【生物虚拟实验室】我市“细菌分子生物学实验室”启用_尚书坊
【生物虚拟实验室】我市“细菌分子生物学实验室”启用
记者9月1日从市疾控中心获悉,我市新建的细菌分子生物学实验室正式投入运行,并已对11份疑似致泻大肠埃希氏菌阳性菌株进行了分子生物学鉴定。据介绍,该实验室从2014年开始进入改造阶段,当年年底便基本建成,当时该细菌分子生物学实验室具体包括核酸提取区、体系配制区、PCR区及产物分析区四个功能区。2015年,市疾控中心进行仪器设备的招标采购,为实验室购入了荧光定量PCR仪、普通PCR仪及凝胶成像系统。今年7月初,新购进的先进设备完成安装及调试。今年8月中旬,细菌分子生物学实验室对11份疑似致泻大肠埃希氏菌阳性菌株进行分子生物学鉴定。据介绍,当时实验室分别进行了肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、肠道出血性大肠埃希氏菌(EHEC)、产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)、肠道侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)及肠道粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)的荧光定量PCR检测,检测结果均为阴性,实验阴阳性对照均成立。随着这次实验的成功,预示着我市细菌分子生物学实验室正式启用。(首席记者 贾荣)&
虚拟实验是基于计算机仿真技术构建的虚拟实验系统。以计算机仿真技术为 核心的生物仿真引擎、处理因素数据库、虚拟环境界面和虚拟操作等模块组成, 学生可以进行虚拟操作试验。 如何让学生在生物化学与分子生物学实验中摆脱以往的抽象枯燥且具有一定危险性的实验环境。
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2004年生命科学院获得国家985工程立项支持,投资3000万元开始建设985工程省部级创新平台mdashmdash空间生物技术实验室。经三年的建设,该实验室于2007年获得首批国防科工委重点学科实验室之一。
近日, 中山大学新华学院 为期两天的泰盟杯生物医学(实验生理科学)虚拟仿真实验大赛圆满结束。大赛共吸引了来自护理、药学、生物医学工程、康复治疗学、听力与言语科学、信息资源管理专业的264名同学参加,经激烈角逐。
齐鲁网5月12日讯(记者 张铭伟 刘洋 于萌)今天,山东省科学院分别同澳大利亚弗林德斯大学、南澳大学签署协议,共建中澳技术创新联合实验室。 此次签约共建的三个联合实验室分别是中澳特色生物资源产业技术创新联合实验室、先进激光和光纤传感器联合实验室和医疗设备与数字健康联合实验室。艾德科技---MEF1 synthRE-LightSwitch(TM) Synthetic Response Elements::MEF1 synthRE (E-32152)::::RNA甲基化定量︱RNA甲基化定性︱DNA甲基化定量︱DNA甲基化定性︱表观遗传学︱分子生物学︱免疫生物学︱生物信息学︱细胞生物学︱蛋白质组学︱实验仪器学︱实验试剂学︱实验耗材学︱艾德科技（北京）有限公司
精彩产品&免疫生物学...E...
MEF1 synthRE (E-32152)
MEF1 synthRE
货号：E-32152
LightSwitch(TM) Synthetic Response Elements
LightSwitch(TM) Synthetic Response Element reporter constructs simplify the task of determining the effect that test compounds and/or conditions have on over 90 different transcription factors. Each synthRE vector contains an optimized synthetic response element, made up of repeats of a transcription factor binding site motif, cloned upstream of a minimal promoter and the RenSP luciferase gene in the Long-range Enhancer Reporter Vector, pLightSwitch_LR vector. As Synthetic Response Element vectors are supplied transfection-ready, you can begin your experiments immediately.
Similarly, for researchers studying post-transcriptional regulation events mediated by miRNA-3?UTR interactions, we offer a large collection of optimized, synthetic.
IMPORTANT:
Because all LightSwitch reporter constructs contain the optimized RenSP luciferase gene, you MUST use our
to obtain optimal results. (Other luciferase assay reagents are not compatible with RenSP.)
This product is for research use only and is not for use in diagnostic procedures.
Applications of Synthetic Response Elements:
Use as a primary screen to identify compounds or conditions that affect the activity of a biological pathway. Follow up using related endogenous promoter reporter constructs to detect subtle differences between compounds or conditions.
Generate dose response curves to various compounds or conditions.
Use as a positive control in your pathway-specific, cell-based assays.
Lyophilized proteins can be stored at -20°C or -80°C, preferably desiccated. Recombinant proteins in solution are temperature sensitive and must be stored at -80°C to prevent degradation. Avoid repeated freeze/thaw cycles and keep on ice when not in storage.
定购信息：
MEF1 synthRE
Chromeo(TM) 546山羊抗兔IgG，样品
山竹醇-山竹子素
炔丙基脲（HPA）
染色的干细胞CDy1
MODified(TM)蛋白质结构域结合试剂盒
MODified(TM)组蛋白多肽分析试剂盒
MODified(TM)组蛋白多肽分析试剂盒
重组 DNMT1 蛋白, active
6-Methyladenosine (6-meA) 抗体 (pAb)
6-Methyladenosine (6-meA) 抗体 (pAb)
DNMT3A dimethyl Lys44 抗体 (pAb)
DNMT3A dimethyl Lys44 抗体 (pAb)
DNMT3A 抗体 (mAb)
DNMT3A 抗体 (mAb)
E-A-9000-50
E-A-9000-10
CRISPR/Cas9 多克隆抗体
CRISPR/Cas9 多克隆抗体
CRISPR/Cas9 多克隆抗体
APC标记大鼠抗小鼠CD90.2/Thy-1.2抗体
PE标记仓鼠抗小鼠CD69/VEA抗体
E-1715-09L
低内毒素/无叠氮钠仓鼠抗小鼠CD3e抗体
抗小鼠TREM-2单克隆抗体(克隆号6E9)
96孔DNA甲基化极速修饰试剂盒（磁珠法）
m6A RNA甲基化定量检测试剂盒(比色法)
A-P-9005-96
RNA甲基化修饰试剂盒
EZ RNA甲基化修饰试剂盒
表观遗传学产品全面解决方案列下：
DNA羟甲基化定量试剂盒(比色法)
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DNA羟甲基化定量试剂盒(比色法)
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DNA羟甲基化定量试剂盒(荧光法)
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DNA羟甲基化定量试剂盒(荧光法)
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DNA甲基化定量试剂盒(荧光法)
A-P-1035-48
DNA甲基化定量试剂盒(荧光法)
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DNA甲基化定量试剂盒(比色法)
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DNA甲基化定量试剂盒(比色法)
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总体DNA甲基化极易定量试剂盒(比色法)
A-P-1030-48
总体DNA甲基化极易定量试剂盒(比色法)
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总体DNA羟甲基化极易定量试剂盒(比色法)
A-P-1032-48
总体DNA羟甲基化极易定量试剂盒(比色法)
A-P-1032-96
总DNA甲基化定量试剂盒
A-P-1014B-48
总DNA甲基化定量试剂盒
A-P-1014B-96
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5-hmC是近年来在动物组织中发现的，由胞嘧啶修饰而来。5-hmC在表观遗传学上的功能可能与5-甲基化胞嘧啶(5-mC)不同。尽管到现在为止还不确知其功能，有研究者猜测它在调控基因的表达与关闭过程中起着重要的作用。5-mC的发现让我们不得不重新评估DNA甲基信息，也不得不监测人类的健康组织和病理组织之间5-mC相对分布的差异。在EPI公司的MethylFlash技术之前，我们还没有发现任何直接的常规方法来检测5- hmC,以及区分5-hmC和5-mC
5-hmC 和 5-mC的区别
时下常用的DNA甲基化分析方法包括限制内切酶酶切和亚硫酸氢盐或MeDIP介导的MS-PCR和测序，这些技术都不适合用来检测5-hmC，因为它与5-mC事实上很难用这类方法区分开来。为了解决这个问题，EPIk研制了MethylFlash羟甲基化DNA定量试剂盒(荧光法)。本试剂盒提供了一种很经济的方法来检测5-羟甲基化胞嘧啶，并且区分5-hmC, 5-mC, 和 C，使得研究者能够重新评估他们的DNA甲基化信息，也能够在新样品中寻找DNA羟甲基化。
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Powered by Discuz![转载]分子生物学实验中常见的问题与对策-4
5 DNA的连接反应
5.1 TA克隆连接失败或效率低
可能原因：
（1）连接缓冲液活性低，ATP降解或缓冲液稀释不当
对策：使用一次性分装的缓冲液，避免反复冻融。提供的T4连接酶缓冲液为十倍浓度，正确稀释。
（2）连接酶失活& 对策：更换连接酶
（3）PCR产物中含有抑制连接的成分，导致连接失败
对策：将PCR产物和连接反应对照混合，观察是否存在抑制效应。如怀疑有抑制成分存在，应重新纯化PCR产物。
（4）PCR产物没有3’A突出端，不能连接
&&对策：使用能产生3’A突出端的DNA聚合酶或平端PCR产物先通过聚合酶及dATP进行加尾反应产生3’A突出端，再与T载体连接。
（5）载体T突出端丢失，引起载体平端连接
对策：避免核酸外切酶的引入，降解T突出端。只使用无外源核酸酶的T4连接酶。
（6）插入片段与载体比例不理想& 对策：优化比例
5.2 粘端连接注意事项
（1）连接反应的温度：ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃，但在此温度下，
粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。
（2）DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。
二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。
（3）碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题，
为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。
（4）连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。
（5）如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。
5.3 平端连接注意事项
（1）插入片断和载体片断的比例要高。
（2）连接酶要加的多点，最好用高浓度的酶。
（3）载体片断要做去磷酸化处理。
（4）可以用15％的PEG8000来增加连接效率和减少载体自联。
（5）反应体系10UL，不要太大。
（6）去磷酸化的步骤要根据自己酶的性质而定，一般要反应一个小时，在反应半小时后再补充酶再反应半小时。
（7）插入片断和载体片断要酶切良好。
（8）低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。
5.4 用T4 DNA连接酶连接后转化失败
可能原因：
（1）反应体系内无ATP或Mg2+
&&对策：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。
（2）反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高& 对策：纯化DNA
（3）去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底
&&对策：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。
（4）DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA&
对策：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。
（5）连接末端为单碱基突出末端
&&对策：使用最高至5μl高浓度连接酶16°C过夜连接。
（6）插入片段和质粒没有磷酸化。注重：假如载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。
（7）加入过多的连接混合物至感受态细胞&
对策：50μl感受态细胞应加入1-5μl连接混合物。
（8）插入片段太大，不能进行环化
对策：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。
（9）连接酶失活& 对策：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。
5.5 内切酶酶切反应后，有什么因素可以导致T4
DNA连接酶连接和后续的转化失败
可能原因：
（1）内切酶酶切不充分
&&对策：假如酶切位点位于PCR产物的末端，识别位点末端侧需要加至少6个保护碱基。用对照底物检测内切酶的活性。
（2）内切酶没有完全失活
&&对策：假如内切酶不能热失活，用酚/氯仿抽提纯化DNA。
（3）内切酶的星号活性消化了载体或插入片段
&&对策：跑胶检测DNA，假如存在多余的条带，减少内切酶使用量或减短反应时间。
（4）DNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破坏了DNA末端
&&对策：酚/氯仿抽提纯化DNA。检查内切酶的质量检测资料和注重事项，假如连接QC不佳或外切酶活性高，减少内切酶量或縮短反应时间。
5.6 在应用快速连接试剂盒时，什么原因可以造成不完全连接或转化？
可能原因：
（1）快速连接反应被热失活了，快速连接缓冲液中含有PEG，热失活后会抑制转化。
（2）快速连接混合液在电击之前没有纯化，快速连接缓冲液中含有的PEG会阻止电击反应。&
对策：应用商业化的DNA纯化柱纯化连接产物。
（3）过夜孵育进行连接反应。连接时间过长，快速连接缓冲液中存在的PEG就会降低转化效率。连接反应时间超过30min，也不会获得更好的效果。
（4）反应体系中盐浓度过高，抑制了连接或转化反应& 对策：纯化DNA。
（5）脱磷之后，所用的磷酸酶（CIP，BAP或SAP）没有完全失活或去除
&&对策：可以按照推荐的操作来进行以去除磷酸酶或者选用热敏磷酸酶（NEB#M0289）。因为热敏磷酸酶在65℃
5min即可完全失活而无需纯化DNA。
6 细菌的培养
6.1用氨苄抗性的选择培养基筛选转化细胞时，平板上没有克隆，有一层白色的浆状物，不均匀，像一层菌膜。
可能原因：氨苄无效或浓度过低，操作中引入杂菌；质粒没有转进去。
对策：重新转化质粒，更换氨苄。
6.2 工程菌的不稳定性及其对策
工程菌稳定与否，与重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等因素有关。
就质粒本身的分子结构而言，引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响。另外可能由于重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等都会造成质粒的不稳定。
就宿主而言，除了上述质粒中有同源序列外，还与宿主的比生长速率、宿主中重组基因（rec系统）的完整性、重组时有关基因的具体变异等都有关系。
在培养环境中高温、去垢剂（如SDS等）、某些药物（如利福平）、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失，因而常采取下列措施以防止或降低工程菌的不稳定性。
（1）组建合适载体&
在质粒构建时，插入一段特殊的DNA片段或基因以使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。
（2）选择适当宿主&
重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响，在选择宿主时，必须确定其遗传特点。相对而言重组质粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。
（3）施加选择压力&
从遗传学来说，选择即利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能生长。在重组DNA技术中，有好几方面利用选择压力，如转化后用选择压力确定含有重组质粒的克隆株，而在利用克隆菌进行发酵生产时，经常采取施加选择压力的方法消除重组质粒的不稳定，以提高菌体纯度和发酵生产率。①抗生素添加法②抗生素依赖变异法③营养缺陷法。
（4）控制基因过量表达&
提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但许多研究发现，外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定，因此可采取分段培养法，即前期控制基因过量表达，使重组质粒稳定遗传，到后期通过提高质粒的拷贝、转录、翻译效率使外源基因高效表达。①利用阻遏—去阻遏启动子原理控制基因过量表达，②选择温度敏感型质粒控制基因过量表达。
（5）控制培养条件&
重组菌所处的培养环境条件对其质粒的稳定性和表达效率等均具有很大的影响，当重组菌构建成功后，能否进入工业化生产阶段，其关键的步骤就是筛选最适的培养条件，包括培养基配方、培养温度、pH值范围，溶氧水平（好氧菌），添加选择压力和控制基因表达，实质也是通过培养条件的控制实现的。影响培养条件的因素很多，能影响菌体生长的所有培养工艺、工程参数都会影响质粒的稳定性，在这些工艺工程参数中，培养基成分、培养温度、菌体的比生长速率三个方面最为重要。
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