线栓法制备MCAO模型大鼠的经验体会
The Experience of the Preparation of Rat Model of MCAO with Suture-occluded Method
线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型具有不开颅、损伤小、重复性高等优点,是制备该模型最常用的方法,但目前仍存在很多因素的制约,如技术要求高、模型成功率和存活率较低、术后差异较大等,这些都是亟待解决的问题.笔者从实验动物的选择、术前禁食与否、麻醉剂的选择、线栓制备、手术操作、护理及并发症7个方面对模型制备进行探讨,以期能为各位同仁提供参考.
湖南中医药大学,湖南长沙,410208
年，卷(期)
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湖南省高校创新平台开放基金，湖南省中管局重点项目，湖南省研究生创新基金
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线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型手术操作的研究进展
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3秒自动关闭窗口大鼠线栓法大脑中动脉闭塞模型改进的实验研究--《苏州大学》2011年硕士论文
大鼠线栓法大脑中动脉闭塞模型改进的实验研究
【摘要】：背景与目的
缺血性脑血管病(Ischemic Cerebral Vesscular Disease,ICVD)是神经科常见病多发病,在ICVD的治疗中重建血流或增强缺血区的血流供应是缺血脑组织修复损伤的必需条件,但同时带来的再灌注损伤也是目前最受关注的问题。线栓法大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型能最大程度模拟人类缺血性卒中发生,被广泛用于实验性脑缺血再灌注(Ischemia-reperfusion ,IR)损伤的研究。国内外大量实验证实,MK-801(dizocilpine)在实验性脑缺血模型中具有重要的神经保护作用。
本实验用周龄和性别匹配的SD大鼠成功建立了MCAO动物模型,对原有线栓法大脑中动脉闭塞模型进行了改进,并用MK-801预处理进一步验证动物模型,为研究脑缺血再灌注损伤的发病机理和研制治疗药物打下基础。
50只雄性SD大鼠随机分为3组,IR组、p-MCAO(permanent MCAO)组及假手术组(10只)。IR组(n=22)分为2个亚组,IR治疗组(12只)及IR模型组(10只)。p-MCAO组(n=18)也分为2个亚组,p-MCAO治疗组(10只)及p-MCAO模型组(8只)。两治疗组将药物MK-801(0.5mg/Kg,溶于二甲基亚砜:0.9%生理盐水,体积比为1:39的混合溶液中)于脑缺血15分钟前经颈外动脉给药。假手术组、两模型组大鼠仅给予等容量溶剂。手术组以线栓法制备MCAO模型,假手术组接受相同手术流程,但不插入线栓。手术后分别对各组大鼠做神经功能缺损评分,随后取各大鼠大脑冠状位切片行TTC染色以测量脑梗死及水肿体积,冰冻切片焦油紫染色观察大鼠大脑皮层区细胞损伤程度,酶联免疫吸附法测定脑中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。
1.各手术组大鼠出现严重的神经功能障碍,假手术组大鼠则无任何临床症状。且神经行为学评分显示IR治疗组大鼠神经功能明显优于IR模型组。
2.切片TTC、焦油紫染色各手术组大鼠脑组织见明显脑梗死灶,假手术组大鼠无此改变。IR治疗组脑梗塞体积较IR模型组明显减小。
3.对大鼠脑组织生化指标检测发现,手术组大鼠的TNF-α的表达明显增加。与IR模型组相比,IR治疗组大鼠TNF-α的含量有所降低(P0.01)。
1.本实验建立的大鼠模型在临床表现、病理变化等方面符合MCAO模型的表现,模型稳定、可靠,是研究脑缺血再灌注损伤的理想动物模型。
2. MK-801能改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能障碍,减轻缺血区的脑梗死,并减少炎症因子TNF-α的产生,具有明显的改善脑缺血再灌注损伤的作用。
【关键词】：
【学位授予单位】：苏州大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2011【分类号】：R743;R-332【目录】：
中文摘要4-6Abstract6-9引言9-14 参考文献12-14前言14-15材料与方法15-19 一、实验材料15-16 二、实验方法16-19实验结果19-25 一、大鼠局灶性脑缺血再灌注后的神经功能缺损评分19 二、MK-801 对大鼠脑血流(cerebral blood flower,CBF)的影响19-20 三、ELISA 检测脑组织 TNF-α含量20-21 四、焦油紫染色病理形态学观察21-22 五、TTC 染色结果22-25讨论25-31结论31-32参考文献32-35综述35-45 参考文献42-45中英文缩略词汇表45-46攻读学位期间公开发表的论文46-47致谢47-48
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京公网安备75号导读：本文通过小鼠急性脑缺氧实验、大鼠大脑中动脉栓线法局灶性脑缺血(MCAO)损伤模型，方法1.小鼠急性脑缺氧实验小鼠i.p.给药，末次给药后30min将小鼠逐只断头，立即按秒表记录小鼠断头后至张口喘气停止时间作为耐缺氧指标，造模成功能够存活24h的大鼠确定为最后实验对象，3.对脑血流量影响实验犬静脉滴注给药，4．抑制血小板聚集及血栓形成实验抑制血小板聚集：大鼠i.p.给药，5．双侧颈总动脉结扎的不本文通过小鼠急性脑缺氧实验、大鼠大脑中动脉栓线法局灶性脑缺血(MCAO)损伤模型、对脑血流量影响实验、抑制血小板聚集及血栓形成实验、小鼠不完全脑缺血模型、沙土鼠全脑缺血再灌注损伤等实验和模型，分别从扩张脑血管、抑制血小板聚集及血栓形成、抗水肿、抗缺血再灌注损伤、抗自由基和兴奋性氨基酸损伤等角度，系统的研究了三七中人参三醇皂苷(PTS)对缺血性脑中风的防治作用及其机制。 方法 1.小鼠急性脑缺氧实验 小鼠i.p.给药，每天一次，共3次，末次给药后30min将小鼠逐只断头，立即按秒表记录小鼠断头后至张口喘气停止时间作为耐缺氧指标。 2.大鼠大脑中动脉栓线法局灶性脑缺血(MCAO)损伤模型 雄性SD大鼠，i.p.预防给药两次，每天一次，造模前O.5h i.v.给药1次，造模后4h和10h i.p.给药两次。模型建立：分离、结扎右侧颈总动脉，参照Berdson法用4-0尼龙线阻断大脑中动脉。造模成功能够存活24h的大鼠确定为最后实验对象，并进行行为学评分后，快速取右脑，并切成三片，将脑前部用于脑含水量测定，中部用于脑梗死面积测定，后部用于病理组织学检查。 3.对脑血流量影响实验 犬静脉滴注给药，分别在给药前和给药后5、10、15、30、60、120以及180min测定平均动脉血压(MAP)、心率(HR)、脑血流量(CBF)和脑血管阻力(CVR)等指标。 4．抑制血小板聚集及血栓形成实验 抑制血小板聚集：大鼠i.p.给药，共3次，每天1次。于末次给药30min后，分别自颈总动脉放血，在血样中加入5μl已稀释的ADP(终浓度为50μmol／L)反应5min后测定最大聚集度。 抑制血栓形成：大鼠经4％戊巴比妥钠i.p.麻醉，舌下静脉给药后20min，分离右侧颈总动脉和左侧颈外静脉。把插入丝线的聚乙烯管的两端分别插入右侧颈总动脉和左侧颈外静脉，打开动脉夹开放血液15min后，中断血流，迅速取出聚乙烯管中的血栓，在分析天平上称重，求出血栓抑制率。 5．双侧颈总动脉结扎的不完全脑缺血模型 给小鼠i.p.给药，共3次，每天1次；于末次给药后30min，麻醉后分离双侧颈总动脉，各组经尾静脉注射1％伊文思蓝溶液，并分别在注射10min后结扎双侧颈总动脉。在结扎3h后断头取出脑组织，称重后测脑组织内伊文思蓝含量并计算脑指数。 6．沙土鼠全脑缺血再灌注损伤模型 采用结扎沙土鼠双侧颈总动脉15min再灌注24h制备全脑缺血再灌注损伤模型，动物随机分成假手术组、模型组、PTS 30mg／kg组、PTS 60mg／kg组、PTS120mg／kg组和阳性对照药血栓通注射液组。观察造模24h后PTS对沙土鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、兴奋性氨基酸及病理组织学的影响。 结果 1．小鼠急性脑缺氧实验结果提示，PTS注射液30mg／kg以上剂量组给药后均能显著延长小鼠断头喘息时间，提示PTS注射液可提高小鼠脑耐急性缺氧的能力以增强对抗脑中风的能力。 2．大鼠大脑中动脉栓线法局灶性脑缺血(MCAO)损伤模型实验提示：一定剂量的PTS注射液能改善MCAO大鼠的偏瘫体征，缩小脑内梗死面积，减轻脑水肿和神经元细胞的继发性损害，对MCAO大鼠具有良好的防治作用。 3．脑血流量实验表明：12.3mg／kg、24.6mg／kg和49.6mg／kg剂量的PTS注射液在给药后30分钟内均能明显降低犬脑血管阻力，使脑血流量显著增加，而对血压无明显影响，对心率影响也不明显，机制可能与扩张脑血管有关。 4．抑制血小板聚集及血栓形成实验提示，41.54 mg／kg和83.08mg／kg剂量的PTS注射液对ADP诱导的大鼠血小板聚集有明显的抑制作用，且随着剂量的增大抑制作用逐渐增强；抗血栓形成实验提示，PTS注射液各剂量组能明显抑制大鼠血栓形成。 5．小鼠双侧颈总动脉结扎不完全脑缺血模型实验表明：与模型组比较， PTS注射液各组脑指数和脑伊文思蓝含量显著降低，提示一定剂量的PTS注射液可以抑制小鼠脑缺血引起的脑血管通透性增加，从而降低脑指数，减轻脑水肿。 6．PTS对沙土鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用 组织病理学检查表明，同模型组比较，PTS中、高剂量组对沙土鼠脑缺血再灌注致脑组织和神经细胞的病理损伤有较好的改善作用。 脑缺血再灌注24小时后沙土鼠脑组织SOD活性明显降低，MDA含量明显提高，与假手术相比较均有显著性差异。PTS给药组的SOD活性与与模型组相比显著升高，MDA含量与模型组相比显著降低，提示PTS对沙土鼠全脑缺血再灌脑组织的自由基损伤有明显保护作用。 造模后模型组G1u和Asp明显升高，PTS各组升高值明显低于模型组，提示PTS可抑制兴奋性氨基酸的释放，保护脑神经细胞。 结论 综合以上分析，结果提示一定剂量的PTS对缺血性脑中风有明显的防治作用，其作用机制可能是扩张脑血管、抑制血小板聚集及血栓形成、减轻脑水肿以恢复脑血流的供应，以及抵抗自由基和兴奋性氨基酸损伤以保护脑神经细胞。
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