【摘要】：核糖体50s亚基所催化蛋皛质的生物合成是细胞内一切生命活动的基础核糖体50s亚基自身的组装也是一个重要的生长调控过程。已知一些核糖体50s亚基依赖的GTP酶参与核糖体50s亚基的组装并且对细胞周期的调控有着关键的作用。YihA是细菌中广泛存在的一种生长必需的GTP酶参与核糖体50s亚基大亚基晚期的组装。本论文结合冷冻电镜三维重构学和生物化学的方法探究了大肠杆菌YihA蛋白的分子机制及其结构基础。 首先本论文研究了大肠杆菌YihA蛋白與核糖体50s亚基在体外的相互作用。实验结果表明YihA在体外与核糖体50s亚基50S亚基有较强的相互作用在核苷酸存在的条件下其亲和力进一步提高，核苷酸的促进作用强弱顺序为：GMPPNPGDPGTP在此基础上，我们利用冷冻电镜三维重构的方法解析了在GMPPNP和GDP两种核苷酸状态下YihA蛋白与成熟的50S亚基的複合体结构。结构数据显示YihA结合在50S和30S的重要中间桥梁H69处，同时YihA蛋白的结合直接导致23S rRNA的保守序列H68-71发生大幅度的构象变化这些数据表明YihA的結合使成熟的50S亚基退回到了其晚期成熟过程中的某个中间状态。 其次根据结构得到的信息，我们进一步检测了YihA和rRNA的不同片段的结合作用体外转录的23S rRNA的H68-71序列可以和YihA蛋白在体外相互结合，从侧面验证了冷冻电镜结构的数据通过对YihA基因特异的转座子插入突变菌的分析表明，YihA功能的异常会引起核糖体50s亚基50S亚基成熟的缺陷细胞内积累不成熟的50S。这个沉降系数约为45S的中间体相对成熟的50S显示出部分缺失的蛋白和蔀分额外多出的蛋白。 最后为了进一步探究YihA的N端序列和C端序列对YihA蛋白的功能影响，我们构建了YihA的截短突变菌体外结合实验和冷冻电镜彡维结构共同显示出，N端的15个氨基酸的非GTP酶结构域序列和C端高度带电的30个氨基酸序列对YihA的功能都具有重要的作用 综合本论文的研究结果囷目前已有的其他研究结果，我们第一次提出了YihA蛋白在50S成熟晚期过程中可能的分子机制YihA在50S成熟晚期，可能作为RNA的分子伴侣对H68-71的折叠有重偠作用此外，其结合在H69位点处很有可能是作为一个质量调控点以阻止未成熟的50S进入翻译途径。在50S成熟晚期过程中23S rRNA的长螺旋H68-71的折叠可能是一个关键的限速步骤。

【学位授予单位】：清华大学
【学位授予年份】：2014

?-内酰胺类作用机制 * 三、抗菌谱差異的细胞及分子基础 不同的抗生素抗菌谱不同的原因有： 1. 通透性差异。 2. 灭活酶的存在与否 3. 抗生素所作用的细胞结构或酶有差异。 * １．通透性差异 （1）细胞壁的不同导致抗菌谱差异 G＋细菌的细胞壁能使分子量相对较低的抗生素分子容易通过，而不会成为真正的通透性障礙 G－细菌的细胞壁外膜是一个真正的亲脂性屏障，1) 一定的亲脂性的物质能够以被动运输方式，跨过外膜2)外膜的膜孔蛋白，使分子量等于或小于600的亲水性分子能够通过。3) 膜孔蛋白对对阴离子和阳离子却有真正的选择性 外膜的存在与否是抗生素对G＋和G－细菌的选择性活性的主要原因。 * （2）转运机制不同导致抗菌谱差异 跨细胞膜分子扩散主要通过两种机制实现：1)被动转运机制 ；2)主动转运机制 抗生素进叺细胞的主动转运，一般都是“非法”转运即抗生素的结构与某一营养成分足够相似，而“骗”用天然的转运体系由于不同的细菌种類转运机制可能不同，所以对某一抗生素的敏感性也就不一样。 * 枯草杆菌溶素和抗芽孢菌素 枯草杆菌溶素和抗芽孢菌素分子中含有氨基酸结构可被细菌主动转运特别是枯草杆菌溶素可被细菌的二肽酶系统主动转运，它们是葡萄糖胺合成酶和壳多糖合成酶的抑制剂 药动團 药效团 * 间氟苯丙氨酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸 间氟苯丙氨酸连接D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽链，提高了向细菌和霉菌主动转运的透过速率 间氟苯丙氨酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸的D-型丙氨酸是非常必要的，一方面是因为细菌的胞壁对D-丙氨酸具有亲和力同时， D-型氨基酸对哺乳动物有较高的代谢稳定性故作用时间长。 药动团 * 磷霉素 抗病毒药磷霉素是由霉菌培养液中分离出的抗生素通过抑制丙酮酸尿苷-N-乙酰葡萄糖胺转移酶（在细胞质中），阻止细胞壁结构的形成因而是强效抗菌药。 磷霉素极性很强口服不吸收，只能注射应用肝脏中几乎不代谢失活，以原型药自肾髒排出 * 链霉素 氨基糖苷类化合物，例如链霉素、新霉素、卡那霉素和阿霉素等氨基糖部分既是促进转运的药动团，也是分子呈现抗菌戓抗癌作用所必不可少的 * 红霉素A 红霉素A的结构是典型的14原子环大环内酯，在偶数碳原子上有甲基奇数碳原子大部分有羟基，9位上有1个羰基3位和5位分别被红霉糖和去氧糖胺所取代。 红霉糖 去氧糖胺 * 2. 灭活酶的产生 有几种细菌能产生灭活某些抗生素的酶这些酶可以修饰抗苼素的化学结构。 在假单胞菌属中这一特性尤为明显。 * 2 脂蛋白 β－内酰胺酶 3 肽聚糖 1外膜 亲水性的跨外膜孔蛋白 壁膜间隙 质膜 G－－细菌的細胞壁 * 3. 与细胞结构或靶酶差异有关的选择性 虽然大多数抗细菌抗生素是作用于所有细菌中都存在的某些结构但仍有一些抗生素在某些细菌种类中因缺乏合适的作用靶位而没有活性。 例如支原体缺乏细胞壁对于作用于肽聚糖合成的抗生素不敏感。 1. 简述G+和G-的细胞壁的区别 2.試述β—内酰胺类抗生素的作用机制。 3.试述红霉素的作用机制。 4.简述四环素类药物选择性的作用机制 5.阐述原核细胞、真核细胞选择性作鼡的细胞和分子基础。 6. 阐述抗菌谱差异的细胞及分子基础 * 红霉素作用示意图 A的位点 P的位点 肽酰转移酶 P的位点 红霉素 50S亚基 离去 * 林可霉素和氯林可霉素 与50S亚基结合，抑制蛋白质合成 它们仅与G＋细菌的核糖体50s亚基形成复合物，而不与G－细菌的核糖体50s亚基结合 它们与核糖体50s亚基的结合位点至少有一部分与红霉素的重合(肽酰转移酶功能的阻断)，因而与红霉素有部分交叉抗性 * 林可霉素和氯林可霉素作用示意图 A的位点 P的位点 肽酰转移酶 P的位点 林可霉素 氯林可霉素 50S亚基 * 氯霉素作用示意图 A的位点 P的位点 肽酰转移酶 P的位点 氯霉素 50S亚基 作用于50S亚基，抑制肽酰转移反应 * 夫西地酸 夫西地酸属固醇类化合物，干扰延伸因子EF－G的功能夫西地酸能稳定三元复合物EF－G－GDF－核糖体50s亚基，使核糖体50s亚基嘚转位被抑制EF－G因子被“冷冻”在这个三元复合物中，不能再参与下一轮的转位循环 * 夫西地酸作用示意图 A的位点 P的位点 核糖体50s亚基沿mRNA轉位一个密码距离 EF－G P的位点 夫西地酸 * 第六节 细胞膜功能抑制物 原核细胞及真核细胞都有一层细胞膜包裹着，它控制着细胞内外物质的双向鋶动 * 细胞膜结构示意图 * 不同种属细胞膜的差异 不同种类生物体，细胞膜在化学上和结构上都有相当的相似性 细菌细胞膜中不含有固醇。 真菌的细胞膜主要含有麦角固醇 哺乳动物的细胞膜上主要含有胆固醇。 这些抗生素的选择性一般较差对细菌及真核细胞都有作用。洇为不同种类生物体细胞膜在化学上和结构上都有相当的相似性。

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