玻片类，细胞爬片
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规格：13mm／15mm 24孔培养板专用（已灭菌）
品牌：紫一
产地：上海
包装：50片/盒
价格：22050片/盒
&上海紫一试剂
产品介绍：
玻片类，细胞爬片
&表面平坦、透明
&耐腐蚀，易于移动，不易破损
玻片类，细胞爬片
&适合制作电子显微镜标本，用于免疫、荧光显微镜观察
&特别适合高倍显微镜观察和培养细胞的染色观察
产品特点：
玻片类，细胞爬片
盖玻片厚度为0.2mm,直径分为13mm／15mm／22mm／25mm,耐受实验室常用溶剂,细胞表面经过特殊处理,适宜细胞生长,安全无污染并且使用方便易于操作.
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13mm／15mm 24孔培养板专用（已灭菌）
22mm 12孔培养板专用（已灭菌）
25mm 6孔培养板专用（已灭菌）
玻片类，细胞爬片 &相关耗材：
&细胞爬片(盖玻片,细胞培养盖玻片,圆形盖玻片)
&石英比色皿
&载玻片存储盒
&防脱载玻片&
克拉玛尔试剂 是上海谱振生物科技有限公司的自主试剂品牌。自上个世纪 90 年代，产品出口到如英国，西班牙，法国，德国，美国，日本和巴西，韩国等多个国家和地区。经过我们不断改善的优良品质，在海外获得大好市场，赢得了大批国外进口商的青睐和首肯。十多年的发展历程，公司始终坚持“创新，品质，服务，节约，敬业，感恩”的理念。吸收新创意，严把质量关口，全方位 的服务跟踪，坚持做出高品质产品。本着“追求、员工、技术、精神、利益”的宗旨。现拥有一批精干的管理人员和一支高素质的专业技术队伍。我们以质量为生命、时间为信誉、价格为竞争力的经营信念，立足于国内外市场。目前已在全国各大院系，和研究单位均有销售，也得到了客户的认可。克拉玛尔试剂进入飞速发展期，为了更好的服务客户，公司长期储备海量库存，以此助推中国科技的快速发展，更好的造福人类！ 联系电话请以官网为准，其他平台的联系方式请勿轻易相信 郑重提醒： 本公司产品仅对单位销售，个人一律不能购买。 若是以个人帐户汇款的还需提供盖有公司章的汇款底单，否则不予发货。 上海紫一试剂厂主营生化试剂等。公司秉承“顾客至上，锐意进取”的经营理念，坚持“客户第一”的原则为广大客户提供优质的服务。欢迎惠顾！
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缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的研究
程 阳1 唐桥斐2 赵丽妮31.沈阳医学院病理生理学教研室，辽宁沈阳 .沈阳医学院沈洲医院耳鼻喉科，辽宁沈阳 .沈阳医学院药理教研室，辽宁沈阳 110034[摘要] 目的 探讨缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡和凋亡相关基因表达的相关机制。方法 取体外新生大鼠心肌细胞作为试验样本，将其随即平均分配为四组，A组为对照组，B组为模拟缺血组，C组为缺血2 h后再灌注1h组，D组为缺血持续3 h组。采用TUNEL法对各组样本心肌细胞凋亡情况进行检测，并采用免疫组织化学法对Bcl-2/Bax基因的表达情况进行检测。结果 在心肌细胞I/R后，检测到明显的阳性凋亡细胞，同时D组和C组细胞凋亡指数明显高于B组，差异具有显著性（P&0.05）；免疫组织化学检测结果表明，Bax蛋白表达明显上调，Bcl-2基因表达明显下调。结论 缺血和缺血再灌注均会造成心肌细胞凋亡，同时心肌细胞的凋亡同Bcl-2/Bax基因的表达之间存在一定的相互作用关系。[教育期刊网 关键词 ] 缺血再灌注；心肌细胞凋亡；凋亡相关基因表达[中图分类号] R541　[文献标识码] A　[文章编号] （2014）06（b）-0141-02[作者简介] 程阳（1977-），女，回族，辽宁沈阳人，硕士，讲师，研究方向：心肌缺血再灌注损伤的机制，耳鼻喉疾病的发病机制。邮。相关研究显示，心肌细胞在缺血再灌注过程中，有病理性细胞凋亡现象存在，是细胞死亡在缺血再灌注损伤过程中的主要形式[1]。近年来，关于缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡的研究多为整体研究，由于在体心肌的缺血再灌注模型受到多方面因素的影响，如体液调节、神经调节等，本次研究通过以体外大鼠新生心肌细胞作为研究对象，建立缺血再灌注模型，对缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡和凋亡相关基因的表达进行研究[2]。本次研究于2013年3月—2013年9月期间通过构建大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤模型，通过TUNEL法对凋亡细胞进行检测，采用免疫组织化学法对相关凋亡基因表达状况进行检测，以对缺血再灌注损伤过程中心肌细胞的凋亡现象进行研究探讨，并对相关基因的表达同心肌细胞凋亡之间的关系进行研究，旨在为临床研究提供可靠的证据。现将结果汇报如下。1 资料与方法1.1 一般资料采用Bochringer Mannheim公司生产的TUNEL试剂盒和荧光标记素，以小鼠抗大鼠Bcl-2、Bax单克隆抗体作为一抗，以生物素标记羊抗鼠抗体为二抗，以辣根过氧化物酶标记链亲和素作为三抗，以上均有北京中山公司提供。1.2 方法1.2.1 心肌细胞培养选取新生的健康SD雄性大鼠10只（由本地实验动物中心提供），体重（244±11.16）g，日龄1~2 d，将心脏在无菌条件下取出，剪裁心室组织得到若干1~3 mm2均匀小块，使用0.25%胰酶对其进行4次消化处理，手机单细胞悬液并离心，并制备成单细胞悬液，在二氧化碳孵箱中培养45 min后，吸出浓度较高的心肌细胞悬浮液，在小牛血清中培养，将细胞密度调整为5×105个/mL，在在6孔培养板中接种，培养36 h后进行试验。1.2.2 心肌细胞爬片的制备将制备好的浓度均匀的心肌细胞悬液于六孔细胞培养板中培养，72 h后，改为在无Brdu的0.5%小牛血清DEEM中孵育36 h并进行试验。1.3 制备缺血再灌注模型缺血模拟：以模拟缺血液取代常规心肌细胞培养液，在厌氧罐中放入培养板，将5%CO2混合95%N2充入瓶内，持续40 min，以充分排出O2，在37℃环境中进行2 h培养；再灌注模拟：在模拟再灌注液中进行缺氧心肌细胞1h培养。1.4 心肌细胞鉴定采用免疫组织化学法联合形态学对心肌细胞进行鉴定。1.5 实验分组将培养的原代新生大鼠心肌细胞随机分配为A组（正常对照组），B组（模拟缺血2 h）、C组（缺血2 h后给予1 h再灌注）及D组（持续缺血3 h），每组包括10例细胞爬片。1.6 TUNEL染色按照相关操作方法，对各组细胞爬片进行凋亡细胞的检测，以不加TDT酶作为阴性对照，判定标准以核阳性为准，对凋亡指数进行计算。1.7免疫组织化学法染色按照ABC法，对各组的心肌细胞爬片进行Bcl-2/Bax免疫组织化学染色。1.8荧光显微镜观察将各组心肌细胞制备成细胞悬液，将细胞密度调整为1×107个/mL，加入溴化乙锭、Y啶橙，混合均匀后制备载玻片，并在荧光显微镜下进行观察。1.9 统计学方法本次研究采用统计学软件SPSS 13.0对所有数据进行分析处理，采用平均值±标准差的形式表示计量资料，采用t检验对数据进行相关性检验，P&0.05时认为差异具有统计学意义。2 结果 2.1 心肌细胞鉴定结果新生大鼠心肌细胞经过3 d的培养，细胞贴壁，其中正常心肌细胞呈现不规则三角形或索性，细胞核居中并呈卵圆形，胞体存在折光性明显，立体感较强，显微镜下可观察到明显伪足，搏动规则，频率80~100次/min，免疫组织化学染色结果表明，细胞纯度在90%以上。2.2 TUNEL检测及相关基因表达结果4组心肌细胞胞核均存在明显的程度不同的黄褐色反应，胞浆未染色；4组细胞的胞浆中均存在Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达，胞浆中存在明显可见的棕黄色颗粒。细胞凋亡指数及相关基因表达结果见表1。由表中数据可知，缺血模型的心肌细胞的凋亡指数及Bax基因的表达情况均明显高于对照组，Bcl-2基因的表达情况明显低于对照组，差异具有显著性（P&0.05）；其中持续缺血3 h组和2 h缺血后给予1h再灌注组细胞的凋亡指数及Bax基因的表达情况明显高于缺血2h组，Bcl-2基因的表达情况明显低于缺血2 h组，即Bax基因的表达情况存在明显上调，Bcl-2基因的表达存在明显下调。表14组心肌细胞凋亡指数、Bax/Bcl-2表达统计结果注：同A组比较，*P=0.000，t凋亡指数=11.271，tBax=27.034，tBcl-2=18.683；同B组比较，**P=0.000，t凋亡指数C=9.243，tBax-C=8.951，tBcl-2-C=6.562； t凋亡指数-D=6.571，tBax-D=1.671，tBcl-2-D=12.809。2.3 荧光显微镜观察结果在荧光显微镜下，可观察到A组细胞的细胞形态完整，细胞膜光滑，细胞核居中；其余三组缺血模拟组细胞均存在明显的凋亡表现：细胞膜完整，但存在皱缩现象，胞膜出芽或鼓泡，核固缩，核仁裂解，细胞在细胞膜的内陷作用下被分割为凋亡小体。3讨论当前，临床医学和生物学上普遍应用细胞培养技术进行相关研究。部分资料表明，在离体大鼠心肌细胞的缺氧复氧模型中，若心肌细胞存在2 h缺氧，给予1 h复氧后，其功能和结构的改变情况同心肌缺血再灌注模型一致性较高[3]。因此本次研究中采用离体大鼠心肌细胞缺氧复氧模型作为心肌缺血再灌注损伤的模拟，对其病理生理过程进行分析。由于心肌缺血再灌注损伤过程中，会导致机体酸碱平衡失衡及离子浓度改变，对心肌细胞的损伤均会造成一定影响，因此本次研究中采用缺血模拟和溶液再灌注来对缺血和再灌注过程中酸碱失衡和离子浓度变化进行模拟。研究显示，单纯的心肌缺血和缺血再灌注均会造成心肌细胞的凋亡，目前临床上普遍将细胞凋亡作为心肌缺血再灌注损伤的主要特征，以同单纯缺血无细胞凋亡和缺血性损伤进行区别[4]。本次研究中，采用TUNEL法，对缺血2 h模拟组、缺血模拟2h之后给予1 h灌注组和持续缺血3 h组细胞培养基进行标记，以对阳性凋亡细胞进行统计分析，在荧光显微镜的观察下，三组缺血模拟组细胞均观察到明显可见的细胞凋亡形态结构变化特征：细胞膜完整，但存在皱缩现象，胞膜出芽或鼓泡，核固缩，核仁裂解，细胞在细胞膜的内陷作用下被分割为凋亡小体，表明单纯的缺血和缺血后再灌注均会造成细胞凋亡，同时本次研究显示，续缺血3 h组和2 h缺血后给予1 h再灌注组细胞的凋亡指数明显高于缺血2 h组，差异具有显著性（P&0.05），表明延长缺血时间和给予再灌注，均会加速凋亡过程，对心肌细胞造成进一步损伤。研究证明，细胞凋亡主要是受细胞内相关的凋亡基因控制，并受到细胞外信号影响，是一种分子调控机制的细胞死亡形式[5]。其中Bcl-2基因组、Fas抗原及抑癌基因p53均同细胞凋亡有关，其中Bcl-2基因组同细胞凋亡的关系最为密切，主要包括Bcl-2等抗凋亡基因和Bax等促凋亡基因，二者通过相互作用对细胞凋亡进行控制[6]。本次研究中，免疫组织化学染色观察结果显示，在对照组（正常心肌细胞组）中，存在一定程度的Bax和Bcl-2基因的表达，在缺血模拟组中，较对照组而言，Bcl-2基因的表达存在明显的下调，Bax基因的表达存在明显的上调，差异具有显著性（P&0.05）。其中，持续缺血3 h组和2 h缺血后给予1h再灌注组细胞的Bax基因的表达情况明显高于缺血2 h组，Bcl-2基因的表达情况明显低于缺血2 h组，差异具有显著性（P&0.05）。这一结果表明，Bax/Bcl-2基因在心肌缺血再灌注损伤过程中参与了细胞凋亡的相关调控过程，主要表现为抗凋亡基因的表达下降，促凋亡基因的表达上升，具体的调控机制仍需做进一步研究。本次研究通过在细胞水平上对心肌缺血再灌注损伤进行评价，结果显示，细胞凋亡可作为缺血再灌注损伤和单纯缺血性损伤的病理变化特征性形式，其中Bax/Bcl-2基因在细胞凋亡的过程中起着主要的调控作用，因此临床进行心肌缺血再灌注损伤的预防和治疗时，建议对细胞凋亡和相关凋亡基因的表达进行有效干预，从而实现良好的临床疗效。[教育期刊网 参考文献][1]虞燕萍，周承亮，傅云峰，等. 姜黄素对缺血再灌注H9c2心肌细胞凋亡和GSK-3表达及其磷酸化的影响[J]. 中国中西医结合杂志，):240-243.[2]田金，王雄.AMP579与腺苷对缺血再灌注心肌细胞凋亡及作用机制的比较[J].中西医结合心脑血管病杂志，): 572-573.[3]陈晓敏，丁欣，王汐.疏血通注射液对大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡和P53的影响[J].广东医学院学报，2013(2): 121-123.[4]庄梅，吴代琴，雷大卫.不同剂量的地塞米松对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡及核因子κB表达的影响[J].中华老年心脑血管病杂志，):538-540.[5]张武宁，陈牧雷，杨新春，等. 心肌细胞凋亡在老年性缺血再灌注后心力衰竭发生中的作用[J].中华老年心脑血管病杂志，):795-798.[6]张维娜，陈龙，高玉峰，等.生黄合剂对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡及相关基因Bax、Bcl-2蛋白表达的影响[J].时珍国医国药，):.（收稿日期：）
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丁香园网友CancerInsighter 补充：
首先，关于消毒的问题，如果细胞在玻片上的时间不到24小时，个人认为玻片泡酸、清洗就行了，不需要消毒。如果需要细胞在玻片上生长较长一段时间，则泡酸清洗后必须消毒。消毒时我喜欢把玻片放在盛有75%酒精的小烧杯里面，用的时候用镊子小心夹出玻片，在酒精灯上过一下（1秒左右，时间长了玻片会碎裂），玻片上的酒精会被点燃，待酒精烤干就可以用了。效果还是不错的，这种方法我用了半年，只污染过一次（还不一定是玻片的问题），而且每次细胞在玻片上培养的时间一般在7天以上。
滴加细胞悬液的时候，事先细胞一定要混匀。如果细胞比较多，可以直接往培养皿或孔板内滴加细胞悬液，覆盖玻片，轻柔混匀，注意呈%26十%26字形摇晃。如果细胞数量少，需要把细胞都滴加在玻片上，则要先从边缘开始，然后再往中央滴，这样有利于细胞均匀分布在玻片上。滴的时候速度要慢，让液体依靠表面张力呈薄层覆盖玻片，要防止细胞悬液溢出玻片。这样一般2-4小时后细胞就贴壁了，这时候再补足的培养基，覆盖波片。
玻片的正反面。这个没注意有可能前功尽弃。关键是取、放玻片的时候要全神贯注，不能搞反了。采用其他的方法可能更麻烦，不如自己小心点。另外取玻片的时候，由于玻片比较薄，可以用1毫升的胰岛素注射针自制一个钩子，把针头折弯就可以了，这样取玻片的时候比较方便。
染色滴加抗体时，为了节省抗体，可以先把抗体滴加在干净的载波片上，然后玻片的细胞面朝向抗体倒扣，同时注意防止气泡 和玻片的正反。一般24毫米的玻片只需要30-50微升抗体。当然如果操作不熟练，抗体又足够，那就直接在玻片的细胞面上加抗体吧 。
玻片上细胞的漂洗。我从来不冲洗，只用PBS 浸泡，泡了就倒掉，半分钟都不到，时间的长短个人感觉影响不大，能把残留的抗体洗掉就行了。
细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是倒掉固定液，PBS 漂洗后干片保存在4度，最长半年没问题。当然可能不同抗原的保存效果不一样。
细胞爬片、甩片的制备
（一）细胞爬片的制备
（1）如果使用载玻片或盖玻片，必须在使用之前灭菌。可以一次灭菌并贮存在无菌状态下。如果使用少量的盖玻片，用金属镊子夹住盖玻片，在70%乙醇中浸泡，然后在火焰上烤干。要轻轻地镊取，以防破裂。为了方便起见，可以将盖玻片浸泡于70%的乙醇中，使用时放在火焰上处理。如果使用的盖玻片或载玻片数量较多，可以将它们放于专用的金属支架上，然后高压消毒。如果需要的数量更大，则可将其放在耐热的容器中，干烤2小时；
（2）在无菌状态下，把干燥的玻片放于适当的培养皿中。盖玻片可以用金属镊子镊取，圆形盖玻片可以放在24孔培养板的孔中，直径90mm 的培养皿能够放入10-15张盖玻片，或者放入一张标准的载玻片；
（3）将悬浮的细胞放入组织培养皿中，培养至少24小时，让细胞贴附在玻片上。要想得到一个较好的结果，在加细胞时，密度应低，以防细胞密度过高。
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概况和特点：
WHB一步法细胞爬片采用高端的玻片制作，厚度为0.17mm，有圆形和方形。已处理，已灭菌，拆开即用。
进的玻片表面处理技术（TC处理→超强吸附）可促进细胞在玻片上贴壁生长，细胞贴壁牢固。
即使在后期免疫组化、免疫荧光、原位杂交处理过程中也不易脱片，避免传统方法中从培养瓶转移到载玻片上的损伤。使用一步法细胞爬片
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