定量ＰＣＲ技术研究进展
刘芳萍，曲鹏
（东北农业大学动物医学院药理教研室，哈尔滨１５００３０）
定量ＰＣＲ是在ＰＣＲ定性技术基础上发展起来的核酸定（Ｐｏｌｙ－量技术。自１９８５年Ｓａｉｋｉ等首次描述聚合酶链反应
述扩增效率差异，对样品间ＰＣＲ产量作比较会产生很不准确的结果。而且，对ＰＣＲ产物的定量必须在指数扩增期进行，因为在平台期扩增产物的累积量并不受初始模板量的影响。必须对单一反应的多个不同时间点的产物量作直线回归分析才能获得可靠的统计学结果。由于此法简单，故被许多学者用作粗糙的定量分析。
ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术以来，因其展现了前所未有
的敏感性和特异性，受到了人们的高度重视。如今各种各样以ＰＣＲ为基础的ＤＮＡ序列的扩增和控制方法得到了迅猛但在许多情况下，发展，几乎已应用于基础研究的各个领域。
研究者们已不再满足于得知某一特异ＤＮＡ序列的存在与因而，借助ＰＣＲ否，他们更着眼于对其进行精确的核酸定量。
对基因快速、敏感、特异而准确的定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。
（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ）的原理１定量ＰＣＲ
２．２有限稀释法
有限稀释法起初是用于细胞生物学的定量方法。对检测样本进行梯度稀释后做ＰＣＲ，直至检测结果为阴性为止。这样即可以依据ＰＣＲ检测阳性结果的最大稀释度结合外参照进行定量。扩增产物的检测多采用凝胶电泳。为了增加这种定量方法的可重复性，应使ＰＣＲ过程最佳化，一个或几个靶分子能被稳定检测出。在每个稀释度均应进行多次反应，结果利用统计学泊松分布原理来计算。必须严格消除污染物，以免假阳性干扰正常结果。这种方法的优点是定量不依赖扩增效率，但需要对每份样品的各个稀释点做多次ＰＣＲ反应，工作繁琐，系统误差大，现在已经很少有人使用。
１９８９年，Ｗａｎｇ等首先报道了定量技术用于ｍＲＮＡ的定
量检测。因为ＰＣＲ反应每个循环的产物均为下一个循环的底物，并按指数级扩增，所以可以用方程Ｓ＝Ｓ０（１＋Ｅ）ｎ来推算扩增产物，Ｓ０是初始模板核苷酸量，Ｅ是扩增效率，ｎ是循环次数。但是Ｅ只能在有限的循环周期中保持相对恒定，通常是
２０￣３０个循环，随后扩增效应减慢直至０，扩增过程到达平台
期，此时，ＰＣＲ产物的积累不再依赖于初始模板核苷酸量。
２．３外对照ＰＣＲ定量
外对照法是最简单的ＰＣＲ定量方法。外对照通常是质粒，一个已知量的标准稀释系列，与待测样品中的靶序列用相同的引物在两管中分别扩增，由这个标准稀释系列ＰＣＲ产物／起始物量获得标准曲线，即可推测出在同一ＰＣＲ扩增循环中的样品靶序列的起始量。但这个定量过程必须在指数扩增期进行。这种方法甚至可以消除管与管之间的差异，但不能消除样本与样本之间的差异。
外对照ＰＣＲ定量可与巢式ＰＣＲ联合使用。虽然在巢式
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等在研究ＰＣＲ扩增平台期时发现，由于目的基因及
引物初始浓度的差异，ＰＣＲ的平台期可在１５￣２５个循环时出现。因而，达到平台期的ＰＣＲ循环次数是不能预测的，必须用实验来确定平台期出现的循环数。在ＰＣＲ扩增的指数增长过程终止前的循环数的多少取决于扩增效率Ｅ和起始样本的特异核苷酸序列丰度。对于一个给定的扩增片段，起始样本的含量越大，则指数扩增过程越短。Ｅ取决于诸多因素，如引物和扩增序列的特性、组分的浓度及反应温度等。即使同时使用同样的试剂及操作、同等反应条件，ＰＣＲ法管与管间的扩增效率也可能有明显差别，这是因为影响产物量的任何一个因素的微小变化都会显著地改变产物的量。这些因素包括所用仪器，反应条件（如多聚酶、温度、底物浓度、循环次数、抑Ｍｇ２＋浓度、制物的存在、标本处理及模板降解等）。
ＰＣＲ反应中，内外两对引物也将产生一些不同种类的非特异
性产物，但其量常不能达到干扰定量的水平。一些相对简单的非特异性检测方法可用于对巢式ＰＣＲ产物进行定量。
使用外对照ＰＣＲ定量时，ＰＣＲ对试验过程中微小差异的敏感性将会对扩增效率产生影响，有可能破坏实验的准确性和可重复性。因此，建立外对照定量ＰＣＲ，必须分析这个试验的准确性和可重复性的限制程度。
２定量ＰＣＲ技术的方法２．１ＰＣＲ产物的直接定量
因为不同样品的ＰＣＲ产量是可以测定的，由此可推算出每份样品在ＰＣＲ扩增开始时的靶ＤＮＡ的相对量。与设定的外源性标准作对照，如先对未知量的靶ＤＮＡ作系列稀释，两者比较，即可对未知量的靶ＤＮＡ绝对定量。但是，由于上
２．４内对照ＰＣＲ定量
内对照ＰＣＲ，即在同样的反应条件下，在同一个ＰＣＲ管中扩增来自同一ＤＮＡ的一段靶序列和一段内对照序列。通过比较两种序列的扩增产量可对靶基因定量。只有当靶序列与内对照序列的起始量和扩增效率非常相似时，才能精确的对靶序列定量，这取决于选择不同引物最佳配比的经验。这种扩增效率的差异常发生在ＰＣＲ的终末期，故应在指数扩
作者简介：刘芳萍（１９７３～），女，汉族，博士，主要从事兽医药理学与毒理学研究。
畜牧兽医科技信息２００６．０９
增期对产物进行分析。由此可见，循环次数和初始模板ＤＮＡ的量对结果的影响很大。内对照ＰＣＲ可以消除管与管之间的变异，并在一定程度上消除样本与样本之间的变异。Ｙｏｌｏｖ等为了增加准确性，利用双重内对照定量ＰＣＲ，同时扩增
构建一个适用于ＤＮＡ和ＲＮＡ竞争性模板的方法。另外，还可以构建一种含有特异引物识别序列适用于多重的非同源性的竞争性模板。这种类型的模板可以用于ＤＮＡ或ＲＮＡ的测定，而且能显著提高定量的精确性。在多重竞争性模板中包含一个或多个参照基因（ＧＡＰＤＨ，β－ａｃｔｉｎ，β－ｇｌｏｂｉｎ等），因为这些参照基因在生理或病理条件下转录水平不发生任何变化，可用于估计最终结果的相对数值。
ＨＩＶ病毒基因和宿主细胞特征基因ＨＡＬ－Ｄｑａ，二者比率作
为ＤＮＡ水平感染程度指标，用于监测病毒复制和药物疗效评价。
实验中所加入ＤＮＡ的量对于一个成功的定量分析是非常关键的，因为太多的模板ＤＮＡ会产生非特异性扩增产物。另一个重要因素是要保证靶序列和内对照序列以相同的量存在，才能对二者相对定量。内对照ＰＣＲ定量适用于检测单基因缺失，如检测肌萎缩蛋白基因或Ｐ１６基因以鉴别等位基因的缺失，以及发生染色体的大片段异常，如三体性或非整倍性。
２．６荧光定量ＰＣＲ
荧光定量ＰＣＲ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅｃｔｉｏｎ，ＦＱ－ＰＣＲ）是美国ＰＥ公司１９９６年研制出来的一种新
的核酸定量技术，该技术是在常规ＰＣＲ基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，通过供、受体发色团之间偶极
－偶极相互作用，能量从供体发色团转移到受体发色团，受
体荧光染料发射出的荧光讯号强度与ＤＮＡ产量成正比，检测ＰＣＲ过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度。
荧光定量ＰＣＲ的原理是利用Ｔａｑ酶的５′→３′外切酶活性，在ＰＣＲ反应体系中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的ＤＮＡ模板发生特异性杂交，探针的（６－羧基荧光素，荧光发射峰５′端标以荧光报告基团ＦＡＭ
值在５１８ｎｍ处），靠近３′端以荧光淬灭基团ＴＡＭＲＡ（６－羧基四甲基若丹明，荧光发射峰值在５８２ｎｍ处），二者之间构成能量传递，探针的３′末端被磷酸化以防止探针在ＰＣＲ扩增过程中被延伸。当探针的结构保持完整时，５′－ＦＡＭ所发出的荧光被３′－ＴＡＭＲＡ所吸收或抑制，不出现荧光信号的变化。随着ＰＣＲ反应的进行，由于Ｔａｑ酶具有５′→３′外切酶活性，当合成的新链移动到探针结合位置时，Ｔａｑ酶将探针切断，探针的完整性遭到破坏，能量传递结构亦被破坏，３′
２．５竞争性ＰＣＲ定量
从定量ＰＣＲ反应动力学分析中可以看出，最符合ＰＣＲ数学模型、最精确、最易于操控、最有前途的定量ＰＣＲ技术就是竞争性ＰＣＲ，它是Ｇｉｌｌａｎｄ等人于１９９０年首先发明的，可用于ＤＮＡ和ＲＮＡ的定量。竞争性ＰＣＲ是向样本中加入一个作为内标的竞争性模板，它与目的基因具有相同的引物结合位点，在扩增中二者的扩增效率基本相同，而且扩增片段在扩增后易于分离，然后根据内标的动力学曲线求得目的基因的原始拷贝数。
（ＤＮＡ或ＲＮＡ），这种模板它首先需要构建一种竞争模板
与靶基因（ｃＤＮＡ或ｍＲＮＡ）略有不同，或是多一个小片段，或是少一个小片段，或是小部分或大部分序列的改变。这种模板定量稀释后与样本在同一管中用相同的引物同时进行ＰＣＲ或ＲＴ－ＰＣＲ扩增，二者竞争引物、核苷酸和聚合酶。由于竞争作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板扩增产量逐渐减少，两种模板ＰＣＲ产物的比值与二者初始状态时核酸含量的比值有关，当两种模板的拷贝数相等时，它们的扩增产物也基本相当，这时初始反应体系中内标模板的量也就代表了被检测模板的量。如果这个竞争性模板选择并构建恰当，在整个反应过程中扩增效率与靶序列扩增效率一致，就不一定要把反应限制在指数扩增期，靶序列可以在较大范围内获得定量并能检测到其２倍的差别。因此，竞争性ＰＣＲ被广泛用于细胞细菌核酸的定量检测。尽管如此，这种方ＤＮＡ、ＲＮＡ以及病毒、法仍存在诸多不足，如竞争性模板制备较难，需要经过反复测试；实践中其与靶基因模板的扩增效率很难达到完全相同；定量原理从根本上说仍是采用基于标准曲线的类推法，单个标准品的点变异对定量结果影响较大等。
竞争性模板常通过修改靶序列的克隆来构建。如一个小的限制性片段的插入、缺失或通过体外诱变导入一个新颖的酶切位点。另外，包含同一引物结合位点的异组织竞争物也可使用。如果以目的基因为基础，通过诱导产生一小段缺失或插入作为竞争性模板，长度范围为１０％￣１５％差异，就不会明显影响扩增效率，这种模板可通过重叠延伸技术快速有效
－ＴＡＭＲＡ的淬灭作用被解除，５′－ＦＡＭ的荧光报告基团的
荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，同时一个荧光报告基团被释放出来。产物与荧光信号产生一对一的对应关系，随着产物的增加，荧光信号亦随之增强。在
ＰＣＲ反应过程中连续不断地检测反应体系中荧光信号的变
化，当信号增强到某一阈值，此时的循环次数即循环阈值Ｃ１被记录下来。Ｃ１和ＰＣＲ体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系，利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的
Ｃ１值和该阳性定量标准模板数经过对数拟和作图，制成标
准曲线，根据待测样品的Ｃ１值就可以准确的确定起始模板的数量。
目前国内外常用的荧光定量ＰＣＲ技术有Ｔａｑｍａｎ技术、复Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ技术、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ技术、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ技术、合探针法和ＳＹＢＲ荧光染料法。
荧光定量ＰＣＲ与常规ＰＣＲ相比，具有许多优点。⑴荧光探针的使用，可以通过光电传导系统直接探测ＰＣＲ扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有ＤＮＡ杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，进一步提高目的基因检测的特异性。⑵光谱技术与计算机技术的联合应用提高了灵敏度，有效地减少了劳动量。ＴａｑｍａｎＰＣＲ使用氩激光来激
畜牧兽医科技信息２００６．０９
发荧光的产生，利用荧光探测仪检测荧光信号的大小，通过计算机的分析软件进行分析，大大提高了灵敏度，可以检测到单拷贝的基因，这是常规ＰＣＲ难以做到的。⑶有效的避免了污染。常规的ＰＣＲ在扩增结束后需要琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光下观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，除了有污染外，还对人体产生一定的伤害，而荧光定量ＰＣＲ是在全封闭状态下实现扩增及产物分析，有效的减少了污染及对人体的伤害。⑷能精确定量。由于ＰＣＲ的平台效应，常规的ＰＣＲ不能进行精确的定量，而荧光定量
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｓｓａｙ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９２，２０（２１）：５８６３－５８６４．
［３］ＣｌｉｆｆｏｒｄＳＣ，ＴｈｏｍａｓＤＪ，ＮｅａｌＤＥ，ｅｔａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄｍｄｒ１ｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓｉｎｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅｃａｒｃｉｎｏｍａｏｆｔｈｅｂｌａｄｄｅｒｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ－ｂａｓｅｄａｓｓａｙ．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ，１９９４，６９（４）：６８０－６８６．［４］ＫａｎｅｋｏＳ，ＭｕｒａｋａｍｉＳ，ＵｎｏｕｒａＭ，ｅｔａｌ．ＤｏｍｉｎａｎｔｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｉｔｈｅｒｖｉｒｕｓｉｎｄｕａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓｅｓＢａｎｄＣ．ＪＭｅｄＶｉｒｏｌ，１９９２，３７（４）：２７８－２８２．
［５］ＣｒｏｓｓＮＣ．ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＢｒＪＨａｅｍａｔｏｌ，１９９５，８９（４）：６９３－６９７．
［６］ＹｏｌｏｖＡＡ，ＫｏｚｌｏｖａＡＶ，ＹａｒｏｓｌａｖｔｓｅｖａＮＧ，ｅｔａｌ．ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｓａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｎｔｈｅｇｅｎｅｌｅｖｅｌ．ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ，１９９５，１０（１）：４５－５１．
［７］ＧｉｌｌｉｌａｎｄＧ，ＰｅｒｒｉｎＳ，ＢｕｎｎＨＦ，ｅｔａｌ．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｍＲＮＡａｎｄＤＮＡ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔｉｏｎｂｙｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９０，８７：２７２５．
［８］ＣｌｅｍｅｎｔｉＭ，ＭｅｎｚｏＳ，ＢａｇｎａｒｅｌｌｉＰ，ｅｔａｌ．ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄＲＴ－ＰＣＲｉｎｖｉｒｏｌｏｇｙ．ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３，２（３）：１９１－１９６．
［９］ＳｉｅｂｅｒｔＰＤ，ＬａｒｒｉｃｋＪＷ．ＰＣＲＭＩＭＩＣＳ：ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｆｏｒｕｓｅａｓｉｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｓｉｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１９９３，１４（２）：２４４－２４９．
ＰＣＲ由于利用扩增进入指数增长期的Ｃ１值来定量起始模板
的量，实现了极为精确的核酸定量检测。荧光定量ＰＣＲ技术是目前发展起来的快速、精确定量核酸的最有效的方法之一，但因检测设备昂贵，使用受到一定的限制。
此外，克丙申等报道可以建立ＰＣＲ动力学数学模型，模型中包含了起始模板量与产物数量积累的关系，所以可使用动力学模型根据反应条件由积累的产物与相关的参数计算出起始模板数量，达到定量ＰＣＲ的目的。
［１］ＭｏｒｒｉｓｏｎＣ，ＧａｎｎｏｎＦ．ＴｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｔｈｅＰＣＲｐｌａｔｅａｕｐｈａｓｅｏｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９９４，１２１９（２）：４９３－４９８．［２］ＷｉｅｓｎｅｒＲＪ．ＤｉｒｅｃｔｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｉｃｏｍｏｌａｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｍＲＮＡｓｂｙｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
牲畜耳标是法定的免疫标志
红纯，游旭
（江苏滨海县玉龙路畜牧站，２２４５００）
２００５年５月，某区刘某饲养的９头生猪未进行重
品的单位和个人，应当依照本法和国家有关规定做好动物疫病的计划免疫、预防工作，并接受动物防疫监督机构的监测、监督。实行强制免疫后的猪、牛、羊、犬等动物，要按照国家有关规定实行动物免疫标识制度。因此，从法律上讲，养殖单位和养殖个人有责任、有义务对饲养的动物进行免疫和免疫后佩戴耳标，而拒绝佩戴耳标则是一种违法行为。
大动物疫病免疫接种，未佩带免疫耳标，在出售途中被动物防疫监督执法人员查获，畜主拒不接受处理。区兽医卫生执法机构将９头生猪强制扣押，免疫和隔离饲养１５ｄ，并对刘某处以
１９００元罚款的行政处罚。２评析意见
该案的焦点在于农民养猪是否需要进行重大
动物疫病免疫，是否需要在免疫后佩带耳标，如不免疫和佩戴耳标，应承担什么样的法律责任？现从三个方面对本案进行剖析。
牛、羊等牲畜实施免疫并佩戴耳标是防控人畜共患２．１对猪、
疫病的需要。目前已知人畜共患疫病有１６０多种，传染途径多种多样，对人、畜的危害极大。为了预防和控制重大动物疫病在人畜间的发生和传播，政府强化了防控措施，把对人畜危害巨大的几种疫病列为重大疫病，实施强制免疫并佩戴耳标的管理制度。
牛、羊等动物必须主动接受免２．３法律法规明确规定养殖猪、
疫。国家《动物防疫法》对动物疫病的预防、控制作出了明确规定。《动物防疫法》第五条规定：国家对动物疫病实行预防为主的方针；第十四条又规定：饲养、经营动物和生产、经营动物产
２．３耳标是国家法定的动物免疫标识。２００２年，农业部以１３
号部长令形式，规定全国从２００２年１０月１日起全面实施动物免疫标识，并制定了《动物免疫标识管理办法》。免疫耳标一标一号，根据耳标的号码可以在经营运输环节追查到饲养地、防疫人员、检疫人员等情况，从而追查疫源，扑灭疫情，追究相关人员责任。对依法应当具有免疫标识而没有免疫标识的动物，不得离开饲养地，养殖户和养殖单位养殖的动物不但要接受免疫，而且在免疫后必须佩戴耳标，未佩戴耳标的生猪等动物不得进入流通屠宰环节，违反规定的应当承担相应的法律责任。本案中刘某不但应当主动给自己饲养的生猪实施免疫，还应当主动配合防治人员给其佩戴耳标。区兽医卫生执法机构依据《动物防疫法》的有关规定对刘某出售无免疫标识生猪的违法行为进行处罚是有法律依据的。
畜牧兽医科技信息２００６．０９
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【求助】5重Taqman探针荧光定量PCR的发光基团和淬灭基团
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【求助】5重Taqman探针荧光定量PCR的发光基团和淬灭基团
大家好，如果想做5重Real-time PCR，关于发光基团和淬灭基团应该怎么选择？发光基团选5种不一样的，而淬灭基团选一样的可以吗？
我的实验是同时检测5种不同的菌。
另外，放在一个反应管内，荧光基团各自之间会有什么影响？对结果影响大吗？
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在同一管内做5重定量是需要勇气的！鼓励一下！
对于5通道的机器来说，你的发光基团就要与5个的滤光片对应，分别在这5个滤光片的波长范围内选择标记。淬灭基团主要是接收发射基团的光，所以波长通常要比发光基团长一些，也就是每个染料都有自己相对应的淬灭基团，明白这个之后，你说选5个一样的淬灭基团可以吗？
对于5重反应来说，各荧光基团之间有没有影响？一定会有的，只不过是大还是小的问题，这不仅取决于你选的染料波长，也取决于滤光片的带宽，但可以肯定的是染料选的恰当的话，对最终结果没有影响。
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请教一下，你用的是什么荧光PCR仪器，我也要做多重荧光PCR。
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可以参考下Smile＼
Dye& && &Quencher
FAM& && &BHQ-1/TAMRA
HEX/JOE/VIC/YY&&　　　　BHQ-2
Texas Red/ROX& & BHQ-2
Cy5/Quasar670& & BHQ-2 ( or -3)
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请教一下，你用的是什么荧光PCR仪器，我也要做多重荧光PCR。 我们实验室的是ABI 7500的PCR仪。但不知道有效通道是几条。应该是5条吧。
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请教一下战友，你确定了荧光基团和淬灭基团了吗？
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我用的是罗氏的lightcycler.
我现在只用了一条探针摸条件，我的探针标记的是FAM和TRAMA。
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This will depend on the type of machine you are using. The most commonly used 5' reporter dye for Real-Time PCR is 6-FAM. This dye works in most RT-PCR machines. As to the quencher, FAM works equally well with the TAMRA dye (for FRET) and the Blackhole Quencher-1 or Iowa Black FQ.
The ABI Real-time PCR machines have filters for FAM, VIC/JOE, NED/TAMRA and ROX. This allows you to use a variety of combinations for multiplexing. These include JOE NHS, HEX, Cy3, TAMRA NHS and Texas Red. Information on the absorption and emission spectra of all dyes offered at IDT can be found at the following link by clicking on the details button of the modification you are interested in.
Additional information about multiplexing using the ABI machines can be found at the Applied Biosystems Website
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勇气可嘉！！！！
特发ABI7500检测光谱通道！
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谢谢各位！师兄说不可能做出来，而且好像我们那个仪器只能用4个通道。我准备做3条。这3条要得到理想的结果师兄说都很难！唉，刚看一个月资料，什么也不会呢，惭愧惭愧！看来这个实验并不想我想象的那么容易。尽力而为吧！！宝日医生物技术(北京)有限公司
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Q-1：荧光定量PCR（Real Time PCR）基础知识?
技术原理：
实时荧光定量PCR，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real Time PCR，按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。Ct值与起始模板数的对数值之间存在线性关系，可以制作标准曲线。未知浓度的样品也得到Ct值，代入标准曲线，就可以求出未知样品的起始模板量。
Real Time PCR的定量原理图
应用进展：
Real Time PCR是具有划时代意义的技术，具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，不仅应用于基因表达解析，还广泛应用于SNP分型解析、物种鉴定、病毒和病原菌的检测、转基因食品的定量分析、导入基因拷贝数的解析等诸多领域。
阈值（threshold）： 在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限。
Ct值（Cycle threshold）： 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
经数学理论证明，Ct值与起始模板数的对数值成反比线性关系。
阈值和Ct值的相互关系图
决定系数（r Squared）
反映标准曲线的直线性，理想值应大于0.98，越接近于1说明直线性越好，定量越准确。
斜率（slope）
反映PCR扩增效率，-0.25～-0.33（根据不同装置数值不同）。
扩增效率（E）
理想扩增效率应在0.8﹤E﹤1.2。
标准曲线的评价指标图例
Q-2：荧光定量检测方法如何选择?
A-2：必须根据具体的实验用途进行选择。如果用于区别同源性高的序列以及进行SNP分型解析等多重PCR检测，荧光探针法无可替代，而进行除此之外的Real Time PCR实验，我们推荐使用简单易行、成本低的SYBR Green I荧光嵌合法。可以参考如下信息：
SYBR Green I嵌合荧光法
&简单易行，成本较低，无需合成特异性探针。
&特异性强，能进行多重PCR。
&对扩增的特异性要求高；不能进行多重PCR。
&需要设计特异性探针，成本较高；有时探针设计困难。
Q-3：探针法进行荧光定量，探针如何选择?
A-3：探针法通常是使用5&端带有荧光物质（如：FAM等），3&端带有淬灭物质（如：TAMRA、Eclipse、BHQ等）的探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5&端的荧光物质受到3&端的淬灭物质的制约，不能检出荧光。探针的报告基团的发射波长要在淬灭基团的吸收波长范围内。
淬灭基团种类
淬灭基团性质
使用的报告基团种类
&FAM,HEX,TET,JOE等
非荧光物质
&PCR产物3&端有&A&，TA克隆。
BHQ系列染料
非荧光物质
&FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROX等
非荧光物质
&FAM,HEX,TET,JOE等
非荧光物质
&CY3,TAMRA,ROX,Texas Red,CY5等
非荧光物质
Q-4：Real Time RT-PCR如何选择Two Step RT-PCR和One Step RT-PCR?
A-4：基因表达解析等绝大部分RT-PCR，非常适合选择Two Step RT-PCR，而RNA病毒检测等以基因检测为目的RT-PCR，应优先考虑防止污染，所以建议选择One Step RT-PCR。
1. 进行Two Step RT-PCR反应时，可选择Random Primer、Oligo dT Primer或基因的特异性引物进行反转录反应，然后再将一部分反转录反应液（cDNA）作为模板添加到Real Time PCR反应液中。使用反转录引物时可以根据实验目的选择合适的反转录引物，如果选择Random Primer或Oligo dT Primer，合成的cDNA可用于复数种类基因的检测，cDNA溶液可以稳定地长期保存，供以后解析使用。
2. One Step RT-PCR的反转录反应和PCR反应在同一反应管内连续进行，操作简单，污染几率低。但此时的反转录反应和PCR反应都并非为各自的适宜条件，所以One Step RT-PCR通常比Two Step RT-PCR反应效率低。此外，与Two Step RT-PCR反应相比，反转录酶等的使用量多，每个反应的成本相对较高。One Step RT-PCR反应的反转录反应引物只能使用基因的特异性PCR下游引物，而不能使用Random Primer或Oligo dT Primer共用引物。
Q-5：绝对定量与相对定量有哪些差别?
A-5：绝对定量与相对定量有如下差别：
1. 绝对定量：是对未知样品的绝对量（拷贝数）进行测定的方法；通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。
2. 相对定量：是分别测定目的基因和参比基因的量，再求出对于参比基因的目的基因的相对量，最后再进行样品间相对量的比较。主要用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片、siRNA干扰的实验结果。
Q-6：荧光定量实验的成功因素有哪些?
A-6：荧光定量实验的成功因素如下：
1. 优良试剂的选择。
Real Time PCR试剂的选择是否合适，也是实验成功的关键点，所以在这里有必要对试剂的选择要点加以说明。
a. 标准曲线的质量直接影响定量的准确性。建议使用标准品专用稀释Buffer稀释标准品。
b. 根据采用的荧光检测方法进行试剂选择。选择探针法专用试剂或SYBR Green I法专用试剂。
c. Real Time RT-PCR要根据实验目的进行试剂选择。mRNA表达量分析选择Two Step RT-PCR试剂，病毒病原菌检测选择One Step RT-PCR试剂。
d. Real Time PCR 反应通常样品数量较多，操作步骤过多易产生错误。最好选择PCR反应用Buffer、DNA聚合酶、dNTP等试剂已经预混在一起的2&Premix Type试剂，操作更加简单方便。同时，使用的试剂最好不需要进行Mg2＋浓度的优化等实验。
e. Real Time PCR反应对反应特异性要求高。最好选择应用Hot Start DNA聚合酶的试剂。但有一点需要强调，Hot Start DNA聚合酶有两种类型，即化学修饰型和抗体结合型。使用这两种Hot Start DNA聚合酶的PCR反应条件不同，使用化学修饰型Hot Start DNA聚合酶，需要在PCR条件的最初步骤设置10～15分钟的热变性程序，以恢复DNA聚合酶的活性；而抗体结合型Hot Start DNA聚合酶，不需要长时间的热变性步骤，通常的PCR条件即可恢复DNA聚合酶的活性，最适合快速PCR反应。
f. 所选试剂要与使用的Real Time PCR检测系统相匹配。最好选择对各种机型装置都显示良好反应性能的试剂。
2. 引物和探针的设计。
引物设计原则
&扩增片段大小
&80-150 bp（尽量限制在300 bp以内）
&Primer长度
&17-25 base
&40-60%（最好45-55%）
&两条引物的Tm值尽量接近，引用专用软件计算Tm值
&整体上碱基不能过偏，局部避免GC rich或AT rich（特别是3&端），避免T/C连续，A/G连续
&3&末端序列
&避免GC含量过高，3&末端碱基最好为G或C，尽量避免3&末端碱基为T
&引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列，引物3&末端避免2 base以上的互补序列
&使用BLAST检索，确认引物特异性
&RT-PCR用引物
&尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增
& & 探针设计原则：
&Probe长度
&20-24 base
&探针的Tm比引物高8-10℃
&在目的序列GC含量相对较高的区域设计，整体上碱基不能过偏，局部避免GC rich或AT rich（特别是3&端)，避免T/C连续，A/C连续
&5&末端序列
&探针5&末端的第一个碱基不能是G
&Probe内部或Probe与两条引物之间避免3 base以上的互补序列
&BLAST检索确认Probe特异性
3. 反应条件的优化
依据所使用的产品说明书进行反应条件的优化。
4. 实验操作
必须分区操作。通常分为：反应液调制区；模板添加/样品制备区；PCR反应区。
Q-7：进行Real Time PCR实验时，需要做哪些确认工作?
A-7：进行Real Time PCR首先要确认的工作如下：
1. 引物和探针的序列是否有错误?组合是否正确?
2. Total RNA是否有分解的可能?
3. 各种试剂是否忘记加入?
4. PCR条件和荧光检出步骤是否设定正确?
如果有成功反应经历的模板（Positive Control），设置Positive Control反应，很容易进行以上项目的确认。Total RNA一定要通过电泳和OD分析确认其质量。
Q-8：如何确认模板中是否含有阻害物质?
A-8：有时Total RNA或cDNA中含有对反转录反应和PCR反应的阻害物质（如RNA提取时使用的有机溶剂等）。为了确认这样的阻害物质的有无，使用较高浓度的模板按3～4个梯度稀释，并使用其进行Real Time RT-PCR反应或Real Time PCR反应。如果无阻害物质存在，得到的Ct值会依存模板浓度的变化而变化；如果有阻害物质存在，就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。
Q-9：扩增曲线的荧光信号值低的原因是什么?
A-9：扩增曲线存在问题时，首先应确认基线校正或ROX校正前的原始曲线，扩增曲线的荧光信号值低多数是由于背景荧光信号值过高造成的。如下图所示，A的原始扩增曲线背景荧光信号值约为280，其基线校正后的扩增曲线显示较高的荧光信号值（约500）；而B的原始扩增曲线背景荧光信号值可达800，其基线校正后的扩增曲线荧光信号值较低（约150）。使用SYBR Green I嵌合荧光法进行检测时，背景荧光信号偏高大多数是由于模板量过高，SYBR Green I嵌入到初始模板DNA中发出荧光造成的。使用荧光探针法进行检测时，背景荧光信号偏高大多是由于设计的探针质量差使淬灭基团的淬灭作用不充分、报告基团和淬灭基团的搭配不合理、探针的荧光标记效率低等原因造成的。
& 背景荧光信号值确认图例
Q-10：出现扩增曲线朝右下方下落现象的原因是什么?
出现这种现象一般有两种可能，如下图所示。
1. 由于基线校正不恰当。确认设置的基线校正范围的参数，按仪器说明书要求重新设定再进行解析。
2. 使用的模板量过多，扩增曲线过早起峰，使基线校正不能正常进行。当扩增曲线在10 Cycles以内起峰时，要将模板稀释100～1000倍后使用。
扩增曲线朝右下方下落的解决图例
Q-11：PCR扩增效率低的原因有哪些?
A-11：由标准曲线的斜率计算得到的PCR扩增效率低时，可以考虑以下几点原因。
1. PCR反应性能差。引物、试剂、PCR条件的再摸索。
2. PCR阻害物质的混入。模板提取方法的再摸索。
3. 标准品稀释不准确。使用专用标准品稀释Buffer。
稀释的低浓度标准品常常有易分解不稳定的现象产生，所以使用的稀释液中最好加入与实验材料不同生物种的tRNA和rRNA以起保护作用。但偶尔也有因加入的tRNA和rRNA的序列与目的基因序列具有同源性而产生的干扰现象。如果使用不含tRNA和rRNA的标准品稀释专用试剂EASY Dilution（for Real Time PCR）（Code No. 9160），将不会有这方面的顾虑。
Q-12：PCR扩增效率过高的原因是什么?
A-12：PCR扩增效率比理论值偏高，大多是由于反应体系中含有PCR阻害物质，需要改进模板提取方法。另外，使用SYBR Green I嵌合荧光法检测时，有时非特异性扩增也会导致PCR扩增效率高，要通过融解曲线分析加以确认。
Q-13：融解曲线分析有复数峰产生的原因有哪些?
A-13：首先怀疑发生了目的片段以外的扩增。
1. 引物二聚体等非特异性扩增。优化PCR条件或再设计引物。
2. 存在目的基因的Variant。获取Variant信息，再设计引物。
3. Genomic DNA来源的扩增。DNase I处理或考虑基因组结构、引物再设计。但也有偶尔例外的情况。那是由于目的序列内部GC含量等的不均一造成同一扩增产物解离稍有偏差，致使虽然为特异性扩增，但融解曲线分析却出现非单一峰型的情况，但此时电泳确认结果却为单一条带（如下图所示）。因此，对初次使用引物的扩增产物有必要进行电泳确认，其目的有两个：①单一峰型时可以确认扩增片段大小，判断是否为目的产物；②非单一峰型时也有必要对扩增产物进行确认，如果电泳结果显示为单一条带，并与目的片段大小吻合，可以判断为进行了特异性扩增。
融解曲线分析特例}