炎症细胞因子IL-1β、IFN-γ对小鼠胰岛葡萄糖刺激下胰岛素分泌反应的影响--《昆明医科大学》2012年硕士论文
炎症细胞因子IL-1β、IFN-γ对小鼠胰岛葡萄糖刺激下胰岛素分泌反应的影响
【摘要】：第一部分小鼠胰岛的分离、纯化及鉴定
目的研究小鼠胰岛的分离、纯化方法。
方法采用多点注射灌注胶原酶消化胰腺,不连续密度梯度离心,联合人工挑取的方法纯化胰岛；台盼蓝染色观察胰岛活性,双硫腙(Dithizone, DTZ)对胰岛进行特异性染色计算胰岛的产量及纯度,葡萄糖刺激胰岛素释放实验(GSIS)检测胰岛的功能。
结果分离纯化后每只小鼠平均得到(114±15)个胰岛,平均纯度为(77.12±3.23)%,胰岛细胞活率90%。胰岛细胞对葡萄糖刺激反应良好,每约20个胰岛体外培养液中胰岛素水平在无糖、低糖(2.8mmol/L)和高糖(22.2mmol/L)刺激下分别为(23.80±3.52)μ IU/ml、(67.57±4.04)μ IU/mL和(164.32±10.75)p IU/mL。各组间比较,差异有统计学意义(F=322.36,P0.05)；两两比较,低糖组的胰岛素水平为无糖组的2.84倍(t=-14.15,P0.05),高糖刺激组的胰岛素水平为低糖刺激组的2.43倍(t=-14.59,P0.05),高糖刺激组的胰岛素水平为无糖组的6.90倍(t=-21.51,P0.05)。
结论采用多点注射灌注胶原酶消化胰腺,不连续密度梯度离心,联合人工挑取的方法纯化所得的小鼠胰岛产量及纯度较高、形态完整、能够感受不同浓度葡萄糖刺激,是一种简便高效的胰岛分离纯化方法。
第二部分炎症细胞因子IL-1β、IFN-γ对小鼠胰岛葡萄糖刺激下胰岛素分泌反应的影响
目的研究炎性细胞因子IL-1β、IFN-γ对小鼠胰岛葡萄糖刺激下胰岛素分泌反应的影响。
方法采用第一部分的方法分离纯化后所得的小鼠胰岛,经过夜修复后,手工挑取形态正常、包膜完整、大小相近的胰岛接种于24孔板(每孔约20个,共8孔),48小时后加入IL-1β(0.25ng/ml、2.5ng/ml)和/或IFN-γ(100u/m1、1000u/m1),细胞因子作用24小时后,换用无糖KRBH缓冲液培养30分钟,再在含22.2mM葡萄糖的KRBH缓冲液中孵育1小时,收集上清,放射免疫分析法检测胰岛细胞上清液中胰岛素浓度。
结果细胞因子作用于小鼠胰岛24小时后,对照组的胰岛素浓度为(40.61±0.74) uIU/ml,单纯葡萄糖(22.2mmol/L)刺激组的胰岛素释放量为(142.48±1.22)uIU/ml,组间比较差异具有统计学意义(t=-123.669,P0.05)；IL-1β (0.25ng/ml、2.5ng/ml)组在高糖(22.2mmol/L)刺激下胰岛素释放量为(113.83±5.65)uIU/ml及(91.01±2.62)uIU/m1,与单纯葡萄糖刺激组相比,胰岛素释放量分别下降20%[(113.83±5.65)对(142.48±1.22)uIU/ml,t=8.759,P0.05]及36%[(91.01±2.62)对(142.48±1.22)uIU/m1,t=30.874,P0.05]；IFN-γ(100u/m1、1000u/m1)组高糖(22.2mmoI/L)刺激下胰岛素释放量为(116.09±6.11)uIU/ml及(71.78±3.51)uIU/ml,与单纯葡萄糖刺激组相比,胰岛素释放量分别下降19%[(116.09±6.11)对(142.48±1.22)uIU/ml,t=7.336,P0.05]及49%[(71.78±3.51)对(142.48±1.22)uIU/ml,t=13.687,P0.05]；联合组(IL-1β2.5ng/ml+IFN-γ1000u/m1)在高糖(22.2mmoI/L)刺激下胰岛素分泌下降更明显,为(31.77±2.18)uIU/ml,较单独IL-1β(2.5ng/ml)组高糖刺激下胰岛素释放量下降65%[(31.77±2.18)对(91.01±2.62)uIU/ml,t=30.103,P0.05],较单独IFN-γ组高糖刺激下胰岛素释放量下降55%[(31.77±2.18)对(71.78±3.51)uIU/ml,t=-50.485,P0.05]；各组间比较,差异具有有统计学意义(F=329.098,P0.05)。
结论炎症细胞因子IL-1β、IFN-γ可抑制小鼠胰岛葡萄糖刺激下的胰岛素分泌,且二者有协同作用。
第三部分小鼠胰岛素瘤NIT-1细胞葡萄糖刺激下MAPK信号转导通路的活化
目的探讨小鼠胰岛素瘤NIT-1细胞葡萄糖刺激下MAPK信号转导通路的活化情况。
方法1、NIT-1细胞培养,接种于6孔板(1×105个/孔,共6孔),48小时后换用无糖KRBH缓冲液培养0.5小时,再在含0、5.5、11.1、16.7和22.2mM葡萄糖的KRBH缓冲液中孵育30/60分钟,收集细胞,用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化ERK1/2、p38及JNK的水平。2、NIT-1细胞培养,接种于6孔板(1×105个/孔,共6孔),48小时后换用无糖KRBH缓冲液培养0.5小时,再在含16.7mM/11.1mM葡萄糖的KRBH缓冲液中孵育0、5、15、30、60、120分钟,收集细胞,用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化ERKl／2、p38及JNK的水平。
结果1、葡萄糖刺激后NIT-1细胞ERK1/2磷酸化水平较对照组升高,随浓度增高升高幅度越明显,在16.7mM葡萄糖刺激后ERK1/2磷酸化水平达高峰；葡萄糖刺激后NIT-1细胞p38磷酸化水平较对照组升高,随浓度增高升高幅度越明显,在11.1mM葡萄糖刺激时p38磷酸化水平达高峰,之后更高的糖浓度刺激p38磷酸化水平逐渐下降。2、最适宜的糖浓度16.7mM葡萄糖刺激15分钟后ERKl/2开始活化,随刺激时间延长活化水平升高,在30分钟时NIT-1细胞ERK1/2磷酸化水平达高峰,随着刺激时间的延长ERK1/2磷酸化水平逐渐下降；最适宜的糖浓度11.1mM葡萄糖刺激5分钟开始活化,随刺激时间延长活化水平升高,在60分钟时NIT-1细胞p38磷酸化水平达高峰,之后的120分钟p38磷酸化水平下降。3、5.5、11.1、16.7和22.2mM葡萄糖刺激后NIT-1细胞JNK磷酸化水平无升高。
结论葡萄糖刺激可活化NIT-1细胞ERK1/2、p38信号转导通路,对JNK通路的活化无影响。
【关键词】：
【学位授予单位】：昆明医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：R587.1【目录】：
中英文缩略词5-6摘要(第一部分）6-7Abstract（第一部分）7-8摘要（第二部分）8-10Abstract（第二部分）10-12摘要（第三部分）12-13Abstract（第三部分）13-15前言15-18 参考文献17-18第一部分 小鼠胰岛的分离、纯化及鉴定18-32 引言18-19 材料与方法19-24 结果24-26 讨论26-30 参考文献30-32第二部分 炎症细胞因子IL-1β、IFN-γ对小鼠胰岛葡萄糖刺激下胰岛素分泌反应的影响32-47 引言32-33 材料和方法33-37 结果37-41 讨论41-44 参考文献44-47第三部分 小鼠胰岛素瘤NIT-1细胞葡萄糖刺激下MAPK信号转导通路的活化47-68 引言47-48 材料与方法48-54 结果54-61 讨论61-65 参考文献65-68综述68-76 参考文献74-76发表文章目录76-77致谢77
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