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[求助]用做细胞爬片的盖玻片的处理
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[求助]用做细胞爬片的盖玻片的处理
我的处理是：
1. 无水乙醇浸泡72小时
2. APES处理：APES与丙酮1：50混合，盖玻片在其中浸泡30秒，稍干燥，在纯丙酮中涮两下，烘干。
我的问题是，盖玻片碰到液体就相互粘在一起，很难分开，而且粘合面不能与液体接触，达不到浸泡目的，所以要一片一片的用镊子夹着做，累的半死。效率实在是低。还有啊，处理过后，片子上老是有白色的斑斑点点的东西，我已经很小心的把他们一片片竖起来凉干了，还是这样，无奈啊。
大家都是怎么处理的啊？有没有便捷有效的方法啊？
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先应该用硫酸浸泡过夜，冲洗后再用无水乙醇处理，这样通常就不会有斑点了，
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我处理如下：1.75%酒精浸泡过夜。
2双蒸水浸泡、冲洗。
3.三蒸水浸泡冲洗
4.放在铁饭盒高压灭菌。
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原帖由 vera+ 于
13:03 发表
先应该用硫酸浸泡过夜，冲洗后再用无水乙醇处理，这样通常就不会有斑点了， 硫酸浓度多少啊？
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原帖由 wood533 于
13:03 发表
我处理如下：1.75%酒精浸泡过夜。
2双蒸水浸泡、冲洗。
3.三蒸水浸泡冲洗
4.放在铁饭盒高压灭菌。 你这样处理好象只是脱脂处理，细胞爬得牢吗？在免疫组化过程中不会掉下来吗？尤其是原位杂交要洗N多遍的。
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我们实验室：
1. 超声超洗1小时，自来水洗净，烘干。
2. 重镉酸甲洗液浸泡24小时（可以采用一个带盖广口器皿，用镊子一片片放进去），自来水洗10遍，双蒸水洗3遍，烘干。
3. 收集放置于培养皿中，高压消毒灭菌，烘干，即可使用。
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还是你们有耐心啊，我只是把盖玻片高压灭菌就用了。
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我的处理：
1.玻片处理：圆形或者方形，24孔板专用的细胞爬片。过碱过酸处理后，浸泡于95％乙醇中备用。使用前用丝绸布擦干净，高温高压消毒。
2.24孔板铺片后，每孔40ul多聚赖氨酸包被4小时，用双蒸水轻洗两次，凉干，备用。
3.将吹打均匀的细胞悬液滴入孔中，每孔0.5ml。细胞密度视自己的需要而定，但不能太稀疏。
4.细胞细胞贴壁充分后，吸去未贴壁的细胞悬液，加入培养液，每孔1ml。（也可24小时后，再换液）
5.另外，需准备好小镊子和注射器针头做的小钩子，取爬片细胞时用。
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好像高压一下就直接可以用了吧，上次有次甘时间，直接酒精灯上烧了一会就用来养细胞了。
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怎么可以买到 24孔板专用的细胞爬片，多谢!查看: 13309|回复: 4
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【材料及准备】7 U8 s4 Z" D1 @9 @1 Q# \* P+ q
1.一般的盖玻片，或专用爬片；
2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；
3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。' e) B6 R$ o8 q5 y, j: j" r
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。/ z& j, ]: B: i
6.常用的固定液
6.1丙酮 可用于一般的免疫组化染色。: Y1 X7 ?$ I8 i$ g
将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。
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6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等' b* R. m7 @; n2 Y! l
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存* Z8 w3 e+ G& ^, z
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6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。- a% y$ C$ {* u* c$ K1 B; f% m! ?
优点：穿透性强、抗原性保存较好。! h2 _. Y8 d# ~% r" B3 [9 R! \- B
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度5 Y; V1 O" ?4 j
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存3 e# {& b6 V, y0 B$ V
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6.4 甲醛(福尔马林)应用最广
优点：形态结构保存好，且穿透性强，9 W3 I0 u' |; h& o4 J4 O6 I0 |
缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。/ k$ v3 z# R7 U- S! f
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【细胞爬片步骤】
1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。. `' O' u+ E- w- `$ Y5 V! E
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。: P% G, D0 W, C
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
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【细胞爬片的固定】
细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。
另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。* d&&_&&H2 T- F+ r2 |% T4 c
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学习啦，谢谢！
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正好要做，学习了。不知道为什么要多聚赖氨酸处理，有人说说么，多大浓度，怎么处理
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嗯，学习啦，谢谢楼主！
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完全学习了
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