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两个基因相似度很高，如何分别做荧光定量？
两个基因CDS相似度很高，达92%，而且CDS的5端和3端基本一致，做RACE克隆UTR区域是不是也容易混淆，请问该如何设计荧光定量引物？使得这两个基因区分开？
是有几个差异碱基，但大部分一样，会不会互相互补呢？
我做过实验保证一个引物3'端最顶端几个碱基是差异碱基基本上没问题
CDS很像 是不是克隆UTR也很难分开
哦，前面我理解可能有误，你现在基因的UTR区序列还是未知的，这样用RACE法克隆UTR是不容易分开，如果要做定量设计引物，那就按2、5楼的建议来吧。
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扫描下载送金币如何快速从转录组结果中挑基因设计引物
基迪奥的技术咖又分享干货了，今天的主题是：如何快速从转录组结果中挑基因设计引物。如何快速的从转录组结果中挑选unigene设计引物的呢？一起来看看教程~Step One：调取unigene序列信息以某个转录组denovo结果为例，存放unigene序列的文件一般放在assembly文件夹中，有个以fa文件结尾的文件就是啦。例如文件路径：\Denovo_Upload\assembly\Unigene\Unigene.5-3.fa大家设计引物最好找已确定unigene方向的5‘-3’的fa文件的基因，在denovo结果里面，也在assembly文件夹中。例如下面两个图分别是同一个unigene在fa文件与5‘-3’的fa文件中的形式。Unigene.fa用EditPlus打开，fa文件中是没有确定方向的序列。5‘-3’的fa文件中序列以5‘-3’的形式固定了下来。可看到图中同一基因序列反向互补，在5‘-3’的fa文件中确定了基因方向，是以5‘-3’形式显示基因序列的。接下来我们以Unigene0027215为例，查找序列。这一步是查找Unigene0027215。找到了Unigene0027215点鼠标右键把序列复制下来。Step Two：引物设计为什么用NCBI设计引物呢？技术咖说，因为在线方便啊。其它的引物设计软件要下载安装，而且好不容易在网上找到个安装包，结果安装的时候发现不是破解版，要什么验证码之类的，好麻烦。我们首先打开NCBI主页然后拉到下面有个Primer-BLAST，进入其页面。点击进入把之前复制的序列粘贴在框内。另外大家设计引物的时候，有很多参数可以修改，比如根据自己的序列确定上游引物从哪里开始，或者固定上游或者下游引物，是否跨越内含子外显子区域等等。其它参数默认,不用更改。如果不清楚，也可以点击网页上的“？”小标志，可以看到参数设置的详细说明。（点击图片，放大查看更清晰）接下来点击&Get Primers&……结果出来了,下图是给出的10对引物的扩增出的片段位置和长度。再下面是10对引物的详细信息。备注:下图标注的地方也可以把你调取的多条基因序列放入一个txt记事本文件里面,以fa格式（就是第一行：&号基因编号，下一行序列）然后提交。不过最近NCBI说不支持多条序列一起设计引物（看下图~）,所以目前只能一条条做了。说一下结果，有10对引物，该怎么挑选呢？首先扩增片段长度，一般定量不要用很大的片段，150bp-500bp；两个TM值相差越小越好；GC含量最合适范围50%-65%；self complementarity 和self 3' complementarity数值越小越好，非特异性扩增和引物二聚体就越少。由于是互补性，存在的话如果较高前者容易产生引物二聚体，后者容易产生非特异扩增产物。用NBCI设计引物，两步就OK了，dei不dei，然后就是挑选引物了。好哒，今天就酱紫了~ 觉得教程不错就转发朋友圈吧~
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基因结构分析软件对实时定量PCR引物进行设计和筛选
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