[发明专利]FISH制片再次杂交的方法有效
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【说明书】：
技术领域本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉FISH制片再次杂交的方法。背景技术荧光原位杂交技术始于20世纪60年代末，是利用碱基互补配对原则在染色体、间期细胞核和DNA纤维上进行DNA序列定位的一种有效手段。荧光原位杂交最初使用的探针为DNA重复序列和多拷贝基因家族，后来随着该技术的不断改进和完善，逐渐开始使用单低拷贝序列作为探针，使其检测的分辨率和灵敏性都得到了大幅的提高。目前，荧光原位杂交技术广泛应用在基因物理定位、染色体识别、物理图谱的构建、亲缘关系研究和转基因检测等方面，在现代分子细胞遗传学领域有着举足轻重的作用。荧光原位杂交实验中，制片的质量往往是实验是否成功的关键要素。可荧光原位杂交的制片往往不易获得，需要消耗大量的实验材料。而在通常情况下，由于制片在首次杂交后杂交信号很难洗掉，以及不知如何正确处理制片在观察后表面留有的试剂而又不影响制片上染色体的完整等因素，制片往往使用一次便被丢弃，这造成了资源的巨大浪费，并且很容易污染环境。尤其对于一些珍贵的相对稀少的材料，制片更显得尤为宝贵。发明内容本发明的目的是提供一种FISH制片再次杂交的方法。根据本发明的具体实施方式，所述的方法包括以下步骤：1)荧光原位杂交后的制片，在2×SSC浸泡下洗掉盖片，然后2×SSC浸泡制片3×5min，以洗掉盖片及制片上残留的试剂。2)随后把制片放入90℃的2×SSC下10min，期间不断摇动，把制片上的试剂彻底洗涤干净，初步变性制片上的染色体。3)再放入78℃的70％去离子甲酰胺中4min，期间不断摇动，变性制片上的染色体，使其双链打开，轻微摇动，把首次杂交中的探针序列从靶序列上洗涤掉。温度过低或时间过短则染色体变性不彻底，导致首次杂交中的杂交信号洗涤不彻底，温度过高或时间过长会使染色体形态变得蓬松，影响观察。4)随后迅速放入-20℃的70％酒精中。5)用DAPI在暗室染色10min。6)荧光显微镜观察，观测信号的洗脱情况。7)再次利用该制片进行荧光原位杂交实验。荧光原位杂交技术如今在染色体鉴定、物理图谱构建、基因组比较研究等方面起着重要的作用，利用本发明提供的FISH制片再次杂交的方法，可彻底洗脱掉荧光原位杂交中的杂交信号，从而可使制片得到多次使用。这对于研究较珍贵的材料有很大的帮助，同时减少了环境污染，节约了实验成本。附图说明图1以雷蒙德氏棉1号染色体特异BAC克隆(Wang K，2007)为探针，荧光原位杂交雷蒙德氏棉的有丝分裂中期染色体的杂交图像。染色体显示为蓝色，特异BAC克隆为红色信号。Bar＝5μm。A：首次杂交的图像。B：洗脱制片后的图像。C：再次杂交后的图像。图2以雷蒙德氏棉1号染色体特异BAC克隆(Wang K，2007)为探针，荧光原位杂交雷蒙德氏棉的有丝分裂间期染色体的杂交图像。染色体显示为蓝色，特异BAC克隆为红色信号。Bar＝5μm。A：首次杂交的图像。B：洗脱制片后的图像。C：再次杂交后的图像。图3以陆地棉中棉所12号的中期染色体为靶DNA的杂交图像。A：初次荧光原位杂交时中期染色体形态。B：洗脱制片后的中期染色体形态。具体实施方式实施例1以雷蒙德氏棉1号染色体特异BAC克隆为探针，雷蒙德氏棉(D5)有丝分裂中期染色体为靶染色体，进行FISH制片再次杂交实验。1材料和方法1.1实验材料实验材料是雷蒙德氏棉，来自于中国农业科学院棉花研究所。所用的BAC为雷蒙德氏棉1号染色体特异BAC克隆(Wang K，2007)。实验试剂：纤维素酶Onazuka R-10和果胶酶Pectolyase Y-23购自Solarbio公司，地高辛探针标记试剂盒购自Roche公司，其他均为国产分析纯试剂。1.2实验方法1)取材及预处理：取雷蒙德氏棉的种子在温水中浸泡12h左右，然后在光照培养箱里培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用(25ppm)放线菌酮25℃下处理2h，然后用蒸馏水冲洗1次，用95％乙醇：冰乙酸(3:1)固定液固定4h以上；2)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗1次，在37℃下用4％纤维素酶+2％果胶酶混合液处理根尖45min；3)制片：酶解好的根尖用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃下保存4h以上，然后在-80℃下揭掉盖片，迅速置于80℃烤干，在60℃烘箱中烘干10h，最后放在4℃保存备用；4)标记探针：探针的标记采用Dig-Nick Translation Mix系统标记。首先提取特异BAC克隆(299N22)的质粒，然后参考Roche公司的说明，先取1μL相应浓度的质粒溶解于ddH2O中，配成16μL，再加入4μL Dig-Nick Translation Mix混合，短暂离心，然后15℃保温90min，最后是65℃温浴10min，以灭活体系中的酶活性，最后放在-20℃保存备用。5)荧光原位杂交流程，参照王春英等(2001)介绍的方法。地高辛标记的探针在荧光显微镜下观察显示为红色。染色体用DAPI衬染在荧光显微镜下观察显示蓝色。6)荧光显微镜观察，用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。采用Photoshop作图软件处理图片。7)杂交后的制片在观察后，在2×SSC浸泡下洗掉盖片，然后2×SSC浸泡制片3×5min。8)随后把制片放入90℃的2×SSC下10min，期间不断摇动。9)再放入78℃的70％去离子甲酰胺中4min，期间不断摇动。10)随后迅速放入-20℃的70％酒精中。11)用DAPI在暗室染色10min。12)荧光显微镜观察，用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号。13)随后的再次荧光原位杂交洗脱后的制片，同样以雷蒙德氏棉1号染色体特异BAC克隆为探针，采用Dig-Nick Translation Mix系统标记，荧光原位杂交具体流程依旧参照王春英等(2001)介绍的方法。14)荧光显微镜观察，用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号。2实验结果实验结果显示(图1)，首次荧光原位杂交后，用荧光显微镜观察可发现清晰的杂交信号。经过洗脱处理制片后，杂交信号被洗脱干净，而当再次用同样的探针荧光原位杂交后，杂交信号再次出现在染色体相同的位置。照片上可明显看出，首次杂交后，在染色体上有明显红色杂交信号；经过对制片洗脱处理后，杂交信号被洗脱干净；当再一次用同样的探针做荧光原位杂交时，杂交信号再次在染色体的相同位置被观测到。实施例2以陆地棉中棉所12的有丝分裂中期染色体为靶染色体，进行FISH制片再次杂交实验。1材料和方法1.1实验材料实验材料是陆地棉中棉所12号，来自于中国农业科学院棉花研究所。实验试剂：纤维素酶Onazuka R-10和果胶酶Pectolyase Y-23购自Solarbio公司，地高辛探针标记试剂盒购自Roche公司，其他均为国产分析纯试剂。1.2实验方法在第9步时，延长在78℃的70％去离子甲酰胺中的时间至5分钟。其他步骤同上。2实验结果实验结果发现，当延长第9步中的处理时间时，染色体形态明显出现膨胀现象(图3)。时间越长，膨胀程度越严重，会严重影响对杂交信号的观测。而时间偏少，则会导致杂交信号洗涤不彻底。
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原位杂交实验用试剂
蛋白酶K (20mg/ml)
探针杂交稀释液
PBS-甘氨酸
100× Denhardt
10mg/ml变性鲱鱼精子DNA
缓冲液I（原位杂交用）
缓冲液II（原位杂交用）
缓冲液III（原位杂交用）
缓冲液IV（原位杂交用）
anti-Dig-AP抗体
NBT/BCIP显色试剂盒
DIG RNA Labeling Mixture, 10x
蛋白酶K (20mg/ml)
0.2ml/支，1支
产品简介：蛋白酶K（Proteinase K）的消化作用在ISH中是应用于蛋白消化的关键步骤，其浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用1μg/ml的蛋白酶K (于0.1mol/l Tris/50mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中)，37℃孵育15～20min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高原位杂交的信号。在蛋白酶K消化后，应用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。
保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
2ml/只，3只
产品简介：
预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。
预杂交液中包含以下成份：去离子甲酰胺，20×SSC，硫酸葡聚糖，100× Denhardt，SDS，变性鲱鱼精子DNA等。
预杂交液用无RNase A和DNase I的去离子水，经过过滤除菌处理，可以直接用于原位杂交或其他分子生物学用途。
保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
探针杂交稀释液
探针杂交稀释液
2ml/只，3只
产品简介：
探针杂交稀释液中包含以下成份：去离子甲酰胺，20×SSC，硫酸葡聚糖，100× Denhardt，SDS，变性鲱鱼精子DNA等。
探针杂交稀释液用无RNase A和DNase I的去离子水，经过过滤除菌处理，可以用于稀释原位杂交探针或其他分子生物学用途。
保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
PBS-甘氨酸
PBS-甘氨酸
100ml/瓶，1瓶
产品简介：
在蛋白酶K消化后，应用PBS-甘氨酸清洗以终止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂。
PBS-甘氨酸包含以下成份：甘氨酸和磷酸缓冲液(Phosphate-Buffered Saline，PBS)。0.1M Glycine，135mM NaCl，4.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM NaH2PO4，pH值为7.4。
本PBS-甘氨酸溶液用无RNase A和DNase I的去离子水，经过过滤除菌处理，可以直接用于原位杂交或其他分子生物学用途。
保存条件：
4℃保存，半年有效。-20℃保存一年有效。本产品可以短期室温存放。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
100ml/瓶，1瓶
产品简介：
PBS-MgCl2包含以下成份：MgCl2和磷酸缓冲液(Phosphate-Buffered Saline，PBS)。5mM MgCl2，135mM NaCl，4.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM NaH2PO4，pH值为7.4。
本PBS-MgCl2溶液用无RNase A和DNase I的去离子水，经过过滤除菌处理，可以直接用于原位杂交或其他分子生物学用途。
保存条件：
4℃保存，半年有效。-20℃保存一年有效。本产品可以短期室温存放。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
100× Denhardt
100× Denhardt
产品简介：
100× Denhardt包含以下成份：聚蔗糖,聚乙烯吡咯烷酮,牛血清白蛋白。
本100× Denhardt溶液用无RNase A和DNase I的去离子水，经过过滤除菌处理，可以直接用于原位杂交预杂交液的配制或其他分子生物学用途。
保存条件：
-20℃保存一年有效。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
变性鲱鱼精子DNA
10mg/ml变性鲱鱼精子DNA
产品简介：
将变性鲱鱼精子DNA溶解于无RNase A和DNase I的去离子水中，经过过滤除菌处理制备而成，变性鲱鱼精子DNA的浓度为10mg/ml，可以直接用于原位杂交预杂交液的配制或其他分子生物学用途。
保存条件：
-20℃保存一年有效。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
100ml/瓶，1瓶
产品简介：
20×SSC包含以下成份：3M NaCl，0.3M枸椽酸三钠·2H2O，pH7.0。
将NaCl和枸椽酸三钠溶解于无RNase A和DNase I的去离子水中，经过过滤除菌或者湿热灭菌制备而成，可以经过稀释用于制备原位杂交洗涤液等的配制或其他分子生物学用途。
保存条件：
4℃保存，半年有效。-20℃保存一年有效。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
缓冲液I（原位杂交用）
缓冲液I（原位杂交用）
100ml/瓶，1瓶
产品简介：
缓冲液I包含以下成份：每100ml包含顺丁烯二酸1.16g，NaCl 0.88g，用10N NaOH将pH调至7.5。
将顺丁烯二酸和NaCl溶解于无RNase A和DNase I的去离子水中，用10N NaOH将pH调至7.5，经过过滤除菌或者湿热灭菌制备而成，可以用于原位杂交孵育探针后，连接抗体前的波片洗涤。
保存条件：
4℃保存，半年有效。-20℃保存一年有效。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
缓冲液II（原位杂交用）
缓冲液II（原位杂交用）
100ml/瓶，1瓶
产品简介：
缓冲液II包含以下成份：缓冲液I（每100ml包含顺丁烯二酸1.16g，NaCl 0.88g，用10N NaOH将pH调至7.5）和封闭缓冲液（羊血清和10%阻断剂）的混合物。缓冲液I：羊血清：10%阻断剂=7:1:2。
将顺丁烯二酸和NaCl溶解于无RNase A和DNase I的去离子水中，用10N NaOH将pH调至7.5，经过过滤除菌或者湿热灭菌制备而成，此为缓冲液I，将缓冲液I、羊血清和10%阻断剂按照7:1:2的比例混匀，即为缓冲液II。用于原位杂交孵育探针后，连接抗体前的波片洗涤。
保存条件：
4℃保存，半年有效。-20℃保存一年有效。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
缓冲液III（原位杂交用）
缓冲液III（原位杂交用）
100ml/瓶，1瓶
产品简介：
缓冲液III包含以下成份： 100mM Tris.HCl，100mM NaCl，50mM MgCl2用pH调至9.5。
将顺丁烯二酸和NaCl溶解于无RNase A和DNase I的去离子水中，用10N NaOH将pH调至9.5，经过过滤除菌或者湿热灭菌制备而成，可以用于原位杂交连接抗体后的波片洗涤。
保存条件：
4℃保存，半年有效。-20℃保存一年有效。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
缓冲液IV（原位杂交用）
缓冲液IV（原位杂交用）
100ml/瓶，1瓶
产品简介：
缓冲液IV包含以下成份： 10mM Tris.HCl，1mM EDTA pH8.0。
将Tris.HCl和EDTA溶解于无RNase A和DNase I的去离子水中，用1N NaOH将pH调至8.0，经过过滤除菌或者湿热灭菌制备而成，可以用于原位杂交连接抗体后的波片洗涤。
保存条件：
4℃保存，半年有效。-20℃保存一年有效。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
anti-Dig-AP抗体
anti-Dig-AP抗体
产品简介：
Roche分装：；Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments。用于原位杂交的二抗，用NBT/BCIP显色。
保存条件：
-20℃保存一年有效。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
NBT/BCIP显色试剂盒
NBT/BCIP显色试剂盒
产品简介：
NBT即氯化硝基四氮唑兰 (Nitroblue tetrazolium chloride)，为深蓝色无定形微溶物质。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate), 在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP）的催化作用下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的沉淀。
NBT/BCIP显色试剂盒包含25×NBT和25×BCIP各1支，0.5ml/支。使用时用1×AP反应缓冲液将25×NBT和25×BCIP 稀释25倍到需要的量配成反应工作液，最好现配现用。应用于原位杂交每张片子50μl左右。
保存条件：
-20℃保存一年有效。
注意事项：
BCIP、NBT为可疑致癌物，请采取必要的防范措施。操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗。
本产品仅供科研使用。
DIG RNA Labeling Mixture, 10x
DIG RNA Labeling Mixture, 10x
产品简介：
Roche分装（），地高辛标记的RNA体外转录与SP6，T3和T7 RNA聚合酶。标记的探针可用于Southern、northern和斑点杂交，菌落或噬菌斑的电梯，或原位杂交。
保存条件：
-20℃保存一年有效。
注意事项：
在使用本产品的过程中要特别注意避免溶液被微生物、RNase A和DNase I污染。
本产品仅供科研使用。
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