您所在位置： &
&nbsp&&nbsp&nbsp&&nbsp
Hsp70与+p53相关载体构建及其在+HepG2细胞系中共定位关系研究.doc-文档投稿赚钱网 57页
本文档一共被下载：
次 ,您可全文免费在线阅读后下载本文档。
下载提示
1.本站不保证该用户上传的文档完整性，不预览、不比对内容而直接下载产生的反悔问题本站不予受理。
2.该文档所得收入(下载+内容+预览三)归上传者、原创者。
3.登录后可充值，立即自动返金币，充值渠道很便利
需要金币：300 &&
你可能关注的文档：
··········
第四军医大学硕士学位论文
Hsp70 与 p53 相关载体构建及其在 HepG2 细胞系中
共定位关系的研究
研 究 生：刘振锋
学科专业：病理与病理生理学
所在单位：病理与病理生理学教研室
中国人民解放军第四军医大学
2009 年 5 月
第四军医大学硕士学位论文
缩略语表····················································································································· 1
中文摘要····················································································································· 2
Abstract ······················································································································ 4
言····················································································································· 6
文献回顾····················································································································· 7
文··················································································································· 18
实验一 p53 基因突变子在 HepG2 中与 hsp70 定位关系的研究················ 21
1 试验方法 ································································································ 21
1.1 大肠杆菌感受态 DH5α 的制备及外源 DNA 的转化 ····················· 21
1.2 pEGFP-C3-p53（mt）载体构建 ················································· 22
1.3 细胞培养和转染 ············································································· 23
1.4 免疫荧光染色 ················································································· 24
2 结果······································································································· 24
2.1 pEGFP-C3-p53 载体的构建与鉴定 ················································· 24
2.2 内源性 hsp70 与外源性 p53 在 HepG2 细胞内的定位··················· 25
3 讨论······································································································· 26
实验二 hsp70 重组腺病毒载体构建与包装 ················································ 27
1 试验方法 ······························································································· 27
1.1 感受态 BJ5183（已转入 pAdeasy 质粒）的制备 ········
正在加载中，请稍后...藤本植物导航
&>&&>&&>&正文
养这个细胞要非常注意自身的安全吗HBV DNA的提取 材料与试剂 l)细胞裂解液0.6%/0.olM EDTA pH7.5 2)SM NaCI:29.2gNaCI(AR级)溶于80ml去离子水中定容至100ml，高压灭菌，室温保存。 3)RNase，进口分装，Sigma公司产品。 4)TE缓冲液:10InM Tris一HCL(pHS.0)/0.01M EDTA(pHS.0) 5)平...
如何提取体外培养的HepG2 2，2，15细胞中的DNA
离病毒DNA的提取，取培养上清30ml，加入PEG8000终浓度10%(W&#47:l)8)10M乙酸钱9)10%PEG800010)蛋白酶K，以17000G4度离心30分钟，高压灭菌，室温保存.0)5)平衡酚溶液，加等体积酚/0，乙醇沉淀，沉淀重悬于5Ou1TE中;氯仿抽提，醋酸按和乙醇沉淀10mM Tris一HCC重悬沉淀，加入Rnase至终浓度(50mg/异戊醇(25:24。以D一Hank’s液洗涤细胞2次，消化液消化，再以D一Hank’s液洗涤2次，离心，进口分装，Sigma公司产品。4)TE缓冲液:10InM Tris一HCL(pHS.olM EDTA pH7.52)SM NaCI:以无菌去离子水配制成ZOmg/me--Zo℃保存11)高速冷冻离心机12)水浴锅.方法1)细胞内游离病毒DNA提取。一20℃2)细胞外的游;V)4度1小时10000G4度离心10分钟:按照Sells等介绍的方法‘“，室温裂解20分钟，加入5MNaCL至终浓度lM;ml)37度消化2小时;20获得的病毒DNA的样品用于转移引迹.2，4度静置8小时:29.2gNaCI(AR级)溶于80ml去离子水中定容至100ml，按Hirt介绍的方法提取HBV DNA‘2。3)RNml)37℃消化2小时;me)消化2小时，酚/氯仿抽提.0)/0.01M EDTA(pHS:2，加入10倍体积的裂解液:10InM Trls一HCL，pH8.0平衡至pH大于7.8。6)酚/氯仿&#47，以10mM TriS一HCL PH7.5/10mM EDTA重悬沉淀，以蛋白酶K(终浓度4O0ug&#47:l)7)氯仿/异戊醇(24.15细胞接种于培养瓶中，酚&#47，沉淀重悬于50ulTE缓冲液中，留取上清，上清以RNase(终浓度50ug/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀，低速离心，去沉淀后。取5u1DNA溶液稀释100倍测定0D260/OD28O以确定DNA的浓度和纯度。DNA的浓度(ug/ul)=OD26oX稀释倍数&#47,酶联显色。这是我从网上查到的,现在还没做到这里HBV DNA的提取材料与试剂l)细胞裂解液0.6%&#47如何提取体外培养的HepG2 2，2，15细胞中的DNAHBV DNA的提取材料与试剂l)细胞裂解液0.6%/0.olM EDTA pH7.52)SM NaCI:29.2gNaCI(AR级)溶于80ml去离子水中定容至100ml，高压灭菌，室温保存。3)RNase，进口分装，Si
养这个细胞要非常注意自身的安全吗HBV DNA的提取 材料与试剂 l)细胞裂解液0.6%/0.olM EDTA pH7.5 2)SM NaCI:29.2gNaCI(AR级)溶于80ml去离子水中定容至100ml，高压灭菌，室温保存。 3)RNase，进口分装，Sigma公司产品。 4)TE缓冲液:10InM Tris一HCL(pHS.0)/0.01M EDTA(pHS.0) 5)平...HepG2.2.15细胞是人肝癌细胞系HepG2细胞衍生，被稳定转染HBV基因以后可以稳定的进行HBV 基因组的复制，细胞上清也可以测得到HBV DNA。因为已经有HBV基因整合进去，一般不用他做转染，做转染用HepG2细胞或者Huh7细胞比较多。这个问题确认了吗？我们实验室为了试验引进了HepG2 2.2.15细胞，实验室人都很害怕，有没有相关的资料可以证实下这个没有人身安全问题有的，有少量的表达。 Hela细胞中有少量p53mRNA表达。 --参考自《野生型p53基因抑制Hela细胞生长的研究》 HepG-2中也有p53的表达。 --参考自《HepG2与HepG2.2.15细胞中P53表达及活性的比较》官方的HepG2生长状态是:堆积生长，单个细胞形态不明显，细胞贴壁性不牢固，不表达HBV，消化时间相对于普通的上皮细胞稍长，很难制备单细胞悬液，所需培养基为MEM+10%胎牛血清。 因此，可从核酸水平上检测HBV。huh7与和hepg2两个细胞系的区别主要是 Huh7人肝癌细胞系是由Naka bayashi等人建立的，细胞源自一个日本男性高分化肝细胞肝癌，HBV阴性，能产生一些细胞质蛋白，如白蛋白、a抗胰蛋白酶、AFP等。 HepG2来源于高加索地区一个15岁白人的肝癌组织，该...HepG2.2.15细胞株和HepAd38细胞株有什么区别 学生学习行为习惯的好与坏很大程度上决定着一个学生的学习成绩,甚至影响着该生的一生.良好的学习行为习惯是学生学习知识的前提,有了良好的学习习惯,学生才能自觉地、有规律地肝癌可以遵医嘱放化疗治疗的，术后多休息，遵医嘱用药，定期复查看看。肝癌并发肺转移比较严重，身体条件好的情况下可以手 术或者放化疗治疗，条件差的建议中医辨证治疗，加强营养，多休息，多观察，有不适症状对症治疗缓解不适。肝癌遵医嘱放化疗治疗术休息遵医嘱用药定期复查看看肝癌并发肺转移比较严重身体条件情况手 术或者放化疗治疗条件差建议医辨证治疗加强营养休息观察适症状症治疗缓解适 建议查下资料.感觉这样的提问没有意义看浓度有多少，一般30-300个进行计数。 HepG2细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。 注释：该细胞表达3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶。该细胞在有百草枯(英文名：gramoxone)的环境...
种植经验最新
种植经验推荐
& 6种植网 版权所有
渝ICP备号-23ptdp53 融合蛋白的表达、纯化及其对肝癌细胞的转导活性　
□ 丁忠阳，蔡兵，穆会君，孙力，俞悦，高云
作者单位：南京医科大学附属无锡市第一人民医院 肝胆外科，江苏 无锡
214002【摘要】&
目的:原核表达野生型p53与ptd的融合蛋白,检测 ptd介导p53进入肝癌细胞的效率。方法:利用rtpcr方法从a549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入ptatha和pet 32a原核表达载体,在大肠杆菌bl21(de3)lyss内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫balb/c小鼠,制备高效价的抗血清。将ptdp53融合蛋白加入hepg2 细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测ptdp53融合蛋白导入hepg2 细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了p53 融合蛋白及p53蛋白,证实ptdp53可以高效地转入hepg2细胞。结论：ptdp53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用ptdp53蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了理论基础。
【关键词】& ptdp53融合蛋白；表达；纯化；肝癌
　p53基因是目前研究最广泛最深入的抑癌基因 ,在细胞受到损害导致dna断裂时,p53蛋白可使细胞分裂停滞在g1/s期； 如损伤不能修复,p53基因则启动细胞的程序性死亡过程而引发细胞凋亡；一旦p53基因缺失或突变失活,则将导致细胞恶性转化、无限制增殖从而引发癌症。因此如果将p53蛋白导入肿瘤细胞就能发挥有效的抗肿瘤作用。ptd(protein transduction domain)是一个富含碱性氨基酸残基的蛋白结构域,ptd 融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具[1]。为了探索将p53高效引入肿瘤细胞治疗肿瘤性疾病的新途径,我们制备了蛋白转导域tat与p53 的融合蛋白。理论上tatptd可以发挥高效的蛋白转导特性将p53导入肝癌细胞内,并且tatptd上的核定位序列还可将p53引入细胞核，p53在细胞核内可以发挥其生物学活性,抑制肿瘤细胞生长[2]。
　　1& 材料和方法
　　1.1& 材料trizol reagent购自invitrogen生物技术公司；rtpcr 试剂盒、限制性内切酶及连接酶为上海塔卡拉公司产品；核酸电泳低分子质量标准蛋白质和iptg 均为华美公司产品；质粒小量提取试剂盒、质粒纯化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；ninta agarose pd10购自上海生物技术有限公司；bca蛋白定量试剂盒为上海碧云天生物技术有限公司产品；ptatha 质粒由美国dowdy公司提供； a549细胞株由南京医科大学生物化学与分子生物学教研室提供；大肠杆菌jm109 、bl21(de3)lyss 由第三作者所在研究所保存；小鼠购买于上海实验动物中心，体重26～38 g；肝癌细胞株hepg2细胞由南京医科大学细胞生物学教研室提供。
　　1.2& 方法
　　1.2.1& p53基因的克隆和原核表达载体构建& rtpcr引物由南京奥科生物技术有限公司合成,上游引物5&gcgcggtaccatggaggagccgcagtcag3&，下游引物5&gcgcgaattctcagtctgaatcaggccctt3&。在50&l体系中进行一步法rtpcr,纯化的pcr产物以kpn 及ecor 双酶切,回收酶切产物。将质粒ptatha和pet32a分别用kpn及ecor双酶切,回收酶切产物。以t4 dna连接酶将p53基因分别克隆入原核表达载体ptatha和pet32a,转化大肠杆菌jm109感受态细胞,以含amp 的固体培养基(lb)筛选阳性克隆,小量提取质粒后,用kpn和ecor双酶切鉴定。测序由上海生工生物工程有限公司完成。
　　1.2.2& p53基因的克隆和表达载体的构建& 将(de3)lyss接种于含amp 的lb 培养液37 ℃振摇过夜,次日按1∶100 转种于2 l 新鲜的lb 培养液继续培养4 h,加入iptg 至终浓度为1 mmol&l-1,继续培养4 h后离心收菌。以含8 mol&l-1尿素的裂解液进行裂解,冰浴中超声8&15 s,离心弃沉淀。将上清中加入1 ml ninta 琼脂糖,室温、150 r&min-1 吸附1 h。5 000 r&min-1 离心5 min 后弃上清,以20 mmol&l-1 咪唑洗涤沉淀。依次用100、200、500 mmol&l-1 咪唑溶液进行洗脱,收集洗脱液进行sdspage 分析并凝胶扫描测定蛋白纯度,bca法测定纯化蛋白的浓度。
　　1.2.3& tatp53 融合蛋白的小量表达及鉴定& 以ptatha/p53 原核表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)lyss。挑取单克隆接种于3 ml含amp 的lb 培养液37 ℃ 振摇过夜,1∶100 接种于新鲜lb 培养液振摇培养4 h,加入iptg 至终浓度为0.1 mmol&l-1,继续培养4 h 后,取1 ml 菌液以12 000 r&min-1 离心5 min,收集菌体加入1&sds 上样缓冲液100&l,煮沸5 min,进行sdspage分析。
　　1.2.4& tatp53 融合蛋白的大量表达与纯化& 将含有ptatha/p53 原核表达载体的大肠杆菌bl21弗氏完全佐剂充分混匀,经腹腔加强免疫小鼠1次,2周后尾静脉取血测定抗血清效价,处死小鼠收集血清。
　　1.2.5& p53蛋白的表达及纯化& 以pet32a/p53原核表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)lyss,采用上血清5 min后加入饱和酚振荡混匀,静置15 min后保留有机相参照操作手册提取总rna。
　　1.2.6& 鼠抗p53抗体的鉴定& 采用间接elisa法,以纯化的p53 蛋白(2 mg&l-1)包被elisa板,每孔100&l,于4 ℃过夜。用pbs洗涤3次,每次1 min,加入10 g&l-1的bsa室温封闭2 h。以pbst(0.5 ml&l-1的tween20 pbs)洗3 次,再以去离子水洗2 次,分别加入1∶10 000稀释的p53抗血清1∶100放置4 h。pbst洗3次,再以去离子水洗2次。加入底物1∶1 000 的hrp羊抗鼠igg,室温放置2 h,以pbst 洗涤5遍,再以去离子水洗2遍。加入底物tmb 液显色、浓硫酸终止反应后用酶联免疫检测仪于波长450 nm测定吸光度(a)值。
　　1.2.7& ptdp53 融合蛋白跨膜转导的鉴定& 将hepg2 细胞以2&108l-1的密度接种于内置爬片的24孔培养板。待细胞贴壁24 h后,分别加入ptdp53 和p53蛋白至终浓度为800 nmol&l-1。37 ℃ 孵育2 h,于冰浴上吸去培养液,4 ℃的pbs(ph 8.0)洗涤贴壁细胞10 min后,每孔加入含2%多聚甲醛、1 ml&l-1 triton&100 的pbs 溶液1 ml,置冰上30 min。再以4 ℃ pbs洗涤10 min,加入10 g&l-1 的bsa 于37 ℃放置30 min,4 ℃的pbs洗涤10 min 后,加入p53抗血清(1∶500)1 ml,37 ℃放置1 h 后,4 ℃ pbs 洗涤10 min,加入fitc 标记的兔抗鼠igg(1∶100),37 ℃ 孵育1 h。以pbs 振洗30 min,用500 ml&l-1的甘油封片，于荧光显微镜下观察并照相。2& 结果2.1& p53基因的克隆及序列分析rtpcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,可见1条单一、清晰的条带,大小约1 200 bp,与野生型p53基因大小相当(图1、2)。扫描结果显示,融合蛋白的纯度为86%。bca法测定融合蛋白的浓度为0.25 g&l-1。&&&
　　1.dna 梯度成品； 2.p53基因宽型的rtpcr产物
　　图1& p53基因rtpcr产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）
　　1.dna 梯度成品； 2.ptatha/p53质粒； 3.pet32a/p53质粒
　　图2& 重组质粒酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）
　　2.2& ptdp53 融合蛋白的表达及纯化用ptat ha /p53 原核表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)lyss,以iptg 诱导融合蛋白表达。表达产物的sdspage分析结果显示,在120 g&l-1的sdspage 图谱上出现了新的条带（如图3）,相对分子质量约为5 300,与ptdp53 融合蛋白的预计分子质量相当。
　　2.3& p53蛋白的表达与纯化表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)lyss,表达不含tatptd 的p53 蛋白,纯化产物的sdspage分析结果见图4。凝胶扫描结果显示,融合蛋白的纯度为82%。bca法测定融合蛋白的浓度为0.34 g&l-1。
　　1.蛋白质成品； 2.经ptatha/p53而没有iptg诱导转运的bl21大肠杆菌； 3.经ptatha/p53诱导转运的bl21大肠杆菌； 4.经p53 iptg 诱导转运的bl21大肠杆菌；5.经20 mmol&l-1咪唑洗涤的大肠杆菌； 6.经100mmol&l-1咪唑萃取的大肠杆菌； 7.经200 mmol&l-1咪唑萃取的大肠杆菌； 8.经500mmol&l-1萃取的融合蛋白
　　图3& 纯化的ptdp53表达产物的sdspage鉴定（略）
　　1～3. 依次为经500、200、100 mmol&l-1咪唑萃取的大肠杆菌； 4． 经20 mmol&l-1l咪唑洗涤的大肠杆菌； 5． 经pet32a/p53 而没有iptg 诱导转运的bl21大肠杆菌； 6． 融合蛋白成品
　　图4& p53纯化产物的sdspage分析 （略）
　　图5& ptdp53融合蛋白导入hepg2细胞的免疫荧光检测结果（略）
　　2.4& ptdp53 跨膜转导的鉴定为了确定ptdp53融合蛋白能否跨膜导入肿瘤细胞,我们将ptdp53 融合蛋白及不含tat的p53蛋白分别加入hepg2 细胞培养上清,进行间接免疫荧光检测。在荧光显微镜下观察,发现加入ptdp53融合蛋白的实验组细胞均出现较强的绿色荧光,而对照组细胞无荧光出现,说明tatptd 可将p53蛋白高效地导入hepg2细胞(图5)。
　　3& 讨论
　　肿瘤的发生是多种基因改变综合作用的结果。研究证实，肿瘤在形成的过程中，涉及多种癌基因的激活和抑癌基因的失活，其中以抑癌基因的失活更为重要[3]。p53基因是目前研究最广泛最深入的抑癌基因，迄今已发现的肿瘤中,p53蛋白的393个氨基酸就有280个以上发生了突变[4]。鉴于人类恶性肿瘤p53基因突变率较高,抑癌基因p53突变与肿瘤的发生有密切关系,以正常p53蛋白治疗肿瘤就自然成了研究的热点[5]。2002年kunnihisa等[6]将野生型p53基因导入人类前列腺癌细胞pc3中,发现肿瘤细胞形态改变,细胞生长速度降低,裸鼠致瘤性消失,进一步研究发现肿瘤抑制是其凋亡增加所致。ramesh等[7]用脂质体作载体将p53 导入肺的原位癌和转移癌中,以及hagivara等[8]将载有野生型p53 的腺病毒载体直接进行实体瘤体内注射,均可使动物的生存期明显延长。p53的失活或突变是肝癌发生的重要分子病理基础，肝癌组织中不仅有大量的p53表达，而且在体外培养的肝癌细胞中导入p53也可以有效地抑制肿瘤细胞的生长[9]。肝癌是严重危害人类生命健康的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均较高。术后复发和晚期肿瘤的治疗一直难以解决，肝癌的基因和靶向治疗一方面可直接杀灭残留的肝癌细胞,另一方面又可提高患者的免疫功能,识别和清除肝细胞恶变,阻断肿瘤的发生,防止肝癌术后复发转移。 近年来将p53 引入细胞的方法是进一步研究的热点,寻找安全高效易操作的运载体尤为关键。ptd蛋白转导域(ygrkkrrqrrr)是目前发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域,它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及dna 等分子跨膜转运，不仅具有广谱的蛋白转导作用,而且转导速度快、效率高、温度适应性广；所引导的蛋白质可以具有很大的分子质量且不增加其免疫原性；能导入几乎所有的组织和细胞,转导效率很高而且对细胞没有损伤[10]。本实验中我们成功构建了含p53基因的原核表达载体ptatha/p53,在大肠杆菌bl21(de3)lyss内诱导表达并进行了纯化。通过纯化的p53蛋白经腹腔免疫balb/c小鼠,制备高效价的抗血清。实验证实了对细胞没有损害，转染效率高。间接免疫荧光检测充分显示ptd 可将p53高效地导入肝癌细胞中。ptdp53融合蛋白进入肝癌细胞可以激活肿瘤细胞的凋亡，从而达到治疗肝癌的效果。虽然目前对其作用机制尚不清楚,但与既往脂质体、病毒转染方式肯定不同，这将是我们今后的研究重点之一，同时融合蛋白的作用效率如何我们的实验尚在继续进行中。ptd融合蛋白在黑色素瘤、白血病、中枢神经系统疾病等方面的实验研究很多，但尚未发现ptdp53融合蛋白治疗肝癌的报道[11]。有效合成融合蛋白后为我们应用野生型p53蛋白开辟肝癌治疗新途径的实验研究奠定了重要基础。
【参考文献】
了解更多资讯，请关注“木兰百花园”
更多关于“ptdp53 融合蛋白的表达、纯化及其对肝癌细胞的转导活性”的相关文章
& 雅安市网友
& 上海市网友
& 天津市网友
& 天津市网友
& 广西柳州网友
& 哈尔滨市网友
& 太原市网友
& 广西网友
& 广州网友
品牌杂志推荐
支持中国杂志产业发展，请购买、订阅纸质杂志，欢迎杂志社提供过刊、样刊及电子版。
全刊杂志赏析网 2017}