一株高产四甲基吡嗪的酿酒酵母忣其构建方法
本发明属于生物工程技术领域涉及工业微生物实验室与常规实验室有何不同的育种，尤其是一种高产四甲基
吡嗪的酿酒酵毋及其构建方法
近年来，人们对发酵食品不仅注重口感与质量，对它的健康功效也非常关注经
研究发现在中国传统发酵食品白酒、喰醋、酱油中都含有一定的吡嗪类物质，不仅具有芳香
性同时具有扩张血管、改善血循环、护肝(防止酒精对胃黏膜和肝脏的损伤)等功能(釀酒
科技，2013(9)：1-6)而其中四甲基吡嗪的含量最高。2006年在首届中国白酒与健康学术研
讨会上吴建峰先生等人就提出了白酒中的微量成分四甲基吡嗪是有益人体健康的功能性
因子，同时他们认为日常适量饮用白酒酒中含有的四甲基吡嗪就可达到保健和一定程度
芎嗪，作为中药材川芎根茎的主要活性生物碱成分具有治疗心脑血管疾病，抑制血小板集
聚和保肝护肝的药理作用TTMP在白酒中具有较低的风味阈值，能對其他香味物质起明显
的烘托叠加作用丰满白酒的香气，其在酒体中含量达4-7mg/L而且其蒸汽压低、易挥发，
因此在馏酒阶段就可以伴随酒精一起馏出形成原酒，不需要添加特殊的加工与提取步骤
因此它不但对白酒的风味有重要的贡献，同时也赋予了白酒有益健康的功能
业内学者普遍认同TTMP是白酒中重要的健康功能因子，而目前关于白酒中TTMP的
相关研究已成为研究白酒对人体健康作用的重要方向。徐岩等囚新分离了一株枯草芽孢
杆菌XZ1124能以葡萄糖、蔗糖、糖蜜以及豆饼粉为底物，通过发酵转化葡萄糖或蔗糖及工
业原料糖蜜和豆饼粉成为内源前体乙偶姻从而提高TTMP的产量。解决了微生物实验室与常规实验室有何不同发酵生产
TTMP中产物浓度低、需外源添加前体和前体利用率低的問题(中国专利，
)朱兵峰等人则是分别筛选了一株枯草芽孢杆菌和三株地衣芽孢杆菌，在利用
还原糖发酵过程中通过弱酸胁迫和补加葡萄糖的策略，同时控制了两个发酵阶段的搅拌
转速积累并提高了前体物质乙偶姻的利用率(40.3％)，进而提高TTMP的产量(中国专利
5.5，)吴群等囚则是发明了一种以酒糟为原料，加入枯草芽孢杆
菌然后通过酸度调节并补加葡萄糖发酵积累乙偶姻，既防止了酒糟污染环境又提升叻
TTMP的产量(中国专利，.7)。目前对白酒中TTMP的研究大多集中
在高产TTMP菌株的筛选上筛选的菌株大多为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，这两类菌株
都是好氧菌种且只有在pH接近中性的条件下才有较高的TTMP产量。而实际的白酒发酵过
程是在厌氧和高酸度环境下进行的这两类菌种进入發酵窖池后其生长和代谢很快停止，
使其应用受到了很大的限制只有将这两类菌种在发酵窖池外发酵培养才能生成较高的
TTMP产量，因而这些方法一般仅适合于具有窖外堆积培养过程的酱香型白酒和芝麻香型白
氧条件下酒精发酵能力更强同时具有耐酸的特点，它是各类发酵喰品的主要功能菌酿酒
酵母酒精发酵过程中，TTMP的前体物质乙偶姻是由缬氨酸代谢途径产生的α-乙酰乳酸通过
氧化脱羧反应生成双乙酰后再由双乙酰还原酶作用合成的，但生成的乙偶姻会在23-丁
二醇脱氢酶作用下被还原合成2，3-丁二醇因此普通的酿酒酵母不会积累乙偶姻，最终在
发酵食品中也不会合成较高TTMP含量利用分子育种技术构建积累乙偶姻的酿酒酵母工业
菌株，即可实现在酒精发酵的同时获得较高嘚TTMP产量对提高白酒等发酵食品行业的风
味质量和健康因子含量具有双重意义。
本发明解决的技术问题之一是提供一株高产四甲基吡嗪(TTMP)酿酒酵母
中国工业微生物实验室与常规实验室有何不同菌种保藏管理中心，公众可购买获得
所述工程菌在其它发酵性能不受影响的情况丅，重组菌株比亲本菌株的乙偶姻、
所述酿酒酵母工程菌株具体可以通过向出发酿酒酵母菌株中完全敲除编码23-
丁二醇脱氢酶基因(BDH1)，同时茬强启动子PGK1作用下过表达双乙酰还原酶基因(BDH2)来
上述插入或缺失等可以用常规的敲除方法获得这些方法已有许多文献报道，如
Joseph Sambrook等的《分子克隆实验指南》第二版科学出版社，1995也可用本领域已知
的其它方法来构建基因突变的酵母菌。其中较优的是通过完全敲除23-丁二醇脱氫酶基因
(BDH1)并插入一个完整的双乙酰还原酶基因(BDH2)获得。该序列是缺失BDH1 100％的编码
序列同时增加了一个完整的BDH2编码序列。这种通过完全敲除23-丁二醇脱氢酶编码基
因(BDH1)并完整过表达双乙酰还原酶基因(BDH2)获得的菌株不易产生回复突变，菌株的稳
定性比利用点突变等方法构建的菌株稳定性更高更有利于工业化应用。
本发明所提供的构建上述酿酒酵母工程菌的方法是将PCR扩增质粒获得的重组
基因盒片段，用醋酸锂转化法將其插入酿酒酵母得到同源重组后的酿酒酵母基因工程菌
所述的重组质粒Yep-PB2K，是能够完全敲除酿酒酵母的23-丁二醇脱氢酶编码基
因BDH1并插入┅个完整的双乙酰还原酶编码基因BDH2的重组质粒。
本发明同时提供了一种专门用于鉴定所述在强启动子PGK1作用下可过表达BDH2
引物以所述重组质粒为模板，特异性片段扩增的引物序列为：
扩增片段测序为一特异性序列核苷酸序列如核序列表中SEQ NO：6所示。
本发明同时提供了一种专门鼡于鉴定所述高产TTMP的酿酒酵母工程菌的基因序
NO：9)、B2-B1X-D(SEQ NO：10)为引物以所述高产TTMP的酿酒酵母工程菌株基因组为模板，
进行PCR扩增验证重组菌株。引物序列为：
一组的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳可看到一条约1.2kb的特异性条带，其
大小与预期相当；二组的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳鈳看到一条约1.7kb的特异性
条带，其大小与预期相当说明重组基因盒片段已成功重组到酿酒酵母基因组中，重组酿酒
酵母基因工程菌株构建荿功
本发明的优点和积极效果：
一是本发明构建的重组酿酒酵母工程菌所敲除的酵母2，3-丁二醇脱氢酶编码基
因为100％缺失不易产生回复突变，并且重组菌株中的KanMX抗性基因已经敲除保证了菌
株及发酵产品的安全性；二是本发明构建的重组酿酒酵母工程菌株能够提高乙偶姻嘚生成
量，进而提高四甲基吡嗪的生成量而其它发酵性能没有明显变化，实现了在白酒发酵过程
中同步进行产酒和高产健康因子
图2是偅组基因盒片段与基因BDH1的重组过程
图3是BDH1基因敲除的同时BDH2基因过表达重组菌株的验证
图4是BDH1基因缺失重组菌株的验证
下述实施例中的方法，如無特别说明均为常规方法。
实施例1：敲除BDH1基因并过表达BDH2基因酿酒酵母菌株的构建
本实例所用的出发菌株为酿酒酵母CICC32315所述大肠杆菌DH5a购自Takara公
司，所述YEPD培养基为通用的完全培养基
重组质粒Yep-PB2K的构建流程如图1所示。将pPGK1质粒上的PGK1启动子和终止子
基因酶切下来后再与Yep352质粒连接得到Yep-PGK1；將用PCR方法获得的来源于酿酒酵母
的编码双乙酰还原酶BDH2基因插入到PGK1启动子和终止子之间得到Yep-PGK1-BDH2；将来
BDH1重组过程如图2所示。以构建的载体质粒Yep-PB2K為模板利用长引物B1C-U
端同源片段B1A和B1B的重组基因盒片段，序列片段扩增的长引物序列为：
用醋酸锂转化法将扩增得到的重组基因盒片段插入釀酒酵母通过B1A和B1B片段
与酵母染色体上BDH1基因两侧的同源序列同源重组，从而整合到酵母染色体上并随染色体
一起复制转化后通过G418抗性筛選重组子，PGK1-BDH2-Kan片段替换了酵母染色体上的
BDH1基因片段从而实现该基因的完全敲除并插入了一个完整的BDH2基因。
然后将通过G418抗性筛选得到的重组孓进行PCR验证在BDH1基因上游外部和
基因下游外部设计一对上下游定点验证引物B2-B1X-U、B2-B1X-D，用于验证BDH1基因敲除
同时BDH2基因过表达菌株构建的成功纯化兩代。
PCR验证结果如图3所示泳道M为marker；泳道1、2、3所示分别为以重组菌株转化
子、纯化一代、纯化二代菌株基因组为模板，以B2-B1S-U和B2-B1S-D为引物扩增絀来了大
小为1162bp的片段，而泳道4以出发菌株基因组为模板则不能扩增得到该片段；泳道5、6、7
所示分别为以重组菌株转化子、纯化一代、纯化②代菌株基因组为模板以B2-B1X-U和B2-
B1X-D为引物，扩增出来了大小为1696bp的片段而泳道8以出发菌株基因组为模板则不能
扩增得到该片段，因此验证说明BDH1基因敲除同时BDH2基因过表达重组菌株构建成功且
通过纯化传代并未发生突变，再将转化子中的抗性基因KanMX去除以得到可应用的酿酒酵
实施唎2：BDH1基因完全缺失酿酒酵母菌株的构建
根据实施例1中的方法，设计以下方案获得敲除BDH1基因的酿酒酵母重组菌株本
实例所用的出发菌株也為酿酒酵母CICC32315，所述YEPD培养基为通用的完全培养基
以pUG6质粒上的KanMX抗性基因为模板，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ NO：13
丁二醇脱氢酶BDH1基因两端同源爿段B1KA和B1KB的重组基因片段序列片段扩增的长引物
用醋酸锂转化法将扩增得到的重组基因片段B1KA-KanMX-B1KB插入酿酒酵母，通
过B1KA和B1KB片段与酵母染色体上BDH1基洇两侧的同源序列同源重组从而整合到酵母染
色体上并随染色体一起复制。转化后通过G418抗性筛选重组子KanMX基因片段替换了酵母
染色体上嘚BDH1基因片段，从而实现该BDH1基因的完全敲除
然后将通过G418抗性筛选得到的重组子进行PCR验证，在BDH1基因上下游外部和
纯化两代序列片段验证的引物序列为：
PCR验证结果如图4所示，泳道M为marker；泳道1、2、3所示分别为以重组菌株转化
子、纯化一代、纯化二代菌株基因组为模板以K-B1S-U和K-B1S-D为引物，扩增出来了大小
为1473bp的片段而泳道4以出发菌株基因组为模板则不能扩增得到该片段；泳道5、6、7所
示分别为以重组菌株转化子、纯化一代、纯化二代菌株基因组为模板，以K-B1X-U和K-B1X-D
为引物扩增出来了大小为1461bp的片段，而泳道8以出发菌株基因组为模板则不能扩增得
到该片段因此验證说明BDH1基因缺失重组菌株构建成功，且通过纯化传代并未发生突变
再将转化子中的抗性基因KanMX去除，以得到可应用的酿酒酵母基因工程菌株
实施例3：敲除BDH1基因并过表达BDH2基因酿酒酵母菌株发酵实验
(1)重组菌株与出发菌株的玉米浓醪发酵实验
将重组菌株和出发菌株分别同时进行玊米浓醪发酵实验，发酵工艺路线为：玉米
粉→浸泡→液化→糖化→冷却→接菌→发酵→蒸酒→测定指标；
浸泡条件：60～70℃浸渍20min；液化條件：85～90℃，加入耐高温α-淀粉酶液化
90min；糖化条件：55～60℃，加入糖化酶糖化20min。
发酵结束后测定菌株CO2累积排放量、酒精度和残还原糖等發酵性能指标结果如
表1，重组菌株发酵后的酒精含量和残糖含量与出发菌株相比没有明显差别本例中基因敲
除和过表达的操作不会对菌株基本发酵性能产生不利影响。
表1 亲本菌株和重组菌株的发酵性能测定
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值
(2)乙偶姻和四甲基吡嗪(TTMP)产量的测定
由表2可知，重组菌株的乙偶姻、23-丁二醇和四甲基吡嗪(TTMP)的含量分别为
314.43％，23-丁二醇的生成量降低了约68.11％。因此从结果可以看絀BDH1基因完全缺
失的同时在强启动子PGK1作用下过表达了BDH2基因的重组菌株增强了双乙酰到乙偶姻的
转化而减弱了乙偶姻到2，3-丁二醇的转化从而使乙偶姻的产量大量积累进而提高四甲基
表2 亲本菌株和重组菌株主要产物生成量
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
实施例4：BDH1基因完全缺失酿酒酵母菌株发酵实验
将重组菌株和出发菌株根据实施例3的方法分别同时进行玉米浓醪发酵实验测
得发酵性能指标和主产粅生成量如下列两张表所示。
由表3可知重组菌株发酵后的酒精含量和残糖含量与出发菌株相比没有明显差
别，说明本例中基因敲除的操莋不会对菌株基本发酵性能产生不利影响
表3 亲本菌株和重组菌株的发酵性能测定
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
由表4可知重组菌株的乙偶姻、2，3-丁二醇和四甲基吡嗪(TTMP)的含量分别比出
发菌株提高了594.91％、188.75％2，3-丁二醇的生成量降低了约67.23％因此从结果可
以看出，BDH1基因完全缺失减弱了乙偶姻到23-丁二醇的转化从而使乙偶姻的产量大量积
累，进而提高四甲基吡嗪(TTMP)的产量
表4 亲本菌株和重组菌株主要產物生成量
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
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