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【pdf】MTT法和CCK8法检测悬浮细胞增殖的比较的用户评论第26卷第3期2009年6月贵州大学学报(自然科；JournalofGuizhouUniversi；Jun.2009；文章编号09)03-00；CCK28法和MTT法检测人前列腺癌PC3细胞活；李宁,万文婷,金林红；(贵州大学精细化工研究开发中心教育部绿色农药与生；摘要:以人前列腺癌PC3细胞作为研究对象,探讨了；CCK28的最佳检测
第26卷第3期2009年　6月贵州大学学报(自然科学版)
JournalofGuizhouUniversity(NaturalSciences)Vol.26No.3
文章编号　09)03-0018-03
CCK28法和MTT法检测人前列腺癌PC3细胞活性的最佳条件比较研究
李　宁,万文婷,金林红
(贵州大学精细化工研究开发中心教育部绿色农药与生物工程重点实验室,贵州贵阳550025)
摘　要:以人前列腺癌PC3细胞作为研究对象,探讨了CCK28法和MTT法的最佳实验条件。
CCK28的最佳检测波长为450nm,最佳检测时间为加入CCK28试剂后4h,适宜细胞数量范围为
8×10-1×10个。在检测抗肿瘤药物阿霉素(ADM)对PC3细胞的增殖影响实验中,发现CCK28法测得数据的线性相关性优于MTT法,并且数据偏差较MTT法小。实验结果表明CCK28法较MTT法检测的灵敏度高,准确性好,是一种优于MTT法的检测细胞增殖活性的方法。关键词:CCK28;MTT;前列腺癌;细胞增殖中图分类号:Q2-33　　文献标识码:A　　检验细胞存活与增殖的方法很多,如同位素释放法、乳酸脱氢酶释放改良法、流式细胞仪法等,自1983年Mosmann建立MTT比色法以来,由于其简单、经济、快速、,、,吸出培养基时往往带出结晶或细胞,对实验结果造成影响。为克服MTT的不足,近年来,出现了另外一
些检测方法如MTS法、WST21法、CellCount2
ingKit28(简称CCK28)法等。CCK28法的检测原理与常规MTT法略有差异,检测条件也不尽相同,试剂经活细胞线粒体脱氢酶转化后形成水溶性结晶,可直接进行比色,实验误差较小。本文对MTT法和CCK28法检测人前列腺癌PC3细胞活性的实验条件进行探讨,并比较两种方法的灵敏度和准确性。
BIO);()。MTT(美国SI)PPH7.4,NaCl.240.14%,KH2PO401,mg/mL;CCK28试剂盒(碧云
);SDS(北京鼎国生物技术发展有限公司)溶解在10mol/L的盐酸中,终浓度为10%;DMSO购自生工生物工程(上海)有限公司;
注射用盐酸阿霉素(Adriamycin,ADM)购自浙江海正药业股份有限公司;10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RPMI1640培养基(美国GIBCO公司)。1.2　方法
1.2.1　最佳检测波长的确定和最佳测定时间的确定
取对数生长期的前列腺癌PC3细胞,以0125%胰酶消化,计数,接种于96孔培养板内,使
每孔细胞密度为1×10个,每组设4个平行孔并设不含细胞的空白对照,37℃培养24h使细胞贴壁。CCK28组每孔加入10μLCCK28试剂,继续培养1-8h,期间分别检测1h、2h、4h和8h时不同波长下的OD值;MTT组吸掉上清液,每孔加入100μL含MTT试剂的培养基,继续培养1-8h,期间分别检测1h、2h、4h和8h时不同波长下的OD值(检测时每孔加入100μL10%的SDS,震荡使甲N晶体溶解)。
1　材料与方法
1.1　材料1.1.1　细胞株
前列腺癌细胞株PC3(购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库)。1.1.2　仪器和试剂
CO2培养箱(日本SANYO);酶标仪(美国
3收稿日期:
基金项目:国家自然科学基金项目()作者简介:李　宁(1982-),男,山东滕州人,硕士研究生,研究方向:抗肿瘤药物筛选和作用机制研究,Email:.3通讯作者:金林红,Email:linhong..
第3期李　宁等:CCK28法和MTT法检测人前列腺癌PC3细胞活性的最佳条件比较研究?19?
1.2.2　细胞数量与吸光度的关系1.3　统计学分析
取对数生长期的前列腺癌PC3细胞,以
0125%胰酶消化,计数,接种于96孔培养板内,每
孔细胞密度从高到低依次为:5×10/个,2.5×443310/个,1.25×10/个,6.3×10/个,3.1×10/个,1.6×10/个,8×10/个,4×10/个,2×10/个,各
实验数据用统计分析以SPSSv13.0软件进
2.1　最佳检测波长的确定
设4个复孔,37℃培养24h后,分别加入CCK28
试剂和MTT溶液,在酶标仪上测量OD值。1.2.3　检测不同浓度的阿霉素(ADM)对前列腺癌细胞株PC3细胞的增殖影响
　　用含10%胎牛血清的RPMI21640培养液配阿霉素(ADM),浓度从低到高依次为:0.04μmol/L,0.08μmol/L,0.16μmol/L,0.31μmol/L,0.63μmol/L,1.25μmol/L,2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L.取对数生长期的前列腺癌PC3细胞,以0.25%胰酶消化,计数,接种于96孔培养板
内,使每孔细胞密度为2×10,37℃培养24h,小心吸掉上清液,每孔加入200μL含ADM的RPMI21640培养基,设对照组和空白组,37℃培养72分别用CCK28试剂和MTT。
如图1所示:CCK28法在450nm波长处检测时
起吸收峰最高,CCK28法最佳检测波长为450nm.由图2可知MTT法最佳检测波长为595nm.2.2　最佳测定时间的确定
从图1和图2可以看出,加入CCK28和MTT后随时间的延长吸光度OD值逐渐增加,2h时已有较明显的显色,4h时吸光度OD值最高,MTT法8h时OD值下降明显,最佳检测时间为加入MTT后4h,而CCK28法在加入CCK28试剂之后8h时OD值下降较小,4-8h期间都是合适的检测时间,样品检测更为方便灵活。2.3　OD值的34
　　从图3可知对于CCK28法,当PC3细胞数量在8×10-5×10时,吸光度OD值随着细胞数的增加而增加。从图4可知对于MTT法,当PC3细胞数量在6.3×10-5×10时,吸光度OD值随着细胞数的增加而增加,有明显的正相关关系。从而得出CCK28法比MTT法检测PC3细胞数量范围较宽。
2.4　阿霉素(ADM)对PC3细胞的增殖影响
用CCK28法和MTT法两种方法检测阿霉素(ADM)对前列腺癌细胞株PC3细胞的增殖影响,结果见表1、表2和图5、图6.
?20?贵州大学学报(自然科学版)
表1　CCK28法检测阿霉素(ADM)对
PC3细胞的生长抑制作用
表2　MTT法检测阿霉素(ADM)对
PC3细胞的生长抑制作用
μmol?L-1化合物浓度/
0.080.160.31
OD值0.10.20.9
抑制率/%21.6±3.0
5.6±3.230.9±3.......733
μmol?L-1化合物浓度/
0.310.621.252.505.0010.00
OD值0.00.20.3
抑制率/%5.2±6.05
10.3±8........733
阿霉素0.621.252.505.0010.00
对照组0.956
注:33代表P&0.01与对照组比较对照组0.426注:33代表P&0.01
与对照组比较
28(ADM)对　　　　　　　　图6　MTT法检测阿霉素(ADM)对
细胞的生长抑制作用曲线
PC3细胞的生长抑制作用曲线
　　从表1、表2和图5、图6的数据可以得知,
CCK28法在检测药物阿霉素(ADM)的浓度梯度时,检测结果的线性相关性优于MTT法,说明CCK28法灵敏度较MTT法高。当低浓度阿霉素(ADM)对PC3细胞抑制率较低时,CCK28法测得的数据偏差较MTT法测得的偏差小,因此CCK28法比MTT法更准确。
MTT法由于其简单、经济、快速、无放射性污
最佳检测波长是595nm,最佳检测时间为4h后,
细胞数量低于6.3×10个时检测效果较差。在检测抗肿瘤药物阿霉素(ADM)对PC3细胞的增殖影响实验中,发现CCK28法测得数据线性相关性优于MTT法,并且数据偏差较MTT法小。
综上所述,CCK28法与MTT法比较可知,CCK28法操作简便,灵敏度高,准确性和重复性好,是一种优于MTT法的检测细胞增殖活性的方法。参考文献:
[1]MosmannT.Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsur2
vival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassays[J].JImmunolMethods,-2):55-65.
[2]王开颜,房崇芸,彭光洁.氢化可的松诱导特发性血小板减少
染等特点,在检测细胞增殖方面已得到广泛应用。
但MTT的代谢产物甲N为不溶水的结晶物,通常在加入有机溶剂前需吸净全部的培养基,这不仅操作较为麻烦,而且也产生一定的实验误差。而CCK28试剂生成的甲N物具有高度水溶性,不需要使用裂解液溶解沉淀,同时也不需要吸取上清,简便了实验步骤也大大提高了实验的敏感性。
在本实验中,探讨了MTT法和CCK28法最佳实验条件,我们发现CCK28法最佳检测波长是450nm,CCK28法的最佳检测时间为4h后,检测较佳
的细胞数量范围从8×10个到5×10,而MTT法
性紫癜淋巴细胞凋亡和增殖抑制[J].中国组织化学与细胞化学杂志,):149-152.
[3]RassendrenF,BuellG,NewboltA,etal.Identificationofamino
acidresiduescontributingtotheporeofaP2Xreceptor[J].TheEMBOJournal,):.
[4]TominagaH,IshiyamaM,OhsetoF,etal.Awater2solubletetrazoli2
umsaltusefulforcolorimetriccellviabilityassay[J].AnalCom2mun,-50.
(下转第24页)
?24?贵州大学学报(自然科学版)第26卷
DeterminationofMolybdenuminSoilbySealingDigestion
GraphiteFurnaceAtomicAbsorptionSpectrometry
LIZhan2bin,TANHong,XIEFeng,ZOUXiao2nan
(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,GuizhouUniversity,Guiyang.GuizhouPhysicalandChemicalTestingandResearchingCenter,Guiyang550002,China)
Abstract:Thedeterminationoftotalmolybdenuminsoilbysealingdigestiongraphitefurnaceatomicabsorptionspectrometrywasstudiedtoestablishamethodfordeterminationoftotalmolybdenuminsoilbysealingdigestiongraphitefurnaceatomicabsorptionspectrometry.Undertheproposedconditions,thedetectionlimitofmolybde2numwas0.32μg/L,theRSDbetween1.1%.Thesamplerecoverieswereintherangeof92.7%-102.0%.Themethodisrapid,convenient,accurate,sensitiveandsuitablefordeterminationofmolybdenuminsoil.Keywords:atomicfluosoil
(上接第20页)
OptimalExperimentConditi28and
Ling,WANWen2ting,JINLin2hong
(ResearchandDevelopmentCenterofFineChemicals,KeyLaboratoryofGreenPesticide&
Bioengineering,MinistryofEducation,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China)
Abstract:TheoptimalexperimentconditionsofCCK28andMTTinPC3cellproliferationassayswereinvestiga2ted.ForCCK28assay,thebestconditionis:450nmfordetectingwavelength,detectedat4haftertreatment,thenumberofPC3cellsisaround8×10-1×10.TheantiproliferationactionofADMonPC3weretestedbyCCK28andMTT.ItwasfoundthattheresultofCCK28methodhasbetterlinearcorrelationfact,smallerdevia2tion,highersensitivityandaccuracy.TheconclusionisthatCCK28methodissuperiortoMTTmethodincellproliferationassays.
Keywords:CCK28;MTT;prostatecancerPC3cellproliferation
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