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使用siRNA、miRNA mimic 、pre-miRNA进行miRNA 生物学功能研究的区别
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&&已有文献报道表明,等量的miRNA mimics 和pre-miRNA 进入体外或体内时,pre-miRNA能更特异地且高效的形成mature miRNA,并表现出更高的生物学活性。鉴于pre-miRNA 具有高效、低细胞毒性的特点,我们合成了pre-miR-21 和miRNA mimic,以相同剂量转染细胞,然后用RT-PCR 检测miRNA-21 成熟体的形成。试验结果表明效果远优于mimics,因此pre-miRNA在系统多因素的研究中具备其更独特的优势!
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【求助】是检测pre-miRNA呢还是检测mature miRNA
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这个帖子发布于4年零196天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:5
我想用qPCR检测某个miRNA在某种疾病中的表达，是该检测其pre-miRNA呢还是检测mature miRNA？另外这两者从实验难度和花费上来说差别大吗？
不知道邀请谁？试试他们
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看看这里的说法吧
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loyh edited on
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我觉得后者，检查前者只能说一个预测吧，就像检查蛋白量的差异用western比检验相应的southern要准确一样。
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doctorcck 我想用qPCR检测某个miRNA在某种疾病中的表达，是该检测其pre-miRNA呢还是检测mature miRNA？另外这两者从实验难度和花费上来说差别大吗？1、我觉得应该检测成熟的miRNA，毕竟起作用的是成熟体。2、这两个其实检测无论从实验难度和花费来说都区别不大（除非你成熟体用探针检测）。但pre因为有高级结构，所以pcr时候可能会有些难度。不过一般不会太难。3、其实有的miRNA，pre和成熟体的表达趋势相差很大，我遇到过一个pre表达达到几十倍区别，但成熟体才1-2倍区别，但啥原因没搞清楚，我也没研究。4、我做的时候，其实成熟体的荧光定量都用的差不多相同的颈环RT引物和上下游引物，而pre的就是自己设计的那个部分的引物，下游作为RT引物同时作为PCR引物，所以两者我做的时候就是多一些引物合成的费用。
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lotus5 1、我觉得应该检测成熟的miRNA，毕竟起作用的是成熟体。2、这两个其实检测无论从实验难度和花费来说都区别不大（除非你成熟体用探针检测）。但pre因为有高级结构，所以pcr时候可能会有些难度。不过一般不会太难。3、其实有的miRNA，pre和成熟体的表达趋势相差很大，我遇到过一个pre表达达到几十倍区别，但成熟体才1-2倍区别，但啥原因没搞清楚，我也没研究。4、我做的时候，其实成熟体的荧光定量都用的差不多相同的颈环RT引物和上下游引物，而pre的就是自己设计的那个部分的引物，下游作为RT引物同时作为PCR引物，所以两者我做的时候就是多一些引物合成的费用。嗯，太感谢了，追加几个丁当聊表谢意。我之所以纠结是因为我用的标本都是我师姐做实验已经逆转录好了的cDNA（当然总RNA也还留着，有两三个月了，可能已经降解了。），好像用随机引物逆转录的cDNA不能用来检测成熟体是吧（我的理解是可以用来检测pre-miRNA），而且我的试剂都是普通逆转录试剂盒，和普通荧光定量pCR试剂盒。
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关于丁香园pre-miRNA质粒载体_淅玛生物科技有限公司
一. MicroRNA简介
MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。&
二. MicroRNA形式
1. pre-miRNA&
约70bp含microRNA茎环结构的pre-miRNA。
&&&&&&制备方式：化学合成、生物转录合成、pre-miRNA质粒表达载体、pre-miRNA病毒。
2. pri－miRNA
天然pri－miRNA&
&&&&&&从染色体基因文库中调取300bp－1000bp完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体），以强大的CMV启动子操纵该300bp－1000bp microRNA。
人工pri－miRNA
&&&&&&选择一个完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体）。以人工合成的约70bp含miRNA茎环结构的目标pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol Ⅱ/pol III 启动子操纵该microRNA结构单元。
三. MicroRNA选择
★pre-miRNA是最早采用的microRNA，拥有大量的成功报道。化学合成的pre-miRNA制备快捷，可以标记荧光等追踪。缺点是制备的RNA稳定性较差，而且，由于制备的microRNA较长，合成时RNA的错误难以避免（当合成RNA超过60bp时，出现一个碱基错误率约30％），转录制备的pre-miRNA稳定性较好，但无flank结构，很少使用。质粒载体形式的pre－miRNA也因为发现microRNA的flank对于microRNA功能和测定非常重要，现已逐渐被pri-miRNA取代。
★人工pri-miRNA效果较pre-miRNA好，也有足够多的成功使用的经验报道，但这种人工microRNA采用固定的mir155 flank，制备的microRNA功能不及天然原始microRNA，故也逐渐较少使用。
★原始天然pri-miRNA克隆自天然文库的microRNA由于保留了每个microRNA独自的原始天然双臂结构，效果更好，是近来被首选方法。
★pre-miRNA或pri-miRNA腺病毒：可以转染大多数绝细胞，产品质量可靠。缺点是腺病毒有一定的毒性，以往实验腺病毒毒性并未引起重视，但我们发现在microRNA实验中显得比较突出。另外，制备周期长，费用高也是不容忽视的缺点。
★慢病毒microRNA：目前最好的microRNA实验产品，缺点是慢病毒自身的不足，即制备lenti－virus时，病毒的质量批间差异较大。
★AAV、或retrovirus microRNA：与腺病毒和lenti－virus microRNA一样，具有病毒产品的优势与缺点。
四. MicroRNA产品
Pri-microRNA
天然Pri-microRNA定制
300－1000 bp
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 病毒：腺病毒/慢病毒
人工Pri-microRNA订制
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 病毒：腺病毒/慢病毒
Pre-microRNA
&&&&&&&&&&&&&&&&&& 化学合成或生物转录
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 病毒：腺病毒/慢病毒
1. pri－miRNA载体/病毒构建服务
★从人类基因组中扩增的pri-miRNA。
★microRNA完全忠实于细胞内的天然结构,具有更高的效率。
★microRNA表达质粒载体与晶赛公司的腺病毒、慢病毒系统完全兼容，方便制备病毒。
★EGFP和miRNA在CMV启动子的引导下共表达。
★microRNA质粒测序。
★更多及详细microRNA情报请通过Email：咨询。
★更多新发现的microRNA请参见MiRBase：。
2. pri－miRNA或pre－miRNA载体/病毒构建服务
★pre-microRNA表达质粒、病毒
&&&&& ① microRNA转录结构单元通过增强型Pol III 启动子（hU6, hH1, h7SK, mU6）引导pre-miRNA的过表达。
&&&&& ② 可选择带EGFP荧光标签。
&&&&& ③ 终产品均经过严格测序。
&&&&& ④ 载体类型：和siRNA一样，microRNA的效率只与&启动子－miRNA－终止信号&转录结构单元有关，因此任何质粒microRNA作用效果应该基本一致，质粒小一些对于细胞转染效率略有好处。晶赛公司的microRNA质粒与腺病毒、慢病毒系统完全兼容，许多表达载体已包装成腺病毒及慢病毒，有数十种载体可供选择，请Email咨询载体情报。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。
★pri－microRNA表达质粒、病毒
&&&&& ① pre-microRNA＋mir155的microRNA两臂共同组成pri-microRNA。
&&&&& 质粒可用于直接制备基于FIV的慢病毒，并同时与晶赛公司的腺病毒系统完全兼容。
&&&&& ② EGFP和miRNA在CMV启动子的引导下共表达。
&&&&& ③ 终产品均经过严格测序。
&&&&& ④ 载体类型：和siRNA一样，microRNA的效率只与&启动子－miRNA－终止信号&转录结构单元有关，因此任何质粒microRNA作用效果应该基本一致，质粒小一些对于细胞转染效率略有好处。晶赛公司的microRNA质粒与腺病毒、慢病毒系统完全兼容，许多表达载体已包装成腺病毒及慢病毒，有数十种载体可供选择，请Email咨询载体情报。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。
3. 生物转录合成microRNA
产品形式为70bp左右的pre-microRNA。
&&&&& 生物合成的microRNA有较之化学合成的microRNA有更高的稳定性及效率。以晶赛专利的高保真RNA生物合成技术为基础的microRNA产品有着迄今最好的正确率，从而确保您实验的成功。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。&
4. 化学合成的microRNA
产品形式为70bp左右的pre-microRNA。
&&&&& 化学合成非常快捷，您定购一周后就可以开始您的实验。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。&
5. MicroRNA病毒载体
腺病毒MicroRNA
&&&&& 全部MicroRNA产品均能够以腺病毒形式提供。
&&&&& 慢病毒MicroRNA
&&&&& 提供慢病毒MicroRNA质粒、转染试剂、包装细胞，操作方法。您可以方便地自己制备慢病毒。&
五. 服务价格
天然pri－microRNA：&3500元/50ug& microRNA，包括质粒对照。
&&&&& Pre－microRNA载体构建：1900元/50ug& microRNA，包括质粒对照。
&&&&& 其它形式的microRNA，请咨询。
&microRNA liberies: pri-miRNA with flanking质粒载体产品订购
RNAi and microRNA
直接网络订购
Email to：当前位置：>>>pre-miRNA
2012年04月份
RNAi是一种由双链RNA介导的序列特异性基因沉默现象。RNAi行使功能的机制与miRNA相同，都是一种在进化上十分保守的RNA-蛋白质机制。miRNA是由21至23个核苷酸组成的内源非编码RNA。随着RNA为基础的
2012年04月份
MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。
2012年04月份
microRNAs(miRNAs)是一种小的，类似于siRNA的分子，由高等真核生物基因组编码，miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。miRNAs在物种进 化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。尽管在10年前已经
创新加油！生物医药创新第一歌—高圣之歌
Copyright ?
All Rights Reserved. 增值电信业务经营许可证:粤B2-粤ICP备号-3使用siRNA、miRNAmimic、pre-m；Frank；miRNA是一类大小约为22个碱基的小RNA分子；定性，从而抑制靶基因的表达；成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过一系列核；羟基；由于当前市场上的miRNA产品类型有诸多不同，因；一般来说，采用miRNA表达载体能获得稳定表达m；研究miRNA的科研人员都选择直接转染物美价廉的
使用siRNA、miRNA mimic 、pre-miRNA进行miRNA 生物学功能研究的区别
miRNA是一类大小约为22个碱基的小RNA分子。它们在转录后阶段对基因表达进行调控。调控机制是通过与靶基因的mRNA互补序列结合，抑制蛋白质的 翻译或降低mRNA的稳
定性，从而抑制靶基因的表达。科研人员已逐步认识到miRNA在细胞的发育，分化，生长等生命活动中起着非常重要的调控作用，因此越来越多的科研人员把目光聚焦到这一领域，并期待能一窥miRNA的科学奥妙。
成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，初级转录物称为pri-miRNA。pri-miRNA长度从几百到几千个碱基不等，带有5‘帽子和3’polyA尾巴，以及1到数个发夹径环结构。Pri-miRNA经剪切产生约70个碱基的miRNA前体，即pre-miRNA。 pre-miRNA为单一发夹结构，5‘带有磷酸基团，3’有两个突出碱基，并带有3’
羟基。pre-miRNA经进一步剪切，形成长度约为22个碱基的单链成熟miRNA。
由于当前市场上的miRNA产品类型有诸多不同，因此对于初入此领域的科研人员来说，选择哪种形式的miRNA进行科研试验往往成为困惑。除了构建miRNA表达载体外，市场上人工合成的miRNA产品主要有siRNA， miRNA mimic，pre-miRNA等几种设计类型，实际上不同的类型各有优缺点，科研人员应该根据试验的不同要求来进行选择，从而得到最想要得到的结果。
一般来说，采用miRNA表达载体能获得稳定表达miRNA的细胞株，但也存在质粒的转染效率要低于RNA oligo，无法定量转染，过表达影响细胞内非靶基因/功能等缺点，因此目前很多
研究miRNA的科研人员都选择直接转染物美价廉的人工合成miRNA产品。miRNA产品中的siRNA，miRNA mimic都是基于内源性pre-miRNA的成熟形式设
来，从而使其具备miRNA生物学功能
并应用于miRNA的功能分析研究，但这些设计也会不同程度的影响细胞或体内的非靶基因/功
能。为尽可能降低上述脱靶效应，miRNA mimic往往还对核苷酸进行特定修饰，从而筛选出最接近pre-miRNA生物学功能的序列设计，但是通常情况下其功能性及特异性仍稍逊于pre-miRNA。pre-miRNA虽然具备独特的优势，但是因为当前RNA的合成工艺一直无法有效突破50个碱基左右的瓶颈，所以其价格成本较高。
已有文献报道表明，等量的miRNA mimics 和pre-miRNA 进入体外或体内时，pre-miRNA能更特异地且高效的形成mature miRNA，并表现出更高的生物学活性。Richard I. Gregory等在体外将pre-let-7和let-7 duplex 分别与Dicer-TRBP-Ago2共孵育，然后加入靶RNA进行反应。结果表明pre-miRNA对靶RNA的剪切活性明显优于miRNA duplex。Daniela Castanotto等用siRNA、shRNA、pre-miRNA分别或联合转染细胞研究表明，pre-miRNA不仅与外源siRNA/shRNA存在的竞争性抑制最小，而且对内源性其它miRNA的影响也最小。其原因可能是shRNA/siRNA挤占细胞内有限的RISC资源，而pre-miRNA具备高特异性序列结构避免过度侵占细胞内部资源。
由于miRNA为内源单链RNA，对依赖双链RNA的蛋白激酶（PKR）和寡腺甙酸合成酶（2',5'- oligoadenylate synthetase，2-5A）干扰素诱生系统不敏感，PKR和2-5A系统只能特异地与双链RNA结合，不能与单链或RNA-DNA杂交链结合，因此pre-miRNA在in vitro/in vovo水平上能一定程度的避免细胞毒性，进而减少细胞凋亡。
Carol A. Sledz等研究表明短链dsRNA也会诱导产生干扰素效应，虽然这种效应有时候比较弱，但是其具有普遍性且呈剂量依赖性。M Bauer等则通过模拟内源pre-miR-30序列结构设计出amiRNA（artificial miRNA），其有效降低了shRNA的干扰素效应，干扰素相关基因Oas1及凋亡蛋白caspase 3均得到下调。
鉴于pre-miRNA 具有高效、低细胞毒性的特点，我们合成了pre-miR-21 和miRNA mimic，以相同剂量转染细胞，然后用RT-PCR 检测miRNA-21 成熟体的形成。试验结果表明效果远优于mimics，因此pre-miRNA在系统多因素的研究中具备其更独特的优势！
Reference：
1.Yoshinobu Shiba,et al,Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2’-O-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 10 .
2.David Brown et al，Metheds and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules,patent:US 8,058,250.
3.Daniela Castanotto et al, Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC Nucleic Acids Research, 2007, (35), .
4.Kazuya Terasawa et al，Synthetic Pre-miRNA-Based shRNA as Potent RNAi Triggers Journal of Nucleic Acids
（2011）, 1-6。
5.Dirk Grimm et al, Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways Nature ),537-541.
6.Richard I. Gregory,et al,Human RISC Couples MicroRNA Biogenesis and Posttranscriptional Gene Silencing Cell, Vol. 123, 631C640, November 18, 2005.
7.M Bauer et al，Prevention of interferon-stimulated gene expression using microRNA-designed hairpins Gene Therapy (2C147.
8. Onsam Sin et al,Gene Silencing Efficiency and INF-b Induction Effects of Splicing miRNA 155-Based Artificial miRNA with Pre-miRNA Stem-Loop Structures, Biochem Genet (C121.
9. Carol A. Sledz et al Activation of the interferon system by short-interfering RNA, Nature Cell Biology 2003(9)
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