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gb 6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验 中华人民共和国国家标准GB16食品安全国家标准食品微生物学检验 双歧杆菌检验发布实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB16Ⅰ 前 言本标准代替GB12《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定》。本标准与GB12相比,主要变化如下:———增加了双歧杆菌的计数方法;———增加了MRS培养基;———修改了标准的适用范围;———修改了附录B为可选项。GB161 食品安全国家标准食品微生物学检验 双歧杆菌检验1 范围本标准规定了双歧杆菌(Bifidobacterium)的鉴定及计数方法。本标准适用于双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。本标准适用于食品中仅含有单一双歧杆菌的菌种鉴定。本标准适用于食品中仅含有双歧杆菌属的计数,即食品中可包含一个或多个不同的双歧杆菌菌种。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1 恒温培养箱:36℃±1℃。2.2 冰箱:2℃~5℃。2.3 天平:感量0.01g。2.4 无菌试管:18mm×180mm、15mm×100mm。2.5 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器(200μL~1000μL)及配套吸头。2.6 无菌培养皿:直径90mm。3 培养基和试剂3.1 双歧杆菌培养基:见A.1。3.2 PYG培养基:见A.2。3.3 MRS培养基:见A.3。3.4 甲醇:分析纯。3.5 三氯甲烷:分析纯。3.6 硫酸:分析纯。3.7 冰乙酸:分析纯。3.8 乳酸:分析纯。4 检验程序双歧杆菌的检验程序见图1。GB162 图1 双歧杆菌的检验程序5 操作步骤5.1 无菌要求全部操作过程均应遵循无菌操作程序。GB163 5.2 双歧杆菌的鉴定5.2.1 纯菌菌种5.2.1.1 样品处理:半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板。固体菌种或真空冷冻干燥菌种,可先加适量灭菌生理盐水或其他适宜稀释液,溶解菌粉。5.2.1.2 接种:接种于双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板。36℃±1℃厌氧培养48h±2h,可延长至72h±2h。5.2.2 食品样品5.2.2.1 样品处理:取样25.0g(mL),置于装有225.0mL生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45℃的条件解冻,时间不超过15min。5.2.2.2 接种或涂布:将上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板,或取0.1mL适当稀释度的样品匀液均匀涂布在双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板。36℃±1℃厌氧培养48h±2h,可延长至72h±2h。5.2.2.3 纯培养:挑取3个或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板。36℃±1℃厌氧培养48h±2h,可延长至72h±2h。5.2.3 菌种鉴定5.2.3.1 涂片镜检:挑取双歧杆菌平板或MRS平板上生长的双歧杆菌单个菌落进行染色。双歧杆菌为革兰氏染色阳性,呈短杆状、纤细杆状或球形,可形成各种分支或分叉等多形态,不抗酸,无芽孢,无动力。5.2.3.2 生化鉴定:挑取双歧杆菌平板或MRS平板上生长的双歧杆菌单个菌落,进行生化反应检测。过氧化氢酶试验为阴性。双歧杆菌的主要生化反应见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。表1 双歧杆菌菌种主要生化反应编号项目两歧双歧杆菌(B.bifidum)婴儿双歧杆菌(B.infantis)长双歧杆菌(B.longum)青春双歧杆菌(B.adolescentis)动物双歧杆菌(B.animalis)短双歧杆菌(B.breve)1L-阿拉伯糖--+++-2D-核糖-+++++3D-木糖-++d++4L-木糖------5阿东醇------6D-半乳糖d+++d+7D-葡萄糖++++++8D-果糖d++dd+9D-甘露糖-++---10L-山梨糖------GB164 表1(续)编号项目两歧双歧杆菌(B.bifidum)婴儿双歧杆菌(B.infantis)长双歧杆菌(B.longum)青春双歧杆菌(B.adolescentis)动物双歧杆菌(B.animalis)短双歧杆菌(B.breve)11L-鼠李糖------12卫矛醇------13肌醇-----+14甘露醇----a--a15山梨醇----a--a16α-甲基-D-葡萄糖甙--+---17N-乙酰-葡萄糖胺-----+18苦杏仁甙(扁桃甙)---++-19七叶灵--+++-20水杨甙(柳醇)-+-++-21D-纤维二糖-+-d--22D-麦芽糖-+++++23D-乳糖++++++24D-蜜二糖-+++++25D-蔗糖-+++++26D-海藻糖(覃糖)------27菊糖(菊根粉)--a--a--a28D-松三糖--++--29D-棉籽糖-+++++30淀粉---+--31肝糖(糖原)------32龙胆二糖-+-+++33葡萄糖酸钠---+--注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性;d表示11%~89%以上菌株阳性;a表示某些菌株阳性。5.2.3.3 有机酸测定:测定双歧杆菌的有机酸代谢产物(可选项),见附录B。5.3 双歧杆菌的计数5.3.1 纯菌菌种5.3.1.1 固体和半固体样品的制备:以无菌操作称取2.0g样品,置于盛有198.0mL稀释液的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或置于盛有198.0mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶100的样品匀液。GB165 5.3.1.2 液体样品的制备:以无菌操作量取1.0mL样品,置于9.0mL稀释液中,混匀,制成1∶10的样品匀液。5.3.2 食品样品5.3.2.1 样品处理:取样25.0g(mL),置于装有225.0mL生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45℃的条件解冻,时间不超过15min。5.3.3 系列稀释及培养用1mL无菌吸管或微量移液器,制备10倍系列稀释样品匀液,于8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或用拍击式均质器拍打1min~2min。每递增稀释一次,即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。根据对样品浓度的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液,在进行10倍递增稀释时,吸取1.0mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1.0mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15mL~20mL冷却至46℃的双歧杆菌琼脂培养基或MRS琼脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。待琼脂凝固后,将平板翻转,36℃±1℃厌氧培养48h±2h,可延长至72h±2h。培养后计数平板上的所有菌落数。5.3.4 菌落计数5.3.4.1 可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。5.3.4.2 选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。5.3.4.3 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。5.3.4.4 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。5.3.5 结果的表述5.3.5.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克或每毫升中菌落总数结果。5.3.5.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算:N=?C(n1+0.1n2)d…………………………(1)式中:N———样品中菌落数;?C———平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1———第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2———第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d———稀释因子(第一稀释度)。5.3.5.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可GB166 记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。5.3.5.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5.3.5.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。5.3.5.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5.3.6 菌落数的报告5.3.6.1 菌落数小于100CFU时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。5.3.6.2 菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。5.3.6.3 称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。5.4 结果与报告根据5.2.3.1、5.2.3.2,5.2.3.3结果,报告双歧杆菌属的种名。根据5.3.6菌落计数结果出具报告,报告单位以CFU/g(mL)表示。GB167 附 录 A培养基和试剂A.1 双歧杆菌琼脂培养基A.1.1 成分蛋白胨 15.0g酵母浸膏 2.0g葡萄糖 20.0g可溶性淀粉 0.5g氯化钠 5.0g西红柿浸出液 400.0mL吐温80 1.0mL肝粉 0.3g琼脂粉 20.0g加蒸馏水至 1000.0mLA.1.2 制法A.1.2.1 半胱氨酸盐溶液的配制:称取半胱氨酸0.5g,加入1.0mL盐酸,使半胱氨酸全部溶解,配制成半胱氨酸盐溶液。A.1.2.2 西红柿浸出液的制备:将新鲜的西红柿洗净后称重切碎,加等量的蒸馏水在100℃水浴中加热,搅拌90min,然后用纱布过滤,校正pH7.0±0.1,将浸出液分装后,121℃高压灭菌15min~20min。A.1.2.3 制法:将A.1.1所有成分加入蒸馏水中,加热溶解,然后加入半胱氨酸盐溶液,校正pH至6.8±0.1。分装后121℃高压灭菌15min~20min。A.2 PYG液体培养基A.2.1 成分蛋白胨 10.0g葡萄糖 2.5g酵母粉 5.0g半胱氨酸-HCl 0.25g盐溶液 20.0mL维生素K1溶液 0.5mL氯化血红素溶液5mg/mL 2.5mL加蒸馏水至 500.0mLA.2.2 制法A.2.2.1 盐溶液的配制:称取无水氯化钙0.2g,硫酸镁0.2g,磷酸氢二钾1.0g,磷酸二氢钾1.0g,碳酸GB168 氢钠10.0g,氯化钠2.0g,加蒸馏水至1000mL。A.2.2.2 氯化血红素溶液(5mg/mL)的配制:称取氯化血红素0.5g溶于1mol/L氢氧化钠1.0mL中,加蒸馏水至100mL,121℃高压灭菌15min~20min。A.2.2.3 维生素K1溶液的配制:称取维生素K11.0g,加无水乙醇99.0mL,过滤除菌,避光冷藏保存。A.2.2.4 制法:除氯化血红素溶液和维生素K1溶液外,A.2.1其余成分加入蒸馏水中,加热溶解,校正pH至6.0±0.1,加入中性红溶液。分装后121℃高压灭菌15min~20min。临用时加热熔化琼脂,加入氯化血红素溶液和维生素K1溶液,冷至50℃使用。A.3 MRS培养基A.3.1 成分蛋白胨 10.0g牛肉粉 5.0g酵母粉 4.0g葡萄糖 20.0g吐温80 1.0mLK2HPO4·7H2O 2.0g醋酸钠·3H2O 5.0g柠檬酸三铵 2.0gMgSO4·7H2O 0.2gMnSO4·4H2O 0.05g琼脂粉 15.0g加蒸馏水至 1000.0mLA.3.2 制法将A.3.1所有成分加入蒸馏水中,加热溶解,调节pH至6.2±0.1,分装后121℃高压灭菌15min~20min。GB169 附 录 B双歧杆菌的有机酸代谢产物检测方法B.1 双歧杆菌培养液制备挑取双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板上纯培养的双歧杆菌接种于PYG液体培养基,同时用未接种菌的PYG液体培养基做空白对照,厌氧,36℃±1℃培养48h。B.2 标准液的配制B.2.1 乙酸标准溶液:准确吸取分析纯冰乙酸5.7mL,加水稀释至100.0mL,摇匀,进行标定,配成约1.0mol/L的乙酸标准溶液。标定方法为:准确称取乙酸3.0g,加水15.0mL,酚酞指示液2滴,用1.0mol/mL氢氧化钠溶液滴定,并将滴定结果用空白试验校正。1.0mL1mol/mL氢氧化钠溶液相当于60.05mg的乙酸。B.2.2 乙酸使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至20.0mmol/L。B.2.3 乳酸标准溶液:吸取分析纯乳酸8.4mL,加水稀释至100.0mL,摇匀,进行标定,配成约1.0mol/L的乳酸标准溶液。标定方法为:准确称取乳酸1.0g,加水50.0mL,加入1mol/mL氢氧化钠滴定液25.0mL,煮沸5min,加入酚酞指示液2滴,同时用0.5mol/mL硫酸滴定液滴定,并将滴定结果用空白试验校正。1.0mL1mol/mL氢氧化钠溶液相当于90.08mg的乳酸。B.2.4 乳酸使用液:将乳酸标准溶液用水稀释至20.0mmol/L。B.3 方法B.3.1 乙酸的处理取双歧杆菌培养液2.0mL~3.0mL放入10mL离心管中,加入0.2mL50%硫酸溶液(体积分数),混匀,加入2.0mL丙酮,混匀后加过量氯化钠,剧烈振摇1min,再加入2.0mL乙醚,振摇1min后,于3000r/min离心5min,将上清液转入另一试管中,下层溶液用2.0mL丙酮和2.0mL乙醚重复提取2次,合并有机相,于40℃水浴中用氮气吹至尽干,用20mmol/L的磷酸二氢钠溶液(pH2.0)-乙腈(99+1)溶解并定容至1.0mL,混匀后备用。同样操作步骤处理乙酸标准和空白培养液。B.3.2 乳酸的处理取双歧杆菌培养液2.0mL~3.0mL放入10mL比色管中,100℃水浴10min,加入0.2mL50%(体积分数)硫酸溶液,混匀,加入1.0mL甲醇,于58℃水浴30min后加水1.0mL,加三氯甲烷1.0mL,振摇3min,3000r/min离心5min,取三氯甲烷层分析。同样操作步骤处理乳酸标准和空白培养液。B.3.3 液相色谱条件色谱柱:ZorbaxSb-Aq液相色谱柱(4.6×150mm,5μm)或其他等效色谱柱;流动相:20mmol/L的磷酸二氢钠溶液(pH2.0)-乙腈(99+1),等度洗脱,流速1mL/柱温箱:35℃;紫外检测波长:210外标定量。GB1610 B.4 结果计算X=A样-A空A标×c…………………………(B.1)式中:X———样品培养液中乙酸或乳酸的含量,单位为微摩尔每毫升(μmol/mL);A样———样品培养液中乙酸或乳酸的峰面积;A空———空白培养液中乙酸或乳酸的峰面积;A标———乙酸标准或乳酸标准的峰面积;c———乙酸标准或乳酸标准的浓度,单位为微摩尔每毫升(μmol/mL)。B.5 允许差相对相差≤15%。B.6 结果判定如果乙酸(μmol/mL)与乳酸(μmol/mL)比值大于1,可判定为是双歧杆菌的有机酸代谢产物。
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原始记录要把表1中生化反应全部覆盖吗
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