞膜上。虽然此酶在肾脏含量最高，学者相信血清中GGT主要来自肝脏。【生理变异】年龄与妊娠与否对GGT影响不大，不似ALP常明显升高，如同时测此二酶，有助于临床医师判断肝脏是否有病变。男性血中GGT含量明显高于女性，可能与前列腺有丰富的GGT有关。酗酒会引起GGT明显升高，升高程度与饮酒量有关，诊断疾病时必须排除这一因素。【标本的采集、处理和贮存】GGT是一个比较稳定的酶，室温中2天、4℃放1周活性无变化，-20℃可储存1年，红细胞中GGT含量很低，溶血对本酶测定干扰不大。【参考值范围】以γ-谷氨酰-3-羧基-4-对硝基苯胺和双甘肽为底物的动态法，在37℃测定，成年男性的参考值为7-56U/L，成年女性为0-30U/L。【临床应用】GGT在疾病时的变化可参阅表7-8：表7-8 γ-谷氨酰基转移酶在疾病时的变化增高无变化胆道疾病明显增高，可达5-30倍正常上限骨疾患（胆石症、炎症）阳性率高，为85％-93％妊娠肝实质疾病（肝炎，肝硬化）轻度增高，可达2-5倍正常上限肝癌（原发，继发）明显增高且阳性率高诱导作用轻度升高，停药后降至正常（乙醇，苯巴比妥，抗抑郁药，抗癫痫药，含雌激素避孕药GGT测定在我国临床应用很广，可能是因为我国肝脏疾病发病率高，而GGT又是肝胆疾病中阳性率最高的酶。德国内科学会通过对13000例肝胆患者调查，发现95％病例GGT升高，其次才是ALT，阳性率为83％，第三位是胆碱酯酶，如同时测此三种酶，阳性率可达99％。胆道疾病如胆石症、胆道炎症、肝外梗阻时，GGT不仅阳性率高，而且升高明显，可高达正常上限的5-30倍，肝脏实质疾病如肝炎、脂肪肝、肝硬化时GGT一般只是中度升高（2-5倍），这点有助于肝胆疾病的鉴别诊断。GGT又是诊断恶性肿瘤有无肝转移的一种很有用的试验，肿瘤患者如GGT升高常说明有肝转移可能。当ALP升高时，同时测GGT有助于鉴别ALP的来源，如GGT正常说明此时ALP升高常来自肝外的器官，如骨骼疾病等。临床在使用GGT时一定要注意它是一种诱导酶，不少药物能使血中GGT活性升高，如巴比妥类药物、抗癫痫的苯妥英钠、抗抑郁症的三环化合物、抗热解痛类的对乙酰氨基酚可引起GGT升高；抗凝药香豆素、含雌激素的避孕药以及治疗血脂升高的氯贝丁酯（法脂乙酯）都可引起GGT轻度升高。还有酗酒可使其升高，这些因素限制了此酶的应用价值。医师在应用此酶诊断疾病时，必须先除外这些非病理因素引起GGT增高的可能，国外有些国家由于酗酒人多，以致不测或少测此酶。六、淀粉酶（AMY）及其同工酶AMY对食物中多糖化合物的消化起着重要作用。作用于多种糖化合物，如淀粉、糖原等。它不同于植物中的β-淀粉酶，仅作用于多糖化合物的末端，α-淀粉酶可以随机作用于多糖化合物内部的α-1，4葡萄糖苷键，产生一系列分子不等的产物：糊精、麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖。AMY是一种需钙的金属酶，其最适pH在6.5-7.5之间，卤素和其它阴离子有激活作用（Cl-＞Br-＞NO3-＞I-）。其分子量较小，约55ku，易由肾脏排出，尿中AMY活性浓度常高于血。两个不同基因位点分别控制，并生成两种结构和抗原性有明显差异的AMY同工酶：一种由胰腺分泌，习惯上命名为胰腺淀粉酶（P-AMY）；另一种主要来自唾液腺，常命名为唾液腺淀粉酶（S-AMY），但并不意味着只有唾液腺产生此种同工酶，其它器官如肺、骨、卵巢和甲状腺也能生成S-AMY。【组织分布】机体中胰腺含AMY最多，由腺泡细胞合成后通过胰管分泌入小肠，唾液腺也分泌大量AMY入口腔开始消化多糖化合物，此外AMY还见于卵巢、肺、睾丸、横纹肌和脂肪组织中，在某些肺癌和卵巢癌患者中可查到AMY升高，且主要为S-AMY，肝中AMY很少乃至没有。【生理差异】成年人血中AMY与性别、年龄、进食关系不大，新生儿AMY缺乏，满月后才出现此酶，逐步升高，约在5岁时达到成人水平，老年人AMY开始下降，约低25％。尿AMY浓度由于受尿液浓缩或稀释的影响，随意留尿测定AMY的诊断价值受到一定限制，国外学者多建议留6小时或24小时尿液测其AMY总含量更为可靠。【标本采集、处理和贮存】有些实验室常用血浆作为标本测AMY，这样可以更快地报告结果。但由于AMY为需钙酶，大多数常用抗凝剂都将抑制AMY活性，还是以血清为标本较好。收集标本时必需注意避免唾液的污染，否则将引起假阳性。AMY是一种很稳定的酶，室温中一周，4℃几个月酶活性都无变化。【参考值范围】国内大多数实验室仍使用苏木杰（Somogyi）的碘-淀粉呈色法，由于各实验室所用水解淀粉来源不同，不同实验室所测结果有所差异，但大多数血AMY都在200苏氏单位以下。愈来愈多临床实验室使用人工合成基质，在自动生化分析仪上测定AMY，但目前尚无成熟的AMY推荐法，不同厂家出的试剂盒由于所用基质不同，结果很难一致，其参考值范围可参考各厂家说明书。【临床应用】临床上测定血清AMY主要用于诊断急性胰腺炎，此酶常在腹痛后2-12小时升高，20-30小时达到高峰，一般为正常上限值的4~6倍，最高可达40倍。此值的高低和疾病预后关系不大，但此值愈高，急性胰腺炎的可能性就愈大，约在3-4天内AMY活性恢复正常。急性胰腺炎时尿AMY也增高，且持续时间更长，但由于尿浓度还受尿液浓缩稀释影响，很难定出正常和病理界限，定时收尿测排泄AMY总量，结果虽较可靠但收集麻烦。国外学者认为测尿AMY诊断价值很小。临床医师有时要求测胸水或腹水中AMY活性，如显著升高说明此时急性胰腺炎病变累及胸、腹腔。诊断急性胰腺炎时必需与其它急腹症相鉴别，可惜的是此时AMY也有不同程度升高，一般说来不超过正常上限的4倍或者500苏氏单位。此值常用作诊断急性胰腺炎的判断值，但也不是绝对的，个别急腹症患者AMY可超过此值，甚至达到2000苏氏单位。唾液腺疾病如腮腺炎患者血AMY也可升高，但临床上不难鉴别，且主要为S-AMY升高，有别于胰腺炎以P-AMY升高为主。国外报道在1％-2％人群中可出现巨淀粉酶血症，血中AMY和免疫球蛋白（IgG或IgA）形成大分子的复合物，临床化验特点为血中AMY持续升高，尿中AMY正常或下降。进一步检查可发现血中AMY分子量增高，此现象不和具体疾病有关，增高者也多无临床症状，注意应与病理性AMY升高相区分。七、酸性磷酸酶（ACP）及其同工酶酸性磷酸酶（ACP）是一组作用类似碱性磷酸酶的酶，不同点是最适pH偏酸，从pH4.5-7.0。本酶生理作用还不十分清楚，主要存在于细胞的溶酶体中，是溶酶体的标记酶之一，推测此酶参加细胞中的分解代谢。目前发现有4个不同的基因位点生成4类不同的同工酶，第一个基因位点生成前列腺ACP，其它组织仅有微量存在，有特异抗原性，用免疫学方法很易与其它ACP分开；第二个基因位点生成为溶酶体ACP，存在于细胞的溶酶体中；第三个基因位点生成为红细胞ACP，实际上不仅存在于红细胞中，还广泛存在于细胞质中；第四个基因位点生成ACP存在于破骨细胞和一些吞噬细胞，如肺泡的巨噬细胞，病理时还存在于高雪细胞和白血病的“毛细胞”中。【组织分布】它几乎存在于体内所有细胞中，虽然在细胞质中可找到ACP，但主要在于溶酶体，ACP主要组织来源是前列腺、红细胞和血小板。正常男性血清中1/3和1/2ACP来自前列腺，其余部分和女性血中ACP可能来自血小板或破骨细胞。【生理变异】男女性血中ACP含量无差异，新生儿ACP活性与成人相似，出生后1个月中血清酶活性甚高，然后随年龄的增长而逐渐下降，青春期又可出现一活性峰值，至20岁降至成人水平。【标本的采集、处理和贮存】常用抗凝剂抑制ACP活性，以血清为测定标本较好。ACP是常用酶中最不稳定的一个，尤其在37℃和偏碱性时灭活更快，此时放置1小时，酶活性可丧失50％，如将pH降至6.5以下，酶比较稳定。最简单方法可按1ml血清加入10％醋酸20μl酸化，此时酶在常温可稳定1天，4℃3天，－20℃稳定几个月。【参考值范围】不同方法参考值也不同，国外多推荐使用磷酸麝香草酚为底物的方法，因为前列腺ACP对此底物亲合度高，测定结果基本能反映ACP含量高低，此法参考值范围为0.5-1.9U/L，男女无差异。【临床应用】主要用于论断前列腺癌，由于酶不稳定，测定困难，目前正被其它前列腺癌标记物如前列腺特异抗原（PSA）所取代。第三节　缺血性冠状动脉疾病的酶学诊断缺血性冠状动脉疾病包括了心绞痛和急性心肌梗死（AMI）等疾病，其中AMI是西方发达国家主要死因之一。近年来随经济发展人们生活水平提高，此病在我国发病率明显增加，早期诊断、适当治疗对于减低此病死亡率和合并症是极其重要的。WHO在1997年提出诊断AMI三个方面的依据：即第一，临床表现和症状主要为胸部剧烈疼痛；第二，心电图上特异改变，如出现Q波；第三，血清中有关酶浓度出现升高下降的动态过程。一般认为患者具有三大表现中任何两项都可诊断为AMI。目前一些AMI患者可以缺乏典型胸痛症状，临床上称为寂静型AMI（silentAMI），国外文献认为此种类型约占1/4AMI患者。此类患者多见于老年人，尤其是糖尿病患者。另外一些AMI患者心电图检查查不到AMI特有的Q波，病理检查时这些患者的坏死病变不累及或少累及心脏外层，临床上常称为内膜下或非穿壁性心梗。目前更多使用“无Q波心梗”术语取代上述名词，其发病率约占总AMI的1/3，这样血清中有关酶浓度的动态变化对AMI诊断具有了较特殊价值，是诊断和鉴别诊断AMI的重要依据。图7-2 血清酶在单纯性AMI后的变化图7-2 是AMI患者血清酶浓度的典型变化图：从图7-2可以看到AMI时，任何酶变化都有一个延迟期，也就是说出现心肌梗死时虽然酶已释放到细胞外，但由于病变局部没有血液通过，释放的酶需经由系统缓慢进入血液，大约在4-8小时后，血清酶活性才开始超过参考范围的上限值。在常测酶中首先升高的是CK-MB，升高程度可高达参考值上限的10-25倍，由于骨骼肌中也含有少量CK-MB，但不超过5％，所以临床上更多地愿意用CK-KB占总CK的百分比（＜6％）来诊断AMI。CK-MM或者说总CK变化类似CK-MB，但升高和恢复正常都略迟，常在AMI发病8-12小时后才开始升高，24-48小时达到峰值，总酶升高持续7天，LD1持续时间更长达10天，升高程度较低，一般为参考上限的3-4倍。由于心肌中的LD主要为LD1，因此在理论上LD1诊断特异性更高，但这二者的测定都受到溶血干扰，轻度溶血就有可能引起血清LD和LD1非病理性升高，临床上应用此酶必须注意此点。在我国医院实验室，往往还将天冬氨酸氨基转移酶（AST）和羟丁酸脱氢酶（HBDH）和上述两种酶作为一组测定项目，用于论断AMI。但从图可以看出总AST测定对论断AMI毫无优点，当AST升高时几乎无一例外都伴有CK/或LD升高，如果考虑到AST还大量存在于其它器官，如肝、肌肉内，其测定特异性明显低于CK。至于HBDH实际上并不存在此种酶，所测的仍是LD的活性，只在当以酮丁酸取代丙酮酸为底物测LD活性时，LD1比其它同工酶对酮丁酸有更大活性，所测结果更能反映出LD1的活性。随着有更好方法，如电泳法、免疫法和化学抑制法测LD同工酶，已无必要再测定此酶以诊断AMI。随科学技术发展，人们对缺血性冠状动脉疾病的发病机制、分类和治疗有了进一步认识：冠状动脉粥样硬化开始于血管壁上出现富含胆固醇及其酯类的脂肪条纹，病变进一步增大成为粥样硬化斑（atheroma），斑块可以大部分阻塞血管内腔，限制血流，劳累后由于心肌供氧不足，引起心区疼痛，而在休息后或者用血管扩张药后得到缓解，这就是典型的稳定型心绞痛症状。斑块的变化是多种多样的，斑块可钙化变得僵硬和易碎，部分斑块可能进入血流引起下面小血管栓塞，在动脉壁上由于斑块脱落形成溃疡，血小板聚集在溃疡面，释放出强有力的血管收缩因子如TBX-2，有可能在血小板聚集基础上形成血栓，阻塞血流，引起供血障碍，心肌组织病变乃至坏死，出现典型的AMI症状。栓塞形成后，可能激活体内的溶栓系统活性，促使血栓溶解，血液又重新灌注（reperfusion），但此过程往往已在梗死发生后较长时间后才发生，此时心肌组织已经坏死，如果溶栓出现在心梗发生后6小时内，病变心肌组织有可能不坏死，病变转逆。目前治疗AMI广泛在早期应用溶栓药，如尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂等，防止心肌坏死形成瘢痕。这些新疗法的出现对实验室提出一些新的要求，如要求早期诊断AMI，用常规测酶方法常不易达到此要求，因为发病后4-6小时正相当这些酶的延迟期，CK同工酶亚型的发现为早期诊断AMI提供新的可能性。80年代以来发现CK同工酶MM和MB虽然都各由基因位点控制形成组织型的CK-MM3和CK-MB2，但它们释放入体液后在体液中羧基肽酶作用下，分解M亚基羧基端的赖氨酸，改变了MM3和MB2的等电点，可以进一步分为不同亚型（isoform），即CK-MM3可进一步变为电泳速度较快的MM2和MM1，CK-MB2变为MB1。正常血清中亚型含量分别为MM1＞MM2＞MM3，MB1＞MB2，但当AMI时由于组织型MM3和MB2大量释放入血，MM3/MM1和MB2/MB1，比值超过1.0，此变化明显早于CK和CK-MB升高。MB2/MB1在AMI发病后1.5小时达到峰值，MM3/MM1则在3小时达到峰值，Wu在最近提出早期诊断首选的是CK亚型和肌红蛋白，确诊Ami则仍以CK-MB以及最近提出的肌钙蛋白（troponin）为佳，晚期则选用LD和肌钙蛋白。另一较大进展是使用免疫学方法测CK-Mb的质量（μg/L），而不是用经典方法测CK-MB的活性浓度（U/L）。特别是使用抗CK-MB单克隆血清合并化学发光技术，不仅灵敏度很高，检出值为0.8μg/L，操作简单，时间短，特别适合于急症标本。在发达国家已逐步取代其方法成为测定MB的主要方法，临床上也常以CK-MB指数＞6％来诊断AMI，指数按下式计算CK-MB（μg/L）/CK（U/L）。最近有人报告用酶联法测糖原磷酸化酶BB同工酶的质量和CK、CK-MB、肌红蛋白以及肌钙蛋白，比其早期诊断AMI灵敏度高。使用溶栓药后，需了解用药是否有效，即是否出现再灌注。冠状动脉血管造影是判断是否出现再灌注可靠的方法，但需一定设备，并且是一种损伤性检查，临床医师往往可以根据酶峰值出现时间提早来诊断，如栓塞溶解，出现再灌注，血液通过梗塞部分，可将释放到病变组织中的酶冲洗到血中，酶峰值出现变早。从冠状动脉粥样硬化的病变和血栓形成、溶栓过程的动态变化，不难理解在典型的心绞痛和心肌梗死之间还存在着各种过渡的病变。例如在按WHOAMI诊断标准未能诊断AMI患者死亡时，可发现有小灶性坏死病变。最近提出一个新的分类，将此类伴有坏死病变的缺血性心脏疾病命名为IMD（ischemicmyocardialdamage）缺血性心肌损伤，包括两类疾病：一类是符合WHO诊断标准的AMI，另一类缺乏典型心电图和酶学变化，但灵敏的心肌损伤指标如肌损伤MMD（mi-normyocardialdamage）。另一方面心绞痛发作可不仅限于劳累时，一部分患者在安静时也可以出现心绞痛，其中一部分还可以进一步发展为AMI和出现猝死。临床上将其分类为不稳定型心绞痛，目前认为TnT和CK-MB质量测定有助于临床判断这些患者的预后，一些临床医师主张对这些患者开展一些较积极的抗凝或溶栓治疗。最近发现一些心肌蛋白可作为心肌损伤的较好指标，尤其是TnT和肌钙蛋白I（TnI）。肌钙蛋白是由三个亚单位组成（TnT，TnI和TnC），它们为心肌的调节单位，在控制心肌收缩中起着重要作用，心肌TnT和TnI的抗原性与骨骼肌有明显差异，可以得到特异性很高的单克隆血清。由于血清中浓度很低，TnT一般不超过0.1μg/L，心肌病变时可成百倍升高，由于分子量较小，升高出现时间都长。目前用TnT诊断AMI，判断不稳定型心绞痛患者预后的价值已为临床所公认，但也发现在肾透析患者血中可有不明原因TnT浓度升高。TnI临床价值仍在探索中，有望成为另一灵敏的心肌损伤指标。第四节　肝脏疾病的酶学诊断从1995年卡门（Karmen）等发现急性肝炎患者在黄疸前期，血清中转氨酶（ALT，AST）活性就已明显增高以来，用于诊断肝脏疾病的酶不下几十种。在我国ALT是应用最广泛的酶，其次是碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基转移酶（GGTP），其它有精氨酸代琥珀酸裂解酶（ASAL）、酰苷脱氨酶（ADA）、5’-核苷酸酶、甘露醇脱氢酶等。总的说来这些酶都能比较确切反映肝胆系统的炎症或坏死性病变，在我国对反映肝脏合成功能方面的酶试验重视较差。公认假性胆碱脂酶（CHE）能反映肝脏蛋白合成能力。还有文献报告卵磷胆固醇酰基转移酶（LACT）也能反肝细胞酶和蛋白的合成能力，但目前此酶所用方法不实用。1975年德国内科协会年会提出ALT、GGTP和CHE三种酶作为肝脏疾病时的酶过筛试验。三种酶分别反映肝脏的不同病理过程：ALT增高往往说明肝实质细胞的损伤；GGTP增高可以说明胆汁淤积和对肝的“诱导作用”；测定CHE可以检查肝脏的蛋白合成功能。当时德国选用这三种酶是建立在大量的临床观察的基础上，他们统计了10年内13000名肝脏疾病患者的检查结果，发现GGTP增高占病例的95％，GPT为83％，CHE有变化的为74％，其中63％活性下降，11％上升。其余酶阳性率的顺序为AST71％，ALP60％，GLDH47％和LDH34％。如同时测定GGTP、GPT和CHE三种酶可查出99％的肝胆疾病患者。急性肝炎恢复期患者约有半数ALT是最后一个恢复正常的生化指标，另半数则是GGTP。另有文献报道在肝炎时ADA恢复正常迟于ALT。大多数中毒病例如果累及肝脏，GGTP灵敏度往往高于转氨酶，尤其是酒精性脂肪肝。血中ALT活性正常而GGTP增高还见于胆石症、胆囊炎、药物的诱导作用以及肝脏慢性淤血等。很早就知道CHE下降是判断肝脏疾病预后一个很好的指标。而在脂肪肝时随ALT和GGTP的增高，CHE也可能增高。根据一个酶试验的结果就进行鉴别诊断和判断预后决非易事。所以后来一些学者企图通过比较不同酶变化的结果来提高酶试验应用的价值。DeRitis首先提出AST/ALT比值的诊断意义，ALT主要存在于细胞质中，AST则有一半位于线粒体中，另外ALT在血中半寿期明显高于AST3倍，所以在典型急性肝炎患者血ALT活性不仅升得高并且持续时间长，在急性肝炎时随时间延长DeRitis比值逐步下降。在病程的第1、2、3和4周，其比值分别为0.7、0.5、0.3和0.2。在慢性活动性肝炎和肝硬化时，由于细胞进一步坏死，AST增高程度往往超过ALT，DeRitis比值大于1。肝硬化尤其酒精性肝硬化，此比值可达3.0。文献上还曾介绍LD/AST、GGTP/AST等，但目前已少用。国内外都有文献报告GGTP和ALP同工酶测定有辅助诊断肝癌作用。LD同工酶试验对肝病诊断也有一定价值。肝中LD以LD5为主，但在正常血中一般不超过10％，所以肝病时测总LD活力价值不大，其阳性率很低，但如测定LD同工酶，则LD5阳性率明显升高，急性肝炎LD5增高患者中有半数LD总活力正常。慢性肝炎中此现象更明显，72％病例LD不增高但LD5异常。一般都认为LD5增高是肝细胞坏死的一个很好指标，可用于判断肝炎治疗效果。重症肝炎时，如LD5持续增高常是需要换血疗法的一个重要指标。急性肝炎时测定线粒体谷草转氨酶（m-AST）有助于了解肝病严重程度。Ideo等报告28例急性肝炎，血清m-AST/总AST为32.10（9.28U/L）。如果总AST升高明显，而m-AST/总AST比值较低，说明病情较轻，反之，如果比值较高，常有重度线粒体破坏，见于肝坏死。国内有人认为测定m-AST可以在一定程度上取代肝活检。以往在解释为何肝病时血清酶变化明显时，往往简单地认为是因为肝脏是人体的代谢库，含有多种高浓度的酶，肝细胞病变时细胞膜通透性增加或者细胞坏死，细胞内酶释放入血以致血清中酶活性升高。这显然不能很好解释复杂的临床现象，例如不同的病因（病毒、毒品、淤血等）可以引起类似的肝细胞病变，但酶的变化规律并不相同。这与下列三个因素有关。（一）肝组织结构和血清酶活性变化肝有两大类型细胞（肝细胞和非肝细胞），通过近年来定量组织学的研究发现，每立方厘米肝细胞中非肝细胞（枯否细胞、内皮细胞和贮脂细胞）约为0.92亿，肝细胞含量在1.5亿到1.7亿之间，非肝细胞的数数为肝细胞的1/2。非肝细胞体积小于肝细胞，其总体积为肝细胞体积的10％。一般认为量为肝细肝细胞代谢比其它非肝细胞更为活跃，酶含量高于非肝细胞，但已有文献报道按每克蛋白质计算，非肝细胞所含的已糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力高于肝细胞。所以在研究肝脏疾病酶变化规律时，不能只看到肝细胞病变而忽视其它细胞特别是枯否细胞的病变。目前对这方面的研究是很不够的，特别缺乏非肝细胞病变和血清酶变化间关系的文章。值得一提的是腺苷脱氢酶（ADA），急性肝炎时血中此酶一般是中度增高，但是传染性单核细胞增多症时知中ADA增高非常明显，此现象还见于肠伤寒。这些都提示血中ADA活性变化可能和单核吞噬细胞系统病变有关。Neef将肝功能试验分类时，也提出ADA可以反映肝脏间质细胞的反应。还有文献报道肝硬化时N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶（ANG）活性增高，此酶主要存在于溶酶体，所以不能排除肝硬化时非肝细胞病变引起ANG增高。肝细胞与非肝细胞在细胞的亚细胞器方面差异较大。例如肝脏中的线粒体都集中在肝细胞中，非肝细胞中的线粒体只占总数的1.2％。另一方面非肝细胞中含大量的溶酶体，可占总数的43％。膜结构主要存在于肝细胞中，非肝细胞结构面积仅占总面积的8％，但其中高尔基复合体膜面积为总高尔基复合体面积的15％，质膜占27％，溶酶体的膜更多为30％。这从另一方面说明肝细胞中膜结构主要集中于线粒体和内质网。由于线粒体几乎全存在于肝细胞中，所以检测代表线粒体酶的变化往往能较准确地反映出肝细胞病变程度，尤其是坏死性变化。因为线粒体有两层膜，一般病变并不能促使线粒体中的酶释放入血。谷氨酸脱氢酶（GLDH）和异柠檬酸脱氢酶（以NADP为辅酶）是最能反映肝细胞线粒体苹果酸脱氢酶（m-MDH）的方法，在判断肝细胞病变估计肝病患者预后方面具有一定的价值。还有人探讨了过氧化物体中的酶，如过氧化氢酶，与内质多有关的酶，如阿司匹林酯酶变化对肝病的诊断价值，但尚看不出有任何明显的临床意义。（二）肝细胞的不均一性近年来通过组织化学定性研究，显微分光光度计定量测定、电子显微镜观察等各种手段和技术已经知道，肝脏中不仅存在着肝细胞和非肝细胞的不同，不同的肝细胞也存在着差异，不仅表现在代谢功能上，还表现在细胞结构上。现常以汇管区肝小叶动静脉终末分枝为中轴进行划分肝小叶，由内向外分为Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ带。不同区带的肝细胞血液供应有差别。氧含量很高的肝动脉血和富含营养物质的肝门静脉血由汇管区的小叶间动脉和静脉进入肝小叶的血窦，依次同过Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ带，最后到达中央静脉，所以Ⅰ带的肝细胞氧和营养物质供应最充分。但另一方面通过血液进入肝脏的有毒物质和致病因子也先到达Ⅰ带。这些特点不可能不对各区带的肝细胞产生影响。在电子显微镜下Ⅰ带存在着大而均一的线粒体，Ⅲ带的线粒体少而大小不一。测定Ⅰ带线粒体剖面积，其平均值为0.43μm，嵴突长度的平均值微7.5μm约为Ⅲ带的2倍，其值分别为0.2μm2和0.3μm2。这促使科学家们去研究不同区带细胞中酶的分布情况。表7-9是综合各学者报告的结果。表7-9 肝小叶不同区带酶分布情况主要存在于Ⅰ带的酶均匀分布的酶主要存在于Ⅲ带的酶细胞色素}